一種多花黑麥草粗蛋白含量的測定方法與流程

本發明涉及牧草營養品質評價領域，具體涉及一種多花黑麥草粗蛋白含量的測定方法。

背景技術：

多花黑麥草(Lolium multiflorum Lam.)為禾本科黑麥草屬一年生或越年生牧草，適于生長在氣候溫暖濕潤地區，是具世界栽培意義的優良牧草之一，在我國南方多省(市)均有較大面積的栽培。近年來，隨著國家農業產業結構的調整，草食畜牧業快速發展，多花黑麥草因其產量高、冬春季生長旺盛、適應性強、營養價值豐富等優點，解決了我國南方冬春季家畜飼草不足的問題，在我國南方地區糧草輪作中發揮了極其重要的作用，尤其是草產量高、營養品質好的優良多花黑麥草品種對畜牧業生產尤為重要。在多花黑麥草育種工作中，不僅要培育產量高的品種，同時還要兼顧牧草的品質。

粗蛋白(Crude Protein，CP)是食品、飼料中含氮化合物的總稱，既包括真蛋白又包括非蛋白含氮化合物，后者又可能包括游離氨基酸、嘌呤、吡啶、尿素、硝酸鹽和氨等。牧草中CP的含量是影響牧草營養品質的重要因素，CP含量高，表明牧草的營養價值高，因此研究CP在多花黑麥草中含量的動態變化對于飼草生產、育種具有重要指導意義。目前國內對于牧草CP測定主要以傳統濕化學方法為主，存在操作復雜、誤差較大、成本高、耗時長、有毒有害化學藥品污染環境等突出問題，難以從大量的多花黑麥草品種(系)或樣品中篩選出CP含量高的品種(系)或樣品，因此找出一種能夠快速測定多花黑麥草中CP含量的方法，對多花黑麥草育種和牧草品質控制具有重要的意義。

技術實現要素：

本發明所要解決的技術問題是提供一種能夠快速測定多花黑麥草粗蛋白含量的多花黑麥草粗蛋白含量的測定方法。

本發明解決其技術問題所采用的技術方案為：該多花黑麥草粗蛋白含量的測定方法，包括以下步驟：

A、建立多花黑麥草粗蛋白含量近紅外預測模型；所述多花黑麥草粗蛋白含量近紅外預測模型采用如下方法建立，具體包括如下步驟：

a、采集多花黑麥草樣品，所述多花黑麥草樣品包括不同品種、不同品系、不同生育期、不同栽培方式和不同部位的鮮草樣品，分別將上述采集的多花黑麥草樣品進行預處理，所述預處理的方法如下所述：將采集的多花黑麥草樣品先在105℃的環境中殺青20min，然后在65℃的環境中烘干后，在微型粉碎機中粉碎成粉末并過40目篩得到多花黑麥草樣品粉末；

b、將步驟a得到的多花黑麥草樣品粉末分別進行近紅外光譜采集得到每個多花黑麥草樣品粉末的近紅外原始光譜圖；

c、采用PCA算法對所有多花黑麥草樣品粉末的近紅外原始光譜進行分析，剔除具有相似光譜的多花黑麥草樣品，剩余的多花黑麥草樣品為代表性多花黑麥草樣品；

d、采用凱氏定氮法對步驟c得到的代表性多花黑麥草樣品逐個進行粗蛋白含量進行測定得到每個代表性多花黑麥草樣品粗蛋白含量值；

e、依據代表性多花黑麥草樣品粗蛋白含量值將代表性多花黑麥草樣品分為校正集和驗證集兩部分，具體方法如下：首先將得到的代表性多花黑麥草粗蛋白含量值從小到大進行排序，然后每隔3個取1個作為驗證集，其余作為校正集，并且調整代表性多花黑麥草中粗蛋白含量的最小值和最大值，使之劃歸為校正集；

f、將校正集樣品的近紅外光譜圖和校正集樣品的粗蛋白含量值的導入OPUS/QUENT 5.5商用光譜定量分析軟件中，首先，在全譜范圍內對校正集樣品的近紅外光譜進行預處理，接著采用偏最小二乘回歸法結合交互驗證對校正集樣品建立預測校正模型，根據近紅外定量校正模型的參數對預測校正模型進行評價，對預測校正模型進行評價的近紅外定量校正模型參數包括決定系數R²、交互驗證決定系數R²cv、交互驗證均方根誤差RMSECV，其決定系數R²為99.33％、交互驗證決定系數R²_cv為98.64％，交互驗證均方根誤差RMSECV為0.678，確定最佳光譜預處理為一階導數+MSC(多元散射校正)，最佳建模光譜區為6101.9～4246.7cm^-1，最佳因子數為10，在評價過程中根據馬氏距離、主因素分析圖、光譜殘差圖以及化學分析值殘差圖結果剔除異常的多花黑麥草校正集樣品，從而得到最佳的多花黑麥草粗蛋白含量最佳近紅外預測校正模型；接著，將驗證集樣品的近紅外光譜和驗證集樣品的粗蛋白含量導入建立的預測校正模型中進行分析驗證得到預測驗證模型；接著，利用近紅外定量驗證模型的參數對所得的預測驗證模型進行評價，對預測驗證模型進行評價的近紅外定量驗證模型的參數包括外部驗證決定系數R²ev和驗證均方根誤差RMSEP，其外部驗證決定系數R²ev為98.75％，驗證均方根誤差RMSEP為0.572，在評價過程中根據馬氏距離、主因素分析圖、光譜殘差圖以及化學分析值殘差圖結果剔除異常的多花黑麥草驗證集樣品，從而得到最佳多花黑麥草粗蛋白含量近紅外預測模型；

B、將待測的多花黑麥草樣品按照步驟a所述的預處理方法處理后得到待測多花黑麥草樣品粉末；

C、將步驟B得到的待測多花黑麥草樣品粉末進行近紅外光譜采集得到待測多花黑麥草樣品粉末的近紅外原始光譜圖；

D、將待測多花黑麥草樣品粉末的近紅外原始光譜圖和步驟f中得到的多花黑麥草粗蛋白含量近紅外預測模型導入到OPUS/QUENT 5.5商用光譜定量分析軟件中，通過模型運算分析，即可得到待測多花黑麥草樣品中粗蛋白的含量。

進一步的是，所述多花黑麥草的生育期包括分蘗期、拔節期、孕穗期、抽穗期、開花期、結實期、成熟期。

進一步的是，所述多花黑麥草的栽培方式包括撒播栽培方式、育苗移栽栽培方式、施用氮肥栽培方式。

進一步的是，所述多花黑麥草的采集部位包括莖、葉、全株。

進一步的是，在步驟b中，采用如下所述的方法對多花黑麥草樣品粉末分別進行近紅外光譜采集，具體的，取適量多花黑麥草樣品粉末，放入Bruker MPA型傅里葉變換NIRS儀樣品杯中，使樣品自然攤平，設定儀器工作參數，在溫度為25±0.5℃條件下采集樣品近紅外光譜，得到該樣品的第一次近紅外光譜值，接著，將樣品杯中的樣品取出后再放入樣品杯中，使樣品自然攤平，再次采集樣品近紅外光譜，得到該樣品的第二次近紅外光譜值，然后對第一次近紅外光譜值和第二次近紅外光譜值進行平均，得到該多花黑麥草樣品的近紅外原始光譜圖。

進一步的是，所述Bruker MPA型傅里葉變換NIRS儀器工作參數設定為：譜區范圍4000～12500cm^-1，分辨率8cm^-1，掃描次數64次。

進一步的是，采用OPUS/QUENT 5.5商用光譜定量分析軟件對第一次近紅外光譜值和第二次近紅外光譜值進行平均，得到多花黑麥草樣品的近紅外原始光譜圖。

進一步的是，在步驟d中，采用凱氏定氮法的代表性多花黑麥草樣品逐個進行粗蛋白含量進行測定得到每個代表性多花黑麥草樣品粗蛋白含量值；

進一步的是，在步驟f中，在全譜范圍內對校正集樣品的近紅外光譜采用一階導數、二階導數、減去一條直線、一階導數+MSC(多元散射校正)、一階導數+減去一條直線、一階導數+矢量歸一化、沒有光譜預處理、最小-最大歸一化、矢量歸一化、消除常量偏移量和多元散射校正11種光譜預處理方法。

本發明的有益效果在于：本發明所述的多花黑麥草粗蛋白含量的測定方法提供了一種基于近紅外光譜技術的多花黑麥草中粗蛋白真實含量的預測模型，在已知大量樣品真實含量的基礎上，采集樣品的近紅外原始光譜，建立基于近紅外光譜技術和化學計量學方法的多花黑麥草粗蛋白含量的定量分析預測模型，接著，只需要將待測的多花黑麥草樣品經過預處理后得到待測多花黑麥草樣品粉末；并采集其近紅外原始光譜圖，光譜采集過程時間短，在采集近紅外光譜后就可以進行檢測，除前期建立預測模型外，整個近紅外檢測過程僅需短短的幾分鐘，具有操作簡單、檢測迅速、檢測效率高的特點，而且該方法是在在已知大量樣品真實含量的基礎上，采集樣品的近紅外原始光譜，建立基于近紅外光譜技術和化學計量學方法的多花黑麥草粗蛋白含量的定量分析預測模型，其檢測精度非常高，此外，本發明的檢測方法不需要加入任何有機試劑，不會損害檢測人員的健康，更不會因使用化學試劑導致環境污染等問題，更加安全環保，對于多花黑麥草生產和育種工作具有極為重要的意義。

附圖說明

圖1是實施例中所述404份多花黑麥草樣品的近紅外光譜圖；

圖2是實施例中所述123份代表性多花黑麥草樣品的近紅外光譜圖；

圖3是實施例中校正集樣品的近紅外光譜在最佳預處理方式一階導數+MSC(多元散射校正)進行預處理后最佳建模譜區的近紅外光譜圖；

圖4是實施例中交叉驗證均方根誤差RMSECV、交互驗證決定系數R²_cv隨著主成份維數的變化圖；

圖5是實施例中驗證集樣品粗蛋白含量化學值與近紅外光譜預測值之間的相關性圖。

具體實施方式

下面結合實施例對本發明作進一步的說明。

該多花黑麥草粗蛋白含量的測定方法，包括以下步驟：

A、建立多花黑麥草粗蛋白含量近紅外預測模型；所述多花黑麥草粗蛋白含量近紅外預測模型采用如下方法建立，具體包括如下步驟：

a、采集多花黑麥草樣品，所述多花黑麥草樣品包括不同品種、不同品系、不同生育期、不同栽培方式和不同部位的鮮草樣品，分別將上述采集的多花黑麥草樣品進行預處理，所述預處理的方法如下所述：將采集的多花黑麥草樣品先在105℃的環境中殺青20min，然后在65℃的環境中烘干后，在微型粉碎機中粉碎成粉末并過40目篩得到多花黑麥草樣品粉末；

b、將步驟a得到的多花黑麥草樣品粉末分別進行近紅外光譜采集得到每個多花黑麥草樣品粉末的近紅外原始光譜圖；

c、采用PCA算法對所有多花黑麥草樣品粉末的近紅外原始光譜進行分析，剔除具有相似光譜的多花黑麥草樣品，剩余的多花黑麥草樣品為代表性多花黑麥草樣品；

d、采用凱氏定氮法對步驟c得到的代表性多花黑麥草樣品逐個進行粗蛋白含量進行測定得到每個代表性多花黑麥草樣品粗蛋白含量值；

e、依據代表性多花黑麥草樣品粗蛋白含量值將代表性多花黑麥草樣品分為校正集和驗證集兩部分，具體方法如下：首先將得到的代表性多花黑麥草粗蛋白含量值從小到大進行排序，然后每隔3個取1個作為驗證集，其余作為校正集，并且調整代表性多花黑麥草中粗蛋白含量的最小值和最大值，使之劃歸為校正集；

f、將校正集樣品的近紅外光譜圖和校正集樣品的粗蛋白含量值的導入OPUS/QUENT 5.5商用光譜定量分析軟件中，首先，在全譜范圍內對校正集樣品的近紅外光譜進行預處理，接著采用偏最小二乘回歸法結合交互驗證對校正集樣品建立預測校正模型，根據近紅外定量校正模型的參數對預測校正模型進行評價，對預測校正模型進行評價的近紅外定量校正模型參數包括決定系數R²、交互驗證決定系數R²cv、交互驗證均方根誤差RMSECV，其決定系數R²為99.33％、交互驗證決定系數R²_cv為98.64％，交互驗證均方根誤差RMSECV為0.678，確定最佳光譜預處理為一階導數+MSC(多元散射校正)，最佳建模光譜區為6101.9～4246.7cm^-1，最佳因子數為10，在評價過程中根據馬氏距離、主因素分析圖、光譜殘差圖以及化學分析值殘差圖結果剔除異常的多花黑麥草校正集樣品，從而得到最佳的多花黑麥草粗蛋白含量最佳近紅外預測校正模型；接著，將驗證集樣品的近紅外光譜和驗證集樣品的粗蛋白含量導入建立的預測校正模型中進行分析驗證得到預測驗證模型；接著，利用近紅外定量驗證模型的參數對所得的預測驗證模型進行評價，對預測驗證模型進行評價的近紅外定量驗證模型的參數包括外部驗證決定系數R²ev和驗證均方根誤差RMSEP，其外部驗證決定系數R²ev為98.75％，驗證均方根誤差RMSEP為0.572，在評價過程中根據馬氏距離、主因素分析圖、光譜殘差圖以及化學分析值殘差圖結果剔除異常的多花黑麥草驗證集樣品，從而得到最佳多花黑麥草粗蛋白含量近紅外預測模型；

B、將待測的多花黑麥草樣品按照步驟a所述的預處理方法處理后得到待測多花黑麥草樣品粉末；

C、將步驟B得到的待測多花黑麥草樣品粉末進行近紅外光譜采集得到待測多花黑麥草樣品粉末的近紅外原始光譜圖；

D、將待測多花黑麥草樣品粉末的近紅外原始光譜圖和步驟f中得到的多花黑麥草粗蛋白含量近紅外預測模型導入到OPUS/QUENT 5.5商用光譜定量分析軟件中，通過模型運算分析，即可得到待測多花黑麥草樣品中粗蛋白的含量。

本發明所述的多花黑麥草粗蛋白含量的測定方法提供了一種基于近紅外光譜技術的多花黑麥草中粗蛋白真實含量的預測模型，在已知大量樣品真實含量的基礎上，采集樣品的近紅外原始光譜，建立基于近紅外光譜技術和化學計量學方法的多花黑麥草粗蛋白含量的定量分析預測模型，接著，只需要將待測的多花黑麥草樣品經過預處理后得到待測多花黑麥草樣品粉末；并采集其近紅外原始光譜圖，光譜采集過程時間短，在采集近紅外光譜后就可以進行檢測，除前期建立預測模型外，整個近紅外檢測過程僅需短短的幾分鐘，具有操作簡單、檢測迅速、檢測效率高的特點，而且該方法是在在已知大量樣品真實含量的基礎上，采集樣品的近紅外原始光譜，建立基于近紅外光譜技術和化學計量學方法的多花黑麥草粗蛋白含量的定量分析預測模型，其檢測精度非常高，此外，本發明的檢測方法不需要加入任何有機試劑，不會損害檢測人員的健康，更不會因使用化學試劑導致環境污染等問題，更加安全環保，對于多花黑麥草生產和育種工作具有極為重要的意義。

預測模型的檢測精度與采集樣品的種類有直接的關系，為了進一步增加預測模型的檢測精度，需采集不同生育期的多花黑麥草樣品，所述多花黑麥草的生育期包括分蘗期、拔節期、孕穗期、抽穗期、開花期、結實期、成熟期。

進一步的是，預測模型的檢測精度與采集樣品的種類有直接的關系，為了進一步增加預測模型的檢測精度，需采集不同栽培方式的多花黑麥草樣品，所述多花黑麥草的栽培方式包括撒播栽培方式、育苗移栽栽培方式、施用氮肥栽培方式。

進一步的是，預測模型的檢測精度與采集樣品的種類有直接的關系，為了進一步增加預測模型的檢測精度，需采集不同部位的多花黑麥草樣品，所述多花黑麥草的采集部位包括莖、葉、全株。

為了使得到的多花黑麥草樣品的近紅外原始光譜圖更加準確真實，在步驟b中，采用如下所述的方法對多花黑麥草樣品粉末分別進行近紅外光譜采集，具體的，取適量多花黑麥草樣品粉末，放入Bruker MPA型傅里葉變換NIRS儀樣品杯中，使樣品自然攤平，設定儀器工作參數，采集樣品近紅外光譜，得到該樣品的第一次近紅外光譜值，接著，將樣品杯中的樣品取出后再放入樣品杯中，使樣品自然攤平，再次采集樣品近紅外光譜，得到該樣品的第二次近紅外光譜值，然后對第一次近紅外光譜值和第二次近紅外光譜值進行平均，得到該多花黑麥草樣品的近紅外原始光譜圖。

進一步的是，所述Bruker MPA型傅里葉變換NIRS儀器工作參數設定為：譜區范圍4000～12500cm^-1，分辨率8cm^-1，掃描次數64次。

為了方便操作，采用OPUS/QUENT 5.5商用光譜定量分析軟件對第一次近紅外光譜值和第二次近紅外光譜值進行平均，得到多花黑麥草樣品的近紅外原始光譜圖。

進一步的是，在步驟d中，采用凱氏定氮法的代表性多花黑麥草樣品逐個進行粗蛋白含量進行測定得到每個代表性多花黑麥草樣品粗蛋白含量值；

進一步的是，在步驟f中，在全譜范圍內對校正集樣品的近紅外光譜采用一階導數、二階導數、減去一條直線、一階導數+MSC(多元散射校正)、一階導數+減去一條直線、一階導數+矢量歸一化、沒有光譜預處理、最小-最大歸一化、矢量歸一化、消除常量偏移量和多元散射校正11種光譜預處理方法。

實施例

A、建立多花黑麥草粗蛋白含量近紅外預測模型；所述多花黑麥草粗蛋白含量近紅外預測模型采用如下方法建立，具體包括如下步驟：

a、采集多花黑麥草樣品，所述多花黑麥草樣品為2015-2016年采集的多花黑麥草樣品，包括16個國審品種，22個新品系，采集生育期包括分蘗期、拔節期、孕穗期、抽穗期、開花期、結實期、成熟期七個生育期，采集部位包括莖、葉、全株，采集多花黑麥草的栽培方式包括撒播栽培方式、育苗移栽栽培方式、施用氮肥栽培方式，多花黑麥草樣品一共403份，在105℃殺青20min，65℃烘干后，在微型粉碎機中粉碎成粉末并過40目篩，得到多花黑麥草樣品粉末；

b、將步驟a得到的多花黑麥草樣品粉末分別進行近紅外光譜采集得到每個多花黑麥草樣品粉末的近紅外原始光譜圖；具體的，取適量多花黑麥草樣品粉末，放入Bruker公司生產的MPA型傅里葉變換NIRS儀樣品杯中，使樣品自然攤平，裝載樣品時，盡量保持樣品的裝載量、實密程度和表面平整一致，樣品裝載量為樣品杯容量的一半左右，設定儀器工作參數為譜區范圍4000～12500cm^-1，分辨率8cm^-1，掃描次數64次，以儀器內置參比作為校正采集樣品光譜；在室溫25±0.5℃條件下進行光譜采集，得到該樣品的第一次近紅外光譜值，接著，將樣品杯中的樣品取出后再放入樣品杯中，使樣品自然攤平，再次采集樣品近紅外光譜，得到該樣品的第二次近紅外光譜值，采集兩次是為了減少取樣引起的光譜漂移，然后采用OPUS/QUENT 5.5商用光譜定量分析軟件對第一次近紅外光譜值和第二次近紅外光譜值進行平均，得到多花黑麥草樣品的近紅外原始光譜圖，樣品原始光譜圖如圖1所示；

c、將步驟b中得到的原始光譜圖導入德國Bruker公司的OPUS/QUENT 5.5商用光譜定量分析軟件中，采用PCA算法對所有多花黑麥草樣品粉末的近紅外原始光譜進行分析，剔除具有相似光譜的多花黑麥草樣品，剩余123份多花黑麥草樣品為代表性多花黑麥草樣品，其樣品原始光譜圖如圖2所示；

d、采用凱氏定氮法對步驟c得到的代表性多花黑麥草樣品逐個進行粗蛋白含量進行測定得到每個代表性多花黑麥草樣品粗蛋白含量值；

所述的凱氏定氮法(GB/T 6432-1994)為：利用FOSS公司的Kjeltec 8400型全自動凱氏定氮儀進行粗蛋白測定，其步驟如下：樣品測定稱取0.1～1g樣品粉末，精確至0.0001g。打開FOSS Tecator消化爐，預熱是溫度達到420℃；將稱好的樣品置于消化管中(注意不要粘附在管壁上，以免消化不完全)，加入2粒高效凱氏定氮催化劑片和12mL硫酸(H₂SO₄)，輕輕搖動消化管，使樣品被硫酸濕潤，將消化管置于已經預熱至420℃的FOSS Tecator消化爐上，同時將抽氣泵打開到最大，5min后，關小抽氣泵至酸霧剛好充滿排廢罩，在消化管中形成冷凝環。約90min后樣品消化至透明藍綠色液體，取出消化管冷卻至室溫。將消化管放入Foss Kjeltec 8400型全自動凱氏定氮儀，按照凱氏定氮儀Kjeltec 8400的要求裝好40％氫氧化鈉(NaOH)溶液、硼酸(H₃BO₃)吸收液(1％硼酸水溶液1000mL，加入0.1％溴甲酚綠乙醇溶液10mL，0.1％甲基紅乙醇溶液7mL，4％氫氧化鈉水溶液0.5mL)、0.1mol/L鹽酸(HCL)標準滴定液和冷卻水，根據儀器本身常量程序進行蒸餾和滴定，待分析結束后，用記錄所消耗的鹽酸標準滴定液的體積。空白測定以0.5g蔗糖代替樣品進行上述試驗。按照公式——粗蛋白(％)＝(V₂-V₁)×C×0.0140×K×100÷W計算粗蛋白含量；其中V₂為滴定樣品時消耗鹽酸標準溶液的體積(mL)；V₁為滴定空白時消耗鹽酸標準溶液的體積(mL)；C為滴定時所使用的鹽酸標準溶液濃度為0.1mol/L；K為氮換算成蛋白質的平均系數為6.25；W為樣品質量；

e、依據代表性多花黑麥草樣品粗蛋白含量值將代表性多花黑麥草樣品分為校正集和驗證集兩部分，具體方法如下：首先將得到的代表性多花黑麥草粗蛋白含量值從小到大進行排序，然后每隔3個取1個作為驗證集，其余作為校正集；即具有代表性的123份多花黑麥草樣品中，有93份作為校正集，30份作為驗證集，并且調整多花黑麥草中粗蛋白含量的最小值和最大值，使之劃歸為校正集。

f、將校正集樣品的近紅外光譜圖和校正集樣品的粗蛋白含量值的導入OPUS/QUENT 5.5商用光譜定量分析軟件中，首先，在全譜范圍內對校正集樣品的近紅外光譜進行預處理，在全譜范圍內對校正集樣品的近紅外光譜采用一階導數、二階導數、減去一條直線、一階導數+MSC(多元散射校正)、一階導數+減去一條直線、一階導數+矢量歸一化、沒有光譜預處理、最小-最大歸一化、矢量歸一化、消除常量偏移量和多元散射校正11種光譜預處理方法，接著采用偏最小二乘回歸法結合交互驗證對校正集樣品建立預測校正模型，根據近紅外定量校正模型的參數對預測校正模型進行評價，確定最佳光譜預處理方法，主成份因子數和最佳建模光譜區，最終以預測校正模型的交互驗證均方根誤差RMSECV的最小值對應最佳光譜預處理方法、最佳建模光譜區和最佳主成份因子數，圖3是校正集樣品的近紅外光譜在最佳預處理方式一階導數+MSC進行預處理后最佳建模譜區的近紅外光譜圖；表1是不同光譜預處理方法下最佳建模譜區和模型參數，由表1所述，最終確定的最佳光譜預處理為一階導數+MSC，最佳建模光譜區為6101.9～4246.7cm^-1，最佳因子數為10；在評價過程中根據馬氏距離、主因素分析圖、光譜殘差圖以及化學分析值殘差圖等結果剔除異常的多花黑麥草校正集樣品，從而得到最佳的多花黑麥草粗蛋白含量最佳近紅外預測校正模型，對預測校正模型進行評價的近紅外定量校正模型參數包括決定系數R²、交互驗證決定系數R²cv、交互驗證均方根誤差RMSECV；接著，采用驗證集樣品對預測校正模型進行外部驗證，所述的外部驗證的具體方法是利用預測校正模型對驗證集光譜進行預測，即在德國Bruker公司的OPUS/QUENT 5.5商用光譜定量分析軟件中選擇建立定量2方法，將驗證集樣品的近紅外光譜和驗證集樣品的粗蛋白含量導入建立的預測校正模型中進行分析驗證得到預測驗證模型；接著，利用近紅外定量驗證模型的參數對所得的預測驗證模型進行評價，在評價過程中根據馬氏距離、主因素分析圖、光譜殘差圖以及化學分析值殘差圖等結果剔除異常的多花黑麥草驗證集樣品，從而得到最佳多花黑麥草粗蛋白含量近紅外預測模型；對預測驗證模型進行評價的近紅外定量驗證模型參數包括外部驗證決定系數R²ev和驗證均方根誤差RMSEP。即預測校正模型有較高的決定系數R²、交互驗證決定系數R²cv和較低的RMSECV，預測驗證模型有較高的外部驗證決定系數R²ev和較低的RMSEP值時，所述近紅外預測模型適用于多花黑麥草粗蛋白含量的測定；圖4是交叉驗證均方根誤差RMSECV、交互驗證決定系數R²cv隨著主成份維數的變化圖，圖5是驗證集樣品粗蛋白含量化學值與近紅外光譜預測值之間的相關性圖；通過優化評價，所述的最優的多花黑麥草粗蛋白含量的預測模型，其決定系數R²為99.33％、交互驗證決定系數R²_cv為98.64％、外部驗證決定系數R²_ev為98.75％、RMSECV為0.678和RMSEP為0.572；所述預測校正模型沒有剔除異常樣品，即校正集樣品為93個；所述的預測驗證模型剔除了兩個異常樣品，即驗證集中用于驗證的有28個樣品；

表1

B、將待測的多花黑麥草樣品按照步驟a所述的預處理方法處理后得到待測多花黑麥草樣品粉末；

C、將步驟B得到的待測多花黑麥草樣品粉末進行近紅外光譜采集得到待測多花黑麥草樣品粉末的近紅外原始光譜圖；

D、將待測多花黑麥草樣品粉末的近紅外原始光譜圖和步驟f中得到的多花黑麥草粗蛋白含量近紅外預測模型導入到OPUS/QUENT 5.5商用光譜定量分析軟件中，通過模型運算分析，即可得到待測多花黑麥草樣品中粗蛋白的含量。

下表為待測的48份多花黑麥草樣品采用上述方法測得的粗蛋白的含量值；

由上表可知，采用本發明所述的多花黑麥草粗蛋白含量的測定方法測定的多花黑麥草粗蛋白含量的測定值與其真實值非常接近，其檢測精度非常高。

以上所述的實施例僅僅是對本發明的優選實施方式進行描述，并非對本發明的范圍進行限定。任何熟悉本領域的技術人員，在不脫離本發明的精神實質和技術方案的情況下，都可以利用上述的方法和技術內容對本發明技術方案做出許多可能的變動和修飾。因此，凡是未脫離本發明技術方案的內容，依據本發明的技術實質對以上實施例所做的變動和修飾，均屬于本發明技術方案保護的范圍內。