PD?L1、CDK5和CTLA4中的至少一種在制備腫瘤診斷試劑盒中的用途的制作方法

本發明涉及pd-l1、cdk5和ctla4的用途，具體涉及pd-l1、cdk5和ctla4中的至少一種在制備腫瘤診斷試劑盒中的用途。
背景技術：
：癌癥是人類頭號殺手，以往癌癥予人感覺為不治之癥，但隨著醫學的發展，通過手術、放射治療、化療及標靶藥物治療等均能有效延長病人壽命。不過，以上治療方法始終各有限制，成效有限，且伴隨著不同的副作用。為使癌癥病人在對抗癌魔之余，亦不至元氣大傷，醫學界開始積極研究對抗腫瘤的新方法，終于有了新進展。針對pd-1/pd-l1和ctla4的免疫療法是當前全世界備受矚目、廣為研究的新一類抗癌免疫療法，讓普通患者戰勝癌癥不再遙不可及。程序性死亡分子1及其配體(programmeddeath-1，簡稱pd-1)是t細胞上的一種跨膜受體，最早是在凋亡的t細胞雜交瘤中利用消減法得到的。因其參與t細胞凋亡，故被命名pd-1。在腫瘤患者體內，pd-l1的高表達能夠增強腫瘤的轉移能力、導致患者死亡率上升，因此可以作為患者愈后的標志。pd-1/pd-l1免疫療法，是除手術、放射治療、化療和標靶治療常用癌癥治療方案之外的新一代療法，是針對癌細胞懂得逃逸免疫系統攻擊以及不會自我凋亡的特性，利用人體自身的免疫系統抵御癌癥，pd-1抑制劑能夠與配體pd-l1、pd-l2相互作用，抑制t細胞增殖。針對pd-1的單克隆抗體能夠阻斷pd-1與配體的結合，而抗pd-l1的單克隆抗體可阻斷pd-l1與pd-1、cd80的相互作用，從而恢復t細胞功能。重啟t細胞免疫系統重新識別腫瘤，繼而展開攻擊。除pd-1/pd-l1之外，ctla4也是重要的免疫檢查點。此外研究發現cdk5能夠調節pd-l1等免疫檢查點。目前針對pd-1/pd-l1和ctla4等免疫檢查點的免疫療法是通過阻斷pd-1/pd-l-1和ctla4信號通路，激活腫瘤特異性淋巴細胞來殺滅腫瘤細胞，具有治療多種類型腫瘤的潛力，有望實質性改善患者的總生存期。鑒于腫瘤的異質性，需要篩選合適的腫瘤病人進行針對pd-l1等免疫檢查點的相應的免疫療法。目前主要是檢測pd-1/pd-l1和ctla4的表達水平。所應用的標本是腫瘤病人的組織標本。但是組織標本在臨床應用中有較大的局限性，不能多次和動態的獲得標本，不能有效地用來指導臨床用藥。液體活檢技術可以解決這一問題。其中一個技術是外泌體的檢測。外泌體是由細胞內多泡體與細胞膜融合后,釋放到細胞外基質中的一種直徑約30～120nm的膜性囊泡。t細胞、b細胞、血小板、樹突細胞、肥大細胞等血細胞及上皮細胞、腫瘤細胞等其他非血源性細胞都會分泌外泌體，被分泌出的外泌體會進入血液、唾液、尿液、及乳汁等體液中，通過循環系統到達其他細胞與組織，產生遠程調控作用。這種普遍存在于機體內的被膜結構參與細胞間的物質交換和信息交流，影響細胞的生理狀態,并與多種疾病的發生與進程密切相關。已有研究表明，腫瘤細胞相對于正常細胞會制造更多的外泌體，且外泌體能夠影響臨近的腫瘤細胞或遠處的正常細胞，促進腫瘤的發生發展，以及遠處轉移。利用外泌體檢測以及監控腫瘤有望成為一種有效臨床手段，來早期發現癌癥，指導治療方案，進行精準化個體化治療，目前已有大量文獻支持并驗證這一觀點。而且，相較于最近較為熱門的循環腫瘤細胞，由于其來源更豐富且更利于分離，外泌體將更適用于未來的液體診斷。目前針對pd-1/pd-l1和ctla4的檢測仍以腫瘤組織或手術組織活檢，往往需要采用穿刺或者外科手術的方法從患者上獲取腫瘤組織的檢材。不但不方便，效率低而且會對患者造成人體傷害，往往會延誤治療的最佳時期。現有技術的缺點：手術或內鏡檢測費用昂貴，創傷大，不方便反復多次取材，效率較低，無法動態觀測病人治療效果。侵入式檢查往往使得患者依從性差。腫瘤組織中存在一定的異質性，組織病理檢測可能會造成診斷結果的偏倚，局限性也非常大，不適合在常規體檢時使用，這些手段難以進行重復活檢和動態檢測。技術實現要素：本發明的目的在于克服現有技術存在的不足之處而提供了一種腫瘤診斷試劑盒，本發明還提供了pd-l1基因、cdk5基因和ctla4基因中的至少一種在制備腫瘤診斷試劑盒中的用途。為實現上述目的，所采取的技術方案：一種腫瘤診斷試劑盒，所述腫瘤診斷試劑盒包括檢測pd-l1基因表達產物、cdk5基因表達產物和ctla4基因表達產物中的至少一種的試劑。優選地，所述pd-l1基因表達產物包括pd-l1mrna和/或pd-l1蛋白；所述cdk5基因表達產物包括cdk5mrna和/或cdk5蛋白；所述ctla4基因表達產物包括ctla4mrna和/或ctla4蛋白。優選地，所述檢測pd-l1表達產物的試劑包括檢測pd-l1mrna的探針或者擴增pd-l1mrna的引物；所述檢測cdk5表達產物的試劑包括檢測cdk5mrna的探針或者擴增cdk5mrna的引物；所述檢測ctla4表達產物的試劑包括檢測ctla4mrna的探針或者擴增ctla4mrna的引物。更優選地，所述擴增pd-l1mrna的引物由序列如seqidno:11的正向引物和序列如seqidno:12的反向引物組成。所述擴增cdk5mrna的引物由序列如seqidno:7的正向引物和序列如seqidno:8的反向引物組成，或所述擴增cdk5mrna的引物由序列如seqidno:9的正向引物和序列如seqidno:10的反向引物組成。所述擴增ctla4mrna的引物由序列如seqidno:1的正向引物和序列如seqidno:2的反向引物組成，或所述擴增ctla4mrna的引物由序列如seqidno:3的正向引物和序列如seqidno:4的反向引物組成，或所述擴增ctla4mrna的引物由序列如seqidno:5的正向引物和序列如seqidno:6的反向引物組成。優選地，所述pd-l1基因表達產物、cdk5基因表達產物和ctla4基因表達產物中的至少一種來自唾液外泌體。本發明在唾液外泌體中發現了pd-l1基因表達產物、cdk5基因表達產物和ctla4基因表達產物，且都與組織具有較高的一致性。優選地，所述腫瘤診斷試劑盒包括提取唾液外泌體的試劑、提取唾液外泌體rna的試劑和rna反轉錄試劑。優選地，所述腫瘤為食管癌、肺癌、乳腺癌、膀胱癌、胃癌、肝癌、腦膠質細胞瘤、胰腺癌、前列腺癌或頭頸部腫瘤。本發明提供了pd-l1基因、cdk5基因和ctla4基因中的至少一種在制備腫瘤診斷試劑盒中的用途。本發明提供了pd-l1基因的表達產物、cdk5基因表達產物和ctla4基因表達產物中的至少一種在制備腫瘤診斷試劑盒中的用途。本發明提供了檢測pd-l1基因的表達產物、cdk5基因表達產物和ctla4基因表達產物中的至少一種的試劑在制備腫瘤診斷試劑盒中的用途。本發明提供了檢測pd-l1基因表達水平、cdk5基因表達水平和ctla4基因表達水平中的至少一種的試劑在制備腫瘤診斷試劑盒中的用途。本發明的有益效果在于：1、目前液體活檢正在不斷發展中，由此開發的檢測腫瘤來源的外泌體pd-l1、cdk5和ctla4中的至少一種的試劑盒，是一種具有非侵襲性、高敏感性高特異性、適用于普查篩查大樣本調查的液體診斷監控技術。2、通過檢測腫瘤來源的外泌體pd-l1、cdk5和ctla4中的至少一種的表達，提供一種能夠利用體液等生物樣本進行腫瘤的檢測，穩定性高、定量精確的試劑盒和系統，并由于其無創，易于檢測，便于反復多次取樣，有助于實時反映動態檢測癌患者的疾病狀態，有助于臨床醫生迅速掌握患者病情，從而及時制定更具有個體化的治療措施。附圖說明圖1為本發明實施例1實驗步驟5中熒光定量檢測唾液外泌體中pd-l1、cdk5、ctla4在食管癌病人與正常人中的表達情況；圖2為本發明實施例1實驗步驟5中熒光定量檢測pd-l1、cdk5、ctla4在唾液外泌體中與組織表達的情況；圖3為本發明實施例1實驗步驟5中免疫檢查點分子(pdl-1、cdk5、ctla4、pd-1)在腫瘤病人唾液外泌體中的表達情況。具體實施方式為更好的說明本發明的目的、技術方案和優點，下面將結合具體實施例對本發明作進一步說明。實施例1實施步驟1唾液的收集于早晨8-10點，采用非刺激性滴取法于安靜舒適的環境下，對滿足下列條件受試者進行全唾液收集：1.空腹，未進行劇烈運動；2.至少刷牙一小時以上；3..近期未進行口腔護理。囑咐受試者用清水漱口2-3次，每次約30-40ml左右清水，以清除口腔內食物等殘渣，吐盡殘留液體，頭部微下垂，靜坐5分鐘后待唾液自然流出。收集其非刺激性全唾液于無菌平板培養皿中，以唾液鋪滿培養皿為宜，約500-700μl，而后迅速分裝至無菌1.5mlep管，立即置-80℃保存待用。實施步驟2唾液外泌體提取取等體積實驗步驟1所得唾液如500μl(所需唾液量至少可為250μl).(未進行離心處理的唾液)，2500-5000g/分鐘離心15min。用移液器將離心所得上清移至新的1.5ml的ep管中，約450-470μl澄清上清，加入等量的外泌體沉淀溶液混勻,4℃靜置孵育過夜，10000g4℃離心1h后棄上清，收集沉淀，將外泌體白色沉淀物用適量1x外泌體懸浮液重懸得到外泌體重懸液。實施步驟3唾液外泌體中rna提取在上述實施步驟2中最后得到的外泌體白色沉淀中，加入250-500μl的rna提取液，反復吹打后，室溫裂解7-14min，混合均勻后加入相應mirna的外參cel-mir-39用以后續分析標準化。加入60μl的rna除雜液，渦旋充分混勻后，室溫靜置4-14min，離心10000-13000g4-14min，轉上層水相到另一個新管，加入等體積的rna沉淀液，上下顛倒混勻后室溫靜置4-14min，或者-20℃沉淀。離心10000-13000g4-14min后，棄去上清液，加入250-500μl-20℃預冷的rna洗滌液洗滌沉淀，震蕩混勻，12000g/5min，棄乙醇液體，超凈臺靜置充分晾干沉淀。所得沉淀用rna富集液溶解沉淀運用nanodorp2000紫外分光光度計檢測純度及濃度，所得rna封口膜密封，-80攝氏度保存。上述所述試劑成分如下表1示。表1試劑成分表實施步驟4唾液外泌體rna反轉錄合成cdna以總rna為模板，反轉錄合成cdna，反應步驟如下：根據各自rna濃度計算統一的rna含量(20μl)體系。按照下述表2的比例配成10μl體系加入pcr管中：表2rna配置體系rnaxμl(含1ng至5μgrna)depc水10-xμltotal10μl加入如下表3的體系：表3反轉錄體系按表3配成20μl體系，體系混勻后，將配置的20μl體系的pcr管置于bio-rads1000溫度循環變溫器(聚合酶鏈式反應儀)按表4設定步驟進行表4反應程序25℃10min37℃120min85℃5min4℃forever反應完成后將反應所得的cdna放置-20℃冰箱保存即可。實施步驟5唾液外泌體中cdna的q-pcr采用特異性外泌體pd-l1引物上游引物primers15'-tgccgactacaagcgaattactg-3'以及pd-l1下游引物primers25'-ctgcttgtccagatgacttcgg-3'按以下條件進行realtimepcr反應。按照表5的比例配成25μlrealtimepcr反應體系加入pcr管中：表5realtimepcr反應體系mix(2*)10μl正向引物0.2μl反向引物0.2μlcdna2μl滅菌超純水7μltotal25μl將按照上述方式配置的20μl體系的pcr管置于abi7500中按如下設定步驟進行，realtimepcr反應條件如表6：表6realtimepcr反應條件使用abi7500進行實時熒光定量pcr檢測，其中從步驟3到步驟4持續40個循環。選用汕頭大學附屬腫瘤醫院100例食管癌患者唾液以及汕頭市老年大學的40例正常人唾液。采用上述步驟，對唾液外泌體中pd-l1、cdk5、ctla4進行熒光定量檢測，結果如圖1所示，唾液外泌體中pd-l1、cdk5、ctla4在食管癌病人比正常人高并有顯著的統計學差異(***p<0.001)，說明檢測唾液外泌體pd-l1、cdk5、ctla4能夠作為區分食管癌病人和正常人的標志物。在100例病人中隨機選取12例，運用熒光定量分別檢測pd-l1、cdk5、ctla4在唾液外泌體中與組織表達一致性，結果如圖2所示，說明唾液外泌體能夠較好反應組織中pd-l1、cdk5、ctla4的表達。在100例病人例隨機選取5例運用熒光定量檢測唾液外泌體pd-1、pd-l1、cdk5、ctla4，將定量產物用2％的瓊脂糖膠跑電泳，結果如圖3所示，說明了免疫檢查點分子(pd-l1、pd-1、cdk5、ctla4)在腫瘤病人唾液外泌體中的表達高。pcr檢測方法中涉及到的引物：ctla4(人)f1(正向引物)：5’-ggaatatgacggtgatcaca-3’(seqidno:1)ctla4(人)r1(反向引物)：5’-cattgaggctgtcaataaga-3’(seqidno:2)ctla4人)f2(正向引物)：5’-gggatcagcggtcttattga-3’(seqidno:3)ctla4(人)r2(反向引物)：5’-ggcgcagaagcaagataaac-3’(seqidno:4)pd-1(人)f(正向引物)：5’-gacagcggcacctacctctgtg-3’(seqidno:5)pd-1(人)r(反向引物)：5’-gacccagactagcagcaccagg-3’(seqidno:6)cdk5(人)f1(正向引物)：5’-ctccgggagatctgcctact-3’(seqidno:7)cdk5(人)r1(反向引物)：5’-agcacattgcggctatgaca-3’(seqidno:8)cdk5(人)f2(正向引物)：5’-cgcaatgtgctacacaggga-3’(seqidno:9)cdk5(人)r2(反向引物)：5’-cattgccgggaaaaagaggc-3’(seqidno:10)。pd-l1(人)f(正向引物)：5'-tgccgactacaagcgaattactg-3'(seqidno:11)pd-l1(人)r(反向引物)：5'-ctgcttgtccagatgacttcgg-3'(seqidno:12)。實施本發明通過檢測唾液pd-l1、cdk5、ctla4基因的表達水平，可以簡單、方便且準確地檢測患者pd-l1、cdk5、ctla4的表達水平，從而指導臨床應用pd1/pd-l1免疫療法以及其他療法的應用。最后所應當說明的是，以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非對本發明保護范圍的限制，盡管參照較佳實施例對本發明作了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的實質和范圍。序列表<110>汕頭大學<120>pd-l1、cdk5和ctla4中的至少一種在制備腫瘤診斷試劑盒中的用途<130>2017<160>12<170>patentinversion3.3<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列<400>1ggaatatgacggtgatcaca20<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列<400>2cattgaggctgtcaataaga20<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列<400>3gggatcagcggtcttattga20<210>4<211>20<212>dna<213>人工序列<400>4ggcgcagaagcaagataaac20<210>5<211>22<212>dna<213>人工序列<400>5gacagcggcacctacctctgtg22<210>6<211>22<212>dna<213>人工序列<400>6gacccagactagcagcaccagg22<210>7<211>20<212>dna<213>人工序列<400>7ctccgggagatctgcctact20<210>8<211>20<212>dna<213>人工序列<400>8agcacattgcggctatgaca20<210>9<211>20<212>dna<213>人工序列<400>9cgcaatgtgctacacaggga20<210>10<211>20<212>dna<213>人工序列<400>10cattgccgggaaaaagaggc20<210>11<211>23<212>dna<213>人工序列<400>11tgccgactacaagcgaattactg23<210>12<211>22<212>dna<213>人工序列<400>12ctgcttgtccagatgacttcgg22當前第1頁12