一種同時檢測血清/血漿中多種維生素的方法和試劑盒與流程

本發明涉及維生素檢測技術，尤其是一種可以同時檢測血清/血漿中多種維生素的方法和試劑盒。
背景技術：
：維生素(vitamin)是人和動物為維持正常的生理功能而必需從食物中獲得的一類有機物質，在人體生長、代謝過程中發揮著重要的作用。機體缺乏維生素將引起代謝障礙，并發生各種疾病,這類疾病統稱為維生素缺乏癥。目前，根據溶解性可將維生素分為脂溶性維生素和水溶性維生素兩大類，水溶性維生素包括B族維生素、維生素C等；脂溶性維生素包括維生素A、D、E、K等。脂溶性維生素中，維生素A是視網膜中感光細胞的感光物質的主要成分，維生素A缺乏會導致干眼癥，對于成人，維生素A缺乏時易導致夜盲癥；維生素D(VitaminD，VitD)對人類健康特別是兒童健康具有重要意義,VitD缺乏性佝僂病是我國兒童重點防治的四病之一，臨床發現VitD缺乏性佝僂病除骨骼病變外,同時可影響神經、肌肉、造血及免疫等組織器官的功能；維生素E有抗氧化的作用，能防止不飽和脂肪酸的自身氧化，因而有保護生物膜的功能，使生物膜中的不飽和脂肪酰不致于因氧化變硬，使膜遭到破壞；維生素K對正常的血液凝結有重要作用,缺乏維生素K會出現血凝緩慢，甚至可導致大出血。水溶性維生素主要包括B族維生素和維生素C等，比如B1(硫胺素)、B2(核黃素)、B5(泛酸)、B6(吡哆醛等)、B12(鈷胺素)、煙酸(尼可酸)、生物素，葉酸等；B族維生素在生物體內通過構成輔酶而影響物質代謝，如在細胞呼吸中起重要作用。維生素最早期的檢測用于一般的添加食品，如嬰兒配方食品、谷類產品和果汁等。EuropeanDirective2002/46EC制定了一系列關于食品添加劑標識及檢測添加過維生素的食品中標注的維生素含量的法規。我國國家標準GB5413～2010對嬰幼兒配方食品與乳品中維生素含量也有明確的規定，標準中涉及的方法有微生物法及高效液相色譜法。關于維生素的檢測，傳統方法為微生物法，其靈敏度高、結果準確，但該方法有許多局限性：整個實驗周期長，批次檢測結果重復性差，檢測結果誤差較大，并且每次只能進行單一維生素種類的檢測；而最近，液相串聯質譜技術的發展使得維生素的檢測進入了一個全新的領域，近幾年來串聯質譜技術在國內醫療市場的占有率愈來愈高，使得串聯質譜在臨床疾病的診斷中得到普及。技術實現要素：基于此，本發明的目的在于克服上述現有技術的不足之處而提供一種可以同時檢測血清/血漿中多種維生素的方法和試劑盒，該方法具有更高的精密度和準確度，檢測效率顯著提升。為實現上述目的，本發明采取的技術方案為：一種同時檢測血清/血漿中多種維生素的方法，包括如下步驟：(1)將待測血清或待測血漿與去蛋白液混勻后離心，取上清液；(2)將步驟(1)所得上清液和內標混合液混勻后采用串聯質譜法進行檢測，通過比較維生素和維生素的內標的離子強度來得出待測血清或待測血漿中維生素的含量。應當說明的是，本發明中的串聯質譜法采用液相色譜串聯質譜聯用儀。優選地，所述步驟(1)中去蛋白液包括以下體積百分比的組分：84.75～98.95％的甲醇、1～15％的水和0.05～0.25％的甲酸；或者所述去蛋白液包括以下體積百分比的組分：84.75～98.95％的乙腈、1～15％的水和0.05～0.25％的甲酸；或者所述去蛋白液包括以下體積百分比的組分：19.95～79.75％的甲醇、20～80％的乙醇和0.05～0.25％的甲酸。優選地，所述步驟(1)中去蛋白液與所述待測血清或待測血漿的體積比為1:5～5:1。優選地，所述步驟(2)中色譜條件：流動相包括以下體積百分比的組分：79.64～97.989％的甲醇、2～20％的水、0.01～0.35％的甲酸，以及0.001～0.01％的全氟丁酸和三氟乙酸中的至少一種；或者流動相包括以下體積百分比的組分：79.64～97.989％的乙腈、2～20％的水、0.01～0.35％的甲酸，以及0.001～0.01％的全氟丁酸和三氟乙酸中的至少一種；或者流動相包括以下體積百分比的組分：49.71～84.989％的甲醇、15～50％的乙腈、0.01～0.28％的甲酸，以及0.001～0.01％的全氟丁酸和三氟乙酸中的至少一種；探針洗液是體積濃度為50～80％的乙腈水溶液，或者探針洗液是體積濃度為50～80％的甲醇水溶液。應當說明的是，探針洗液的作用在于平衡測定前后流動相、輔助測定、清洗探針、以及避免前樣本對后樣本測定的影響。優選地，所述步驟(2)中內標混合液包括維生素B1內標、葉酸內標、維生素A內標、25羥基維生素D2內標、25羥基維生素D3內標、維生素E內標和維生素K1內標。同時，本發明還提供了一種同時檢測血清/血漿中多種維生素的試劑盒，包括：內標混合液、去蛋白液、流動相和探針洗液。優選地，所述去蛋白液包括以下體積百分比的組分：84.75～98.95％的甲醇、1～15％的水和0.05～0.25％的甲酸；或者所述去蛋白液包括以下體積百分比的組分：84.75～98.95％的乙腈、1～15％的水和0.05～0.25％的甲酸；或者所述去蛋白液包括以下體積百分比的組分：19.95～79.75％的甲醇、20～80％的乙醇和0.05～0.25％的甲酸。優選地，所述流動相包括以下體積百分比的組分：79.64～97.989％的甲醇、2～20％的水、0.01～0.35％的甲酸，以及0.001～0.01％的全氟丁酸和三氟乙酸中的至少一種；或者所述流動相包括以下體積百分比的組分：79.64～97.989％的乙腈、2～20％的水、0.01～0.35％的甲酸，以及0.001～0.01％的全氟丁酸和三氟乙酸中的至少一種；或者所述流動相包括以下體積百分比的組分：49.71～84.989％的甲醇、15～50％的乙腈、0.01～0.28％的甲酸，以及0.001～0.01％的全氟丁酸和三氟乙酸中的至少一種。優選地，所述探針洗液是體積濃度為50～80％的乙腈水溶液，或者所述探針洗液是體積濃度為50～80％的甲醇水溶液。優選地，所述內標混合液包括維生素B1內標、葉酸內標、維生素A內標、25羥基維生素D2內標、25羥基維生素D3內標、維生素E內標和維生素K1內標。綜上所述，本發明的有益效果為：(1)本發明的方法通過電壓將維生素分子裂解成不同質荷比的子離子，掃描不同質荷比的子離子數量，參考已知維生素內標的濃度，計算出待測維生素濃度，能同時檢測血清或血漿中水溶性維生素和脂溶性維生素的含量，為國內首例，采用本發明的方法和試劑盒檢測維生素，精密度和準確度更高；(2)本發明的方法可從血清/血漿將多種水溶性和脂溶性維生素提取出來，利用串聯質譜儀在2～3min內對1個標本中十余種維生素同時進行定量，通過分析可以對人體內維生素水平進行評價和監測，從而對維生素相關疾病進行診斷和治療效果評估，檢測周期顯著縮短。附圖說明圖1為實施例1所得總離子圖；圖2為實施例1所得掃描后各成分的質譜圖。具體實施方式為更好的說明本發明的目的、技術方案和優點，下面將結合具體實施例對本發明作進一步說明。實施例1同時檢測血清/血漿中多種維生素的方法一、主要實驗步驟：(1)準備內標工作液：采用美國劍橋同位素實驗室提供的各種維生素的同位素內標及濃度；依據當次實驗標本量計算內標標準工作溶液的量。將上述各種內標混合得到高濃度內標混合液，使用時，按1:100比例采用流動相將高濃度內標混合液稀釋，注意充分混勻即可得到內標工作液。(2)分析過程：1、將充分凝固的全血或者抗凝全血離心，3000轉/分鐘離心5分鐘，提取上層血清或血漿；2、取100～500微升血清/血漿加入離心管，再加入去蛋白液100～500微升，漩渦震蕩充分混勻，靜止10分鐘后離心，10000轉/分鐘離心3～5分鐘，提取上清液；3、取上述上清液100微升并加內標工作液50微升，充分混勻后加入96孔微孔板，覆上鋁箔封膜減少揮發；4、將96孔微孔板放入串聯質譜系統自動進樣器中，啟用應用軟件，建立樣品列表，選擇正確的內標濃度文件和采集方法，以檢測血清/血漿中多種維生素的含量。(3)結果計算：串聯質譜系統中軟件可以將檢測結果通過比較分析物和內標的離子強度來進行計算，給出各維生素的濃度并生成數據報告。(4)注意事項：1、同位素標準品用完之后應立即放入2～8℃冰箱保存；2、使用鋁箔包裹微孔板時，必須包緊；3、如果試劑已經從試劑瓶倒出，不能再次使用。二、主要試劑：本實施例用到的試劑包括去蛋白液，流動相和探針洗液，本實施例中的具體試劑配方為：(1)內標：選用美國劍橋同位素實驗室提供的各維生素的同位素內標及濃度，如下表所示：名稱商品英文名稱濃度維生素B1內標Thiamine～d3Hydrochloride30nmol/L葉酸內標FolicAcid～d24nmol/L維生素A內標VitaminA～d5Acetate1.5μmol/L25羥基維生素D2內標25～HydroxyvitaminD2～[d6]10nmol/L25羥基維生素D3內標25～HydroxyvitaminD3～～[d6]30nmol/L維生素E內標α～Tocopherol～d66μg/mL維生素K1內標VitaminK1～[d7])1.5ng/mL(2)去蛋白液：本法的方法需要將血清/血漿標本去蛋白，去蛋白液的選擇有以下三種配方，分別對應于流動相的三種不同配方，這三種不同配方對最后的檢測結果的準確性和精密度沒有影響。配方a：按照體積百分比包括84.75～98.95％的甲醇、1～15％的水和0.05～0.25％的甲酸；配方b：按照體積百分比包括84.75～98.95％的乙腈、1～15％的水和0.05～0.25％的甲酸；配方c：按照體積百分比包括19.95～79.75％的甲醇、20～80％的乙醇和0.05～0.25％的甲酸。(3)流動相：流動相的選擇有三種配方，分別對應于去蛋白液的三種不同配方，這三種不同配方對最后的檢測結果的準確性和精密度沒有影響。配方一：按照體積百分比包括79.64～97.989％的甲醇、2～20％的水、0.01～0.35％的甲酸，以及0.001～0.01％的全氟丁酸和三氟乙酸中的至少一種，混合均勻后在常溫下密閉超聲脫氣15～20分鐘；配方二：按照體積百分比包括79.64～97.989％的乙腈、2～20％的水、0.01～0.35％的甲酸，以及0.001～0.01％的全氟丁酸和三氟乙酸中的至少一種，混合均勻后在常溫下密閉超聲脫氣15～20分鐘；配方三：按照體積百分比包括49.71～84.989％的甲醇、15～50％的乙腈、0.01～0.28％的甲酸，以及0.001～0.01％的全氟丁酸和三氟乙酸中的至少一種，混合均勻后在常溫下密閉超聲脫氣15～20分鐘。(4)探針洗液：1、50～80％的乙腈水溶液；2、50～80％的甲醇水溶液。(5)注意事項：1、公示的去蛋白液和流動相中乙腈，水，甲酸，及甲醇的比例可在相應范圍內調節，同時須在質譜儀上進行相應參數的調整，這樣，所檢測的維生素含量結果的準確度和精密度不受影響；2、所有試劑均選用色譜級別；3、配置所用水選用三蒸水或純水機過濾的超純水，其電阻≥18MΩ或電導<5us/cm，PH值為7.0±0.2。三、質譜參數：根據去蛋白液和流動相配方,在串聯質譜儀器watersTQD上的設置參考用質譜條件如下表:根據去蛋白液和流動相配方在串聯質譜儀器AB3200上的設置的參考質譜條件如下表：需要注意的是，上述參數中母離子固定，針對不同的機器或同一品牌機器質譜參數變化時，子離子有可能會發生變化。其中，液相泵梯度及質譜儀條件如下表所示：需要注意的是，由于每臺機器在裝機調試時,機器的精密度等不同，以上參數僅供參考，具體調試參數由工程師做少許改動。如圖1所示的通過本實施例的方法所得的總離子圖，橫坐標代表時間，縱坐標代表總離子數量，該圖表示所有待測離子總的掃描離子數量，通過該圖可以判斷總離子數量是否達到檢測要求，如果沒有達到檢測要求，對結果準確性會帶來影響。如圖2所示的通過本實施例的方法所得的掃描后各成分的質譜圖，橫坐標代表母離子的質荷比(實時的監測數，沒有按大小排列)，縱坐標代表離子強度，該圖表示不同檢測物質的離子數量，通過該圖可以計算待測維生素濃度。實施例2同時檢測血清/血漿中多種維生素的試劑盒根據血樣本的不同分別設定試劑配比和串聯質譜條件，本實施的試劑盒可以一次性測出11水溶性和7中脂溶性維生素，可以測出的維生素如下表所示：水溶性維生素脂溶性維生素煙酸胺維生素A煙酸維生素D2維生素B1維生素D3維生素B225-羥基維生素D2鹽酸吡哆醇25-羥維基生素D3鹽酸吡哆胺維生素E鹽酸吡哆醛維生素K1葉酸泛酸生物素維生素B12本實施例的試劑盒包括：內標混合液、去蛋白液、流動相和探針洗液，內標混合液中包括內標品，內標品采用美國劍橋同位素實驗室提供的各種維生素的同位素內標及其濃度，去蛋白液和流動相互一一對應。(1)內標混合液的使用：采用美國劍橋同位素實驗室提供的各種維生素的同位素內標及濃度，將各種內標混合得到高濃度內標混合液，在使用時，用流動相按照所需的比例將高濃度內標混合液稀釋，并且充分混勻得到內標工作液。(2)流動相采用以下配方中的一個：配方一：按照體積百分比包括79.64～97.989％的甲醇、2～20％的水、0.01～0.35％的甲酸，以及0.001～0.01％的全氟丁酸和三氟乙酸中的至少一種，混合均勻后在常溫下密閉超聲脫氣15～20分鐘；配方二：按照體積百分比包括79.64～97.989％的乙腈、2～20％的水、0.01～0.35％的甲酸，以及0.001～0.01％的全氟丁酸和三氟乙酸中的至少一種，混合均勻后在常溫下密閉超聲脫氣15～20分鐘；配方三：按照體積百分比包括49.71～84.989％的甲醇、15～50％的乙腈、0.01～0.28％的甲酸，以及0.001～0.01％的全氟丁酸和三氟乙酸中的至少一種，混合均勻后在常溫下密閉超聲脫氣15～20分鐘。(3)去蛋白液采用以下配方中的一個：配方a：按照體積百分比包括84.75～98.95％的甲醇、1～15％的水和0.05～0.25％的甲酸；配方b：按照體積百分比包括84.75～98.95％的乙腈、1～15％的水和0.05～0.25％的甲酸；配方c：按照體積百分比包括19.95～79.75％的甲醇、20～80％的乙醇和0.05～0.25％的甲酸，并且，去蛋白液采用配方a時，須采用對應的流動相配方一；去蛋白液采用配方b時，須采用對應的流動相配方二；去蛋白液采用配方c時，須采用對應的流動相配方三。(4)探針洗液：采用以下其中一種：1.50～80％的乙腈水溶液；2.50～80％的甲醇水溶液。實施例1的方法配合國內常用的串聯質譜儀(美國AB公司和美國WATERS公司的MS/MS測定儀)以及實施例2的試劑盒，能通過一次實驗同時檢測血清/血漿中多種水溶性維生素和脂溶性維生素，檢測結果具有很高的精確度和準確度。最后所應當說明的是，以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非對本發明保護范圍的限制，盡管參照較佳實施例對本發明作了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的實質和范圍。當前第1頁1 2 3