基于聚腺嘌呤?亞甲基藍電化學傳感器檢測銅離子的方法與流程
本發明涉及一種基于聚腺嘌呤-亞甲基藍的電化學傳感器檢測銅離子的方法，屬于分析化學領域。
背景技術：
Cu（Ⅱ）是人體生命健康所必需的過渡元素，與某些蛋白質在一起，可產生大量對生命至關重要的酶。銅離子也是所有已知的生命形式的微量營養元素，它具有多種功能（Viguier， R. F. H.； Hulme，A. N. ，A sensitized europium complex generated by micromolar concentrations of copper(I): Toward the detection of copper(I) in biology. J. Am. Chem. Soc. 2006，128，11370–11371.），參與骨的形成、細胞呼吸和結締組織發展等。然而，過量的銅離子會對人體的肝臟和神經系統造成傷害，使細胞的自動調節功能受到損傷，造成嚴重的神經變性疾病，如門克斯病，威爾遜病和阿爾茨海默氏病等（Bush，A. I.Metals and neuroscience. Curr. Opin. Chem. Biol. 2000，4，184–191； Kaler，S. G.；Holmes，C. S.；Goldstein，Neonatal diagnosis and treatment of Menkes Disease.N. Engl. J. Med. 2008，358，605–614； Ala，A.；Walker， A. P.； Ashkan， K.，Wilson's disease. M. L. Lancet 2007，369，397–408）。美國環境保護署（EPA） 規定了在飲用水中銅的最大允許濃度為1.3 ppm（約20 μM）(Liu，J. W.；Lu，Y. J.， A DNAzyme catalytic beacon sensor for paramagnetic Cu2+ ions in aqueous solution with high sensitivity and selectivity. Am. Chem. Soc. 2007，129，9838–9839.）。盡管如此，由于農業和工業的廣泛使用，銅污染及其對人類潛在的毒性作用依然是一個挑戰。
目前，Yao Wu 等（Yao Wu；Rebecca Y. Lai，Electrochemical gold(III) sensor with high sensitivity and tunable dynamic range. Analytical Chemistry. 2016，40（8），2227-2233）證明了Au（Ⅲ）能與腺嘌呤A形成A- Au（Ⅲ）-A結構，首次制備了利用DNA進行識別檢測Au（Ⅲ）的簡便快速的電化學傳感器，同時指出腺嘌呤A還可與Cu（Ⅱ）等過渡金屬通過氮原子結合在一起。
當前檢測銅離子的常規技術一般都是基于電感耦合等離子體（ICP）的方法，包括質譜（MS）（Pavla Jungova，Jarmila Navratilova，Substrate-assisted laser desorption inductively-coupled plasma mass spectrometry for determination of copper in myeloid leukemia cells. J. Anal. At. Spectrom. 2010，25，662–668.；S. D. Richardson，Mass spectrometry in environmental sciences. Chem. Rev. 2001，101–211.），原子吸收光譜（Chan， M. S.；Huang，S. D.，Direct determination of cadmium and copper in seawater using a transversely heated graphite furnace atomic absorption spectrometer with Zeeman-effect background corrector. Talanta 2000，51，373–380. ； Lin，T. W.；Huang，S. D.，Direct and simultaneous determination of copper，chromium，aluminum，and manganese in urine with a multielement graphite furnace atomic absorptionspectrometer. Anal. Chem. 2001，73，4319–4325. ；Pourreza，N.；Hoveizavi.，R.，Simultaneous preconcentration of Cu，Fe and Pb as methylthymol blue complexes on naphthalene adsorbent and flame atomic absorption determination. Anal. Chim. Acta 2005，549，124–128. ）和原子發射光譜法等(Becker， J. S.；Matusch，A.； Liu，Y.；Liang，P.；Guo，L.，Nanometer titanium dioxide immobilized on silica gel as sorbent for preconcentration of metal ions prior to their determination by inductively coupled plasma atomic emission spectrometry. Talanta 2005，68，25–30.）。此外，也可采用熒光技術檢測銅離子（Nakorn Niamnont；Nattaporn Kimpitak；Gamolwan Tumcharern；Paitoon Rashatasakhon，Highly sensitive salicylic fluorophore for visual detection of picomole amounts of Cu2+.RSC Adv.2013，3 (3)，25215-25220.；Balamurugan Rathinam；Chih-Chieh Chien；Bo-Cheng Chen； Jui-Hsiang Liu，Fluorogenic and chromogenic detection of Cu2+ and Fe3+ species in aqueous media by rhodamine–triazole conjugate. Tetrahedron.2013，69 (1)，235-241.）。這些技術通常需要繁瑣的過程，使得難以快速檢測銅離子。因此，利用可靠的技術來對銅離子進行快速檢測是非常有必要的。
技術實現要素：
本發明在于提供一種基于聚腺嘌呤-亞甲基藍的電化學傳感器檢測銅離子的方法，該方法以電化學工作站為平臺，能夠簡便、快速地檢測銅離子濃度。
本發明采取的技術方案如下：
一種基于聚腺嘌呤-亞甲基藍的電化學傳感器檢測銅離子的方法，按照以下步驟進行：
（1）金電極（GE, d=2 mm）處理：依次用0.3 μm和0.05 μm的Al2O3拋光粉打磨金電極，用MilliQ純水、無水乙醇和MilliQ純水依次超聲清洗2 min后，在0.5 M H2SO4溶液中用循環伏安法，掃描范圍為0.2 - 1.6 V，以掃速0.1 V /s、0.5 V /s分別掃描20圈，直至得到穩定的循環伏安曲線；
（2）根據文獻Yao Wu；Rebecca Y. Lai；Electrochemical gold(III) sensor with high sensitivity and tunable dynamic range. Analytical Chemistry. 2016，40（8），2227-2233. 中的方法用緩沖液配制1.2 μM的DNA（A12）溶液；緩沖液含5 mM PBS、0.05 M NaCl，pH 7.4；
（3）將5.0 μL步驟（2）中的DNA（A12）滴加在步驟（1）處理好的金電極表面，在4℃反應2 h；
（4）用超純水沖洗步驟（3）中的電極表面，N2吹干，立即浸沒在100.0 μL的2.0 mM巰基己醇（MCH）溶液中于4℃下封閉電極表面2 h；
（5）將上述步驟（4）制備的MCH/A12/GE電極用二次蒸餾水浸泡4 min，N2吹干后倒置，用于下一步檢測；
（6）取20.0 μL MilliQ純水（空白）或20.0 μL Cu2+ 溶液（不同濃度）于電化學檢測緩沖液中，總體積為2.0 mL，將步驟（5）中的電極浸沒于其中20 min；緩沖液含10 mM PBS、2M NaClO4，pH 6.7；
（7）以鉑絲為輔助電極，以銀/氯化銀為參比電極，（6）中的金電極為工作電極，采用交流伏安法進行檢測，記錄空白電流值I0和不同濃度Cu2+溶液的電流值I1；
（8）以已知銅離子濃度為橫坐標，其對應的△I（△I = I0- I1）為縱坐標，繪制曲線，得到銅離子濃度和△I的線性方程，然后根據待測樣品的△I，計算對應的銅離子濃度。
所述銅離子濃度與△I的線性方程為△I/nA = 1.148+ 0.07358 C Cu2+ / μM。
步驟（2）中所述的DNA（A12）的序列為從左到右5’到3’： -HS-(CH 2)6-AAAAAAAAAAAA-(CH2 )6-MB-。
步驟（3）中的DNA（A12）濃度為1.2 μM，加入量為5.0 μL。
上述方法可應用于環境水樣中銅離子濃度的檢測。
本發明具有操作簡便，靈敏度高，選擇性好，成本低等優點。在100 nM-25 μM的濃度范圍內對銅離子的檢測呈現良好的線性響應，檢測限可達到13 nM。
本發明的顯著優點在于：
（1）本發明的一種DNA修飾在金電極表面的方法簡便、快速、反應的時間和溫度容易控制，得到的傳感器較穩定，選擇性較好。
（2）本發明的操作步驟簡便、靈敏、便捷、成本低，而且無污染、無毒害，應用性強。
（3）本發明在識別銅離子的過程中，能快速讀取電化學信號的數值，有利于銅離子快速檢測。
附圖說明
圖1 為本發明對銅離子檢測的響應曲線。（A）在不同銅離子濃度時所對應的信號I1，從低到高分別為(a): 0 μM、 (b): 0.1 μM、 (c): 1.0 μM、(d): 2.0 μM、 (e): 5.0 μM、 (f): 10 μM、 (g): 25 μM；（B）為隨著銅離子濃度的增加（100 nM-25 μM），其△I的變化。
圖2 為本發明對銅離子檢測的選擇性。從左到右為在不同干擾物質中所示的△I信號，從左到右分別為Mn2+、Ni2+、Hg2+、Co2+、Ba2+、Ca2+、Mg2+ 、 Pb2+、Cu2+和8種離子的混合溶液，銅離子的濃度為1.0 μM，所有干擾物質的濃度均為10 μM。
具體實施方式
實施例 1
1、DNA（A12）的配制，具體步驟如下：
A、用緩沖溶液5 mM PBS、0.05 M NaCl (pH 7.4) 溶解DNA（A12），濃度為10 μM。分為六管，將其置于冰箱中冷凍；
所述的DNA（A12）的序列為從左到右5’到3’： -HS-(CH 2)6-AAAAAAAAAAAA-(CH2 )6-MB-；
B、取100 μL 10 μM的A12，加入5.0 μL 10 mM的TCEP（磷酸（2-氯乙基）酯）溶液，于4℃下過夜備用；
C、在使用前用探針固定緩沖液（5 mM PBS、0.05 M NaCl，pH 7.4）稀釋至所需的濃度（1.2 μM），取5.0 μL濃度為1.2 μM的DNA（A12）進行金電極表面的自組裝。
2、修飾有DNA的電化學傳感器的制備與銅離子的檢測，具體步驟如下：
（1）將電極浸泡在100 μL的2.0 mM巰基己醇（MCH）溶液中封閉電極表面2 h，以去除電極表面上的DNA非特異性吸附；
（2）將上述制備的MCH/A12/GE電極用二次蒸餾水浸泡4 min，N2吹干后倒置，用于下一步檢測；
（3）取20.0 μL MilliQ純水（空白）或Cu2+ 溶液（不同濃度）于電化學檢測緩沖液（10 mM PBS、2M NaClO4，pH 6.7 )中，總體積為2.0 mL，將電極浸沒于其中20 min；
（4）采用交流伏安法(A.C.Voltammetry)進行檢測，記錄空白電流值I0和不同濃度Cu2+溶液的電流值I1。隨著銅離子濃度的增加，對應的△I(△I= I0- I1)也增加，以已知銅離子濃度為橫坐標，其對應的△I為縱坐標，繪制曲線，得到銅離子濃度和△I的線性方程，△I /nA = 1.148+ 0.07358 C Cu2+/ μM。
實施例 2
湖水中銅離子的檢測，具體步驟如下：
將湖水用0.22 μm的濾膜過濾，由于水樣基質較復雜，通過標準加入法來測定湖水中Cu2+ 的濃度。在測定時， 取6份500 μL體積的樣品，分別置于6個2 mL的離心管中，分別加入濃度為1.0 μM的Cu2+ 溶液0、100、200、300、400、500 μL，加水稀釋至1.0 mL。將修飾有DNA （A12）的金電極浸沒于總體積為2.0 mL，分別含有 20.0 μL MilliQ純水（空白）或上述配制水樣的電化學檢測緩沖液（10 mM PBS、2M NaClO4，pH 6.7）中20 min，采用交流伏安法進行檢測，檢測電位為0到 -0.7 V記錄數據。分別測定并計算空白與實驗組的電流差值△I1、△I2、△I 3、△I4、△I5、△I6，作電化學信號變化△I對加入的Cu2+濃度曲線，得到回歸方程為△I/μA= 1.0275 Ccu2+ / μM + 0.01543，當△I =0時，可計算出湖水中Cu2+濃度為0.03 μM。以同樣的方法測得加標回收率為105%，相對標準偏差為3.7%，結果說明本發明所述方法可用于實際水樣中銅離子的檢測。
實施例 3
對銅離子的選擇性考察，具體步驟如下：
將修飾有DNA （A12）的金電極浸沒于總體積為2.0 mL，分別含有 20.0 μL Mn2+、Ni2+、Hg2+、Co2+、Ba2+、Ca2+、Mg2+、Pb2+、Cu2+ 溶液的電化學檢測緩沖液（10 mM PBS、2M NaClO4、pH 6.7）中20 min，銅離子濃度為1.0 μM，所有干擾離子的濃度均為10 μM，采用交流伏安法進行檢測，檢測電位為0到 - 0.7 V，記錄數據。其結果如圖2，說明本發明所述方法對銅離子的選擇性良好。
以上所述僅為本發明的較佳實施例，凡依本發明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應屬本發明的涵蓋范圍。
SEQUENCE LISTING
<110> 福州大學
<120> 基于聚腺嘌呤-亞甲基藍電化學傳感器檢測銅離子的方法
<130> 1
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
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