基于納米氧化銅測定尿素的方法與流程

本發(fā)明涉及尿素在脲酶催化下水解產(chǎn)生氨，抑制納米氧化銅模擬堿性過氧化物酶在堿性條件下催化過氧化氫氧化對羥基苯丙酸形成熒光產(chǎn)物的活性，建立測定尿素的熒光分析方法，屬于分析化學(xué)和納米技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

過氧化物酶主要存在于細(xì)胞的過氧化物酶體中，可催化過氧化氫氧化酚類和胺類化合物，繼而清除過氧化氫、酚類和胺類毒性的作用。天然過氧化物酶含量少，價格昂貴，容易受外界環(huán)境干擾失去催化活性，納米人工模擬酶由于其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、經(jīng)濟(jì)、易于大規(guī)模制備以及可調(diào)催化活性等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛用于生物分析和生物技術(shù)應(yīng)用。天然過氧化物酶及其模擬物通常在酸性或中性條件下發(fā)揮最佳性能。然而，在堿性條件下進(jìn)行的研究很少。因此，堿性過氧化物酶模擬物的發(fā)現(xiàn)對于實(shí)際應(yīng)用具有重要意義。

尿素是一種由碳、氧、氮及氫元素構(gòu)成的有機(jī)小分子，是血液和其他體液的基本組成成分。尿素是氨基酸代謝的最終產(chǎn)物，在肝臟內(nèi)合成，一般隨尿液排出體外。但是40%~50%在腎小球的髓質(zhì)部被動的重吸收，當(dāng)人體尿素的含量超過了自身的吸收能力之后，將會對人體的肝、腎、肺泡等造成危害。尿素在診斷腎臟和肝臟疾病中起重要作用。腎衰竭（急性或慢性）、尿道梗阻、脫水、休克、燒傷和胃腸道出血等疾病會引起尿素水平增加，肝衰竭，腎炎綜合征、惡病質(zhì)（低蛋白和高碳水化合物飲食）等嚴(yán)重疾病也會引起尿素水平降低。因此，尿素的檢測對于臨床診斷中具有重要意義。

本發(fā)明基于納米氧化銅作為模擬堿性過氧化物酶催化過氧化氫氧化對羥基苯丙酸，結(jié)合脲酶催化尿素水解產(chǎn)生氨的反應(yīng)，提供一種以納米氧化銅為催化劑測定尿素的熒光分析方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是基于納米氧化銅良好的模擬堿性過氧化物酶活性，結(jié)合脲酶可以選擇性水解尿素生成氨和二氧化碳，再通過氨抑制納米氧化銅催化過氧化氫氧化對羥基苯丙酸的過程，減少二聚體熒光產(chǎn)物的生成，提供一種以納米氧化銅為催化劑測定尿素的熒光分析方法。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：所述一種以納米氧化銅為催化劑測定尿素的熒光分析方法，其特征是首先將尿素、脲酶和磷酸鹽緩沖液三者混合在溫浴下進(jìn)行脲酶酶促反應(yīng)，然后向其中加入對羥基苯丙酸、過氧化氫、納米氧化銅溶液和磷酸鹽緩沖液繼續(xù)溫浴進(jìn)行熒光反應(yīng)，用熒光分光光度計測定上述熒光反應(yīng)產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度；所述的納米氧化銅由如下步驟制得：1）取0.02 mol/L的醋酸銅溶液150 ml和0.5 ml冰醋酸加入到裝有冷凝管的三頸瓶中，攪拌加熱至沸騰；2）快速加入0.04 g/ml的氫氧化鈉溶液10 ml，加完后繼續(xù)攪拌5分鐘，得到黑色氧化銅沉淀；3）將反應(yīng)得到的黑色氧化銅沉淀離心，用無水乙醇洗滌三次，減壓干燥，即得納米氧化銅粉體。

所述的一種以納米氧化銅為催化劑測定尿素的熒光分析方法，其特征是熒光反應(yīng)產(chǎn)物的最大激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為320 nm和409 nm。

所述的一種以納米氧化銅為催化劑測定尿素的熒光分析方法，其特征是脲酶酶促反應(yīng)體系pH值為7.0，脲酶濃度為0.3 U/mL，反應(yīng)溫度為37 ℃，反應(yīng)時間為30分鐘。

熒光反應(yīng)體系的pH值為10.25，氧化銅濃度為0.4 mg/L，對羥基苯丙酸濃度為4 mmol/L，反應(yīng)溫度為65℃，反應(yīng)時間為15分鐘。

所述的一種以納米氧化銅為催化劑測定尿素的熒光分析方法，其特征是將150 μL用濃度為10mmol/L，pH為7.0的磷酸鹽緩沖液配制成的不同濃度的尿素溶液和50 μL濃度為6 U/mL的脲酶溶液混合，混合液在37 ℃溫浴水解反應(yīng)30分鐘，隨后向混合液中依次加入50 μL濃度為120 mmol/L的過氧化氫溶液，50 μL濃度為80 mmol/L的對羥基苯丙酸，200 μL濃度為2mg/L的納米氧化銅溶液和500 μL濃度為100mmol/L、pH為10.25的磷酸鹽緩沖溶液中，混合液在65 ℃溫浴，15分鐘后分別測定其在409 nm處的熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長為320 nm，以熒光強(qiáng)度差值對尿素濃度對數(shù)值作圖得到標(biāo)準(zhǔn)曲線用于測定尿素。

所述的一種以納米氧化銅為催化劑測定尿素的熒光分析方法，其特征是尿素檢測線性范圍為0.0375~0.3 mmol/L，檢測限為27 μmol/L。

本發(fā)明利用納米氧化銅為催化劑測定尿液尿素含量的熒光分析方法，其特征是它由以下步驟組成：（1）在EP管中分別加入用磷酸鹽緩沖液稀釋后的尿液和脲酶混合溫??；（2）向上述EP管中加入磷酸鹽緩沖液，過氧化氫，對羥基苯丙酸和納米氧化銅溶液繼續(xù)溫??；（3）將反應(yīng)產(chǎn)物置于熒光分光光度計中檢測熒光強(qiáng)度，根據(jù)尿素標(biāo)準(zhǔn)曲線測定尿液中尿素濃度；所述的納米氧化銅由如下步驟制得：1）取0.02 mol/L的醋酸銅溶液150 ml和0.5 ml冰醋酸加入到裝有冷凝管的三頸瓶中，攪拌加熱至沸騰；2）快速加入0.04 g/ml的氫氧化鈉溶液10 ml，加完后繼續(xù)攪拌5分鐘，得到黑色氧化銅沉淀；3）將反應(yīng)得到的黑色氧化銅沉淀離心，用無水乙醇洗滌三次，減壓干燥，即得納米氧化銅粉體。

所述的利用納米氧化銅為催化劑測定尿液尿素含量的熒光分析方法，其特征是在EP管中分別加入150 μL用濃度為10 mmol/L、pH為7.0的磷酸鹽緩沖液稀釋600倍的尿液樣品和50 μL濃度為6 U/mL的脲酶溶液混合，混合液在37 ℃溫浴水解反應(yīng)30分鐘，隨后向混合液中依次加入50 μL濃度為120 mmol/L的過氧化氫溶液，50 μL濃度為80 mmol/L的對羥基苯丙酸，200 μL濃度為2 mg/L的納米氧化銅溶液和500 μL濃度為100mmol/L、pH為10.25的磷酸鹽緩沖溶液中，混合液在65 ℃溫浴，15分鐘后分別測定其在409 nm處的熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長為320 nm。

所述的脲酶酶促反應(yīng)體系pH值優(yōu)選為7.0，脲酶濃度優(yōu)選為0.3U/mL。

所述的脲酶酶促反應(yīng)溫度優(yōu)選為37 ℃，反應(yīng)時間優(yōu)選為30分鐘。

所述的熒光反應(yīng)體系的pH值優(yōu)選為10.25，納米氧化銅濃度優(yōu)選為0.4mg/L，對羥基苯丙酸濃度優(yōu)選為4mmol/L。

所述的熒光反應(yīng)溫度優(yōu)選為65℃，反應(yīng)時間優(yōu)選為15分鐘。

本發(fā)明的技術(shù)方案具體步驟如下：

（一）納米氧化銅的制備：

取醋酸銅溶液和冰醋酸加入到裝有冷凝管的三頸瓶中，攪拌加熱至沸騰，快速加入氫氧化鈉溶液，加完后，繼續(xù)攪拌后，得到黑色氧化銅。將反應(yīng)得到的黑色氧化銅立即離心，用無水乙醇洗滌，減壓干燥，即得納米氧化銅粉體。將納米氧化銅粉體分散于二次蒸餾水中得到棕色納米氧化銅膠體溶液。

納米氧化銅具體制備步驟如下：

（1）取0.02 mol/L的醋酸銅溶液150 ml和0.5 ml冰醋酸加入到裝有冷凝管的三頸瓶中，攪拌加熱至沸騰；

（2）快速加入0.04 g/ml的氫氧化鈉溶液10 ml，加完后繼續(xù)攪拌5分鐘，得到黑色氧化銅沉淀；

（3）將反應(yīng)得到的黑色氧化銅沉淀離心，用無水乙醇洗滌三次，減壓干燥，即得納米氧化銅粉體。

（二）尿素的測定

首先將尿素、脲酶和磷酸鹽緩沖液三者混合，混合液放入37℃溫浴30分鐘進(jìn)行脲酶酶促反應(yīng)，然后向其中加入對羥基苯丙酸、過氧化氫、納米氧化銅和磷酸鹽緩沖液后65 ℃溫浴反應(yīng)15分鐘，測定熒光強(qiáng)度，以熒光強(qiáng)度差值對尿素濃度對數(shù)值作圖得到標(biāo)準(zhǔn)曲線以用于測定尿素。

（三）尿液中尿素的測定

將尿素替換為稀釋后的尿液樣品重復(fù)步驟二，將所得熒光強(qiáng)度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線即可得到尿液中尿素的濃度。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：

本發(fā)明利用納米氧化銅的模擬堿性過氧化物酶特性，成功構(gòu)建了一種檢測尿素的熒光分析方法。該技術(shù)測定尿素的線性范圍為0.0375~0.3 mmol/L，其檢測限為27 μmol/L。本發(fā)明具有靈敏度高，樣品需求量少，重現(xiàn)性好，成本低等優(yōu)點(diǎn)，可應(yīng)用于尿液樣品中尿素的測定。

附圖說明

圖1為熒光體系的熒光光譜圖。

圖2為pH值對熒光強(qiáng)度的影響圖。

圖3為納米氧化銅濃度對熒光強(qiáng)度的影響圖。

圖4為對羥基苯丙酸濃度對熒光強(qiáng)度的影響圖。

圖5為尿素濃度對熒光強(qiáng)度的影響圖。

圖6為脲酶濃度對熒光強(qiáng)度的影響圖。

圖7為尿素的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

具體實(shí)施方式

以下通過實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明，但是本發(fā)明不僅限于此。

實(shí)例1：

納米氧化銅具體制備步驟如下：（1）取0.02 mol/L的醋酸銅溶液150 ml和0.5 ml冰醋酸加入到裝有冷凝管的三頸瓶中，攪拌加熱至沸騰；（2）快速加入0.04 g/ml的氫氧化鈉溶液10 ml，加完后繼續(xù)攪拌5分鐘，得到黑色氧化銅沉淀；（3）將反應(yīng)得到的黑色氧化銅沉淀離心，用無水乙醇洗滌三次，減壓干燥，即得直徑為6 nm的納米氧化銅粉體。

實(shí)例2：

將50 μL濃度為120 mmol/L的過氧化氫溶液，50 μL濃度為80 mmol/L的對羥基苯丙酸和200 μL濃度為2mg/L的實(shí)例1制備的納米氧化銅溶液加入到700 μL濃度為100mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液（pH 10.25）中，混合搖勻后置于65℃溫浴，15分鐘后測定其熒光光譜。如圖1所示，熒光產(chǎn)物激發(fā)波長為320 nm，發(fā)射波長為409 nm。

實(shí)例3：

將50 μL濃度為120 mmol/L的過氧化氫溶液，50 μL濃度為80 mmol/L的對羥基苯丙酸和200 μL濃度為2mg/L的實(shí)例1制備的納米氧化銅溶液加入到700 μL濃度為100mmol/L不同pH的磷酸鹽緩沖溶液（pH 9～11）中，混合搖勻后置于65℃溫浴，15分鐘后測定其在409 nm處的熒光強(qiáng)度（激發(fā)波長為320 nm）。如圖2所示，熒光強(qiáng)度在pH為10.1~10.3之間達(dá)到最大值。

實(shí)例4：

將50 μL濃度為120 mmol/L的過氧化氫溶液，50 μL濃度為80 mmol/L的對羥基苯丙酸和200 μL不同濃度的實(shí)例1制備的納米氧化銅溶液（0～5 mg/L）加入到700 μL濃度為100mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液（pH 10.25）中，混合搖勻后置于65℃溫浴，15分鐘后測定其在409 nm處的熒光強(qiáng)度（激發(fā)波長為320 nm）。如圖3所示，熒光強(qiáng)度隨混合液中納米氧化銅濃度增大而增大并在終濃度為0.4 mg/L時達(dá)到最大。

實(shí)例5：

將50 μL濃度為120 mmol/L的過氧化氫溶液，50 μL不同濃度的對羥基苯丙酸（0～80 mmol/L）和200 μL濃度為2mg/L的實(shí)例1制備的納米氧化銅溶液加入到700 μL濃度為100mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液（pH 10.25）中，混合搖勻后置于65℃溫浴，15分鐘后測定其在409 nm處的熒光強(qiáng)度（激發(fā)波長為320 nm）。如圖4所示，熒光強(qiáng)度隨混合液中對羥基苯丙酸濃度增大而增大，在終濃度為3.5 mmol/L時，熒光強(qiáng)度達(dá)到最大值。

實(shí)例6：

將150 μL不同濃度的尿素溶液（0～15 mmol/L，用濃度為10mmol/L，pH為7.0的磷酸鹽緩沖液配制）和50 μL濃度為6 U/mL的脲酶溶液混合，混合液在37 ℃溫浴水解反應(yīng)30分鐘，隨后向混合液中依次加入50 μL濃度為120 mmol/L的過氧化氫溶液，50 μL濃度為80 mmol/L的對羥基苯丙酸，200 μL濃度為2mg/L的實(shí)例1制備的納米氧化銅溶液和500 μL濃度為100mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液（pH 10.25）中，混合液在65 ℃溫浴，15分鐘后分別測定其在409 nm處的熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長為320 nm，如圖5所示，熒光強(qiáng)度差值隨混合液中尿素濃度增大而增大，在終濃度為0.75 mmol/L時，熒光強(qiáng)度達(dá)到穩(wěn)定值。

實(shí)例7：

將150 μL濃度為15 mmol/L的尿素溶液（用濃度為10mmol/L，pH為7.0的磷酸鹽緩沖液配制）和50 μL不同濃度的脲酶溶液（0.04～6 U/mL）混合，混合液在37 ℃溫浴水解反應(yīng)30分鐘，隨后向混合液中依次加入50 μL濃度為120 mmol/L的過氧化氫溶液，50 μL濃度為80 mmol/L的對羥基苯丙酸，200 μL濃度為2mg/L的實(shí)例1制備的納米氧化銅溶液和500 μL濃度為100mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液（pH 10.25）中，混合液在65 ℃溫浴，15分鐘后分別測定其在409 nm處的熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長為320 nm，如圖6所示，熒光強(qiáng)度差值隨混合液中脲酶濃度增大而增大，在終濃度為0.1 U/mL時，熒光強(qiáng)度達(dá)到穩(wěn)定值。

實(shí)例8：

將150 μL不同濃度的尿素溶液（0.25～2 mmol/L，用濃度為10mmol/L，pH為7.0的磷酸鹽緩沖液配制）和50 μL濃度為6 U/mL的脲酶溶液混合，混合液在37 ℃溫浴水解反應(yīng)30分鐘，隨后向混合液中依次加入50 μL濃度為120 mmol/L的過氧化氫溶液，50 μL濃度為80 mmol/L的對羥基苯丙酸，200 μL濃度為2mg/L的實(shí)例1制備的納米氧化銅溶液和500 μL濃度為100mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液（pH 10.25）中，混合液在65 ℃溫浴，15分鐘后分別測定其在409 nm處的熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長為320 nm，以熒光強(qiáng)度差值對尿素濃度對數(shù)值作圖得到尿素標(biāo)準(zhǔn)曲線。如圖7所示，熒光強(qiáng)度與尿素濃度在0.0375~0.3 mmol/L范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，檢測限為27 μmol/L。

實(shí)例9：

在EP管中分別加入150 μL用濃度為10mmol/L，pH為7.0的磷酸鹽緩沖液稀釋600倍的尿液樣品和50 μL濃度為6 U/mL的脲酶溶液混合，混合液在37 ℃溫浴水解反應(yīng)30分鐘，隨后向混合液中依次加入50 μL濃度為120 mmol/L的過氧化氫溶液，50 μL濃度為80 mmol/L的對羥基苯丙酸，200 μL濃度為2mg/L的納米氧化銅溶液和500 μL濃度為100mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液（pH 10.25）中，混合液在65 ℃溫浴，15分鐘后分別測定其在409 nm處的熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長為320 nm。經(jīng)實(shí)例8所得尿素標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得出尿液樣品中尿素含量，此數(shù)值與二乙酰一肟法得到的數(shù)據(jù)一致。樣品回收率93.5~105.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差1.0%~3.1%，由此可見本方法可靠適用。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改，等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。