基于復合材料的免疫傳感器及其用于檢測HSP90的方法與流程
本發明涉及蛋白檢測領域。更具體地說，本發明涉及一種基于g-C3N4-F127-Au復合材料的免疫傳感器以及其用于檢測HSP90的方法。
背景技術：
熱休克蛋白(heat shock proteins，HSPs)也稱作應激蛋白，是機體在應激狀態下合成的一類蛋白質分子。其中HSP90包含ATP不同的結合位點，許多活性化合物都可以和HSP90發生反應。它在細胞內含量豐富，占正常細胞總蛋白的1％～2％。它可以保護細胞的功能和結構，抑制其他蛋白質的聚合和變性。除了它在醫學抗癌癥效果得到了良好的科學研究，它在食品化學的作用也受到了越來越多的關注。近幾年報道說明，HSP90和肉品品質密切相關，它的含量影響肉的嫩度，持水量，口感等方面，因此對其定量檢測十分必要。現有的檢驗的方法有液相色譜，熒光定量等方法，但是這些方法檢測成本較大，測量時間長。為此，迫切需要開發一種檢測成本低、操作簡單、靈敏度高的HSP90定量檢測方法。
電化學免疫傳感器是基于抗原抗體反應的，可進行特異性的定量或半定量分析的自給式集成器件，其具有生物傳感器選擇性好，種類多，測試費用低等優點。但是傳統的電化學免疫傳感器在應用于檢測HSP90時，其生物相容性和靈敏度都不能達到要求。
技術實現要素：
本發明的一個目的是解決至少上述問題，并提供至少后面將說明的優點。
本發明還有一個目的是提供一種基于復合材料的免疫傳感器，其制備成本低，綠色無害；構建方法快捷，生物相容性良好，對檢測HSP90有比較好的靈敏度，對其他干擾物質例如HSP70等有良好的抗干擾性。
為了實現根據本發明的這些目的和其它優點，提供了一種基于復合材料的免疫傳感器，包括：工作電極，其基底電極為玻碳電極，其表面自內向外依次修飾有g-C3N4-F127-Au和antiHSP90；
其中，所述g-C3N4-F127-Au通過下述方法制備而成：100-200重量份F127加3-8重量份的水溶解并靜置過夜；之后加入5-20重量份g-C3N4超聲6h；在黑暗條件下再加入0.1-0.3重量份HAuCl4，攪拌1-3h；然后迅速加入0.3-0.8重量份新制的NaBH4攪拌0.5-1.5h；經過透析過夜，得到g-C3N4-F127-Au。
優選的是，所述工作電極的制備方法包括以下步驟：
步驟一：將玻碳電極GCE拋光至呈鏡面，然后超聲洗滌、室溫下干燥；
步驟二，取3-7μLg-C3N4-F127-Au滴到電極表面，干燥；
步驟三，將3-7μLantiHSP90溶液滴在g-C3N4-F127-Au修飾的電極表面上，室溫下干燥即可；
其中所述antiHSP90溶液的濃度為1μmol/L。
優選的是，所述基于復合材料的免疫傳感器還包括：參比電極，其為飽和甘汞電極；
以及對電極，其為鉑絲電極。
優選的是，所述HAuCl4的重量百分比濃度為2％；所述NaBH4的重量百分比濃度為0.5wt％。
優選的是，所述透析的截留分子量MW為14000。
本發明還提供一種利用所述免疫傳感器檢測HSP90的方法，其包括以下步驟：
步驟一，采用antiHSP90/g-C3N4-F127-Au電極為工作電極、飽和甘汞電極用作參比電極、Pt絲電極用作對電極，正確連接在電化學工作站上；
步驟二，建立檢測HSP90濃度的標準曲線：配制不同的濃度的HSP90溶液，滴在antiHSP90/g-C3N4-F127-Au工作電極上，對其進行差分脈沖伏安法掃描，記錄峰電流Ipa，將所述的峰電流Ipa與HSP90標準溶液濃度c繪制Ipa-c工作曲線，建立檢測HSP90濃度的標準曲線。
優選的是，配置不同濃度的HSP90溶液，其中所述HSP90的濃度分別為0.049，0.097，0.24，0.49，0.97，1.70，2.43mM；所述標準曲線的線性方程為：Ipa＝8.73c+6.29；其中，R＝0.99。
本發明至少包括以下有益效果：本發明所述基于復合材料的免疫傳感器，選用g-C3N4-F127-Au構建antiHSP90/g-C3N4-F127-Au/GCE電極作為工作電極，構建方法快捷；其中g-C3N4-F127-Au的制備。對比傳統的色譜測量來說制備成本低，綠色無害；本發明所述基于復合材料的免疫傳感器具有良好的生物相容性；在抗干擾能力方面，對其他干擾物質例如HSP70等有良好的抗干擾性。提高HSP90的檢測準確度。利用本發明所述基于復合材料的免疫傳感器檢測HSP90的方法，建立檢測HSP90的線性方程為：Ipa(μA)＝8.73c(mg/mL)+6.29(R＝0.99)計算簡單。檢測限低；
本發明的其它優點、目標和特征將部分通過下面的說明體現，部分還將通過對本發明的研究和實踐而為本領域的技術人員所理解。
附圖說明
圖1為本發明所述基于復合材料的免疫傳感器的g-C3N4-F127-Au的TEM圖；
圖2為本發明所述基于復合材料的免疫傳感器中g-C3N4(a)和g-C3N4-F127-Au(b)的FTIR圖；
圖3為本發明所述基于復合材料的免疫傳感器主體的紫外光譜圖；
圖4為本發明所述基于復合材料的免疫傳感器的的CD曲線圖；
圖5為本發明所述基于復合材料的免疫傳感器的LSV曲線圖；
圖6為本發明所述HSP90的檢測方法中不同濃度HSP90的DPV曲線圖；
圖7為本發明所述HSP90的檢測方法中不同濃度HSP90的標準曲線圖；
圖8為本發明所述HSP90的檢測方法中不同物質的檢測結果對比圖。
具體實施方式
下面結合附圖對本發明做進一步的詳細說明，以令本領域技術人員參照說明書文字能夠據以實施。
應當理解，本文所使用的諸如“具有”、“包含”以及“包括”術語并不排除一個或多個其它元件或其組合的存在或添加。
本發明提供一種基于復合材料的免疫傳感器，包括：工作電極，其基底電極為玻碳電極，其表面自內向外依次修飾有g-C3N4-F127-Au和antiHSP90；
其中，所述g-C3N4-F127-Au通過下述方法制備而成：100-200重量份F127加3-8重量份的水溶解并靜置過夜；之后加入5-20重量份g-C3N4超聲6h；在黑暗條件下再加入0.1-0.3重量份HAuCl4，攪拌1-3h；然后迅速加入0.3-0.8重量份新制的NaBH4攪拌0.5-1.5h；經過透析過夜，得到g-C3N4-F127-Au。
在其中一個實施例中，所述工作電極的制備方法包括以下步驟：
步驟一：將玻碳電極GCE拋光至呈鏡面，然后超聲洗滌、室溫下干燥；
步驟二，取3-7μL g-C3N4-F127-Au滴到電極表面，干燥；
步驟三，將3-7μLantiHSP90溶液滴在g-C3N4-F127-Au修飾的電極表面上，室溫下干燥即可；
其中所述antiHSP90溶液的濃度為1μmol/L。
在其中一個實施例中，所述基于復合材料的免疫傳感器還包括：參比電極，其為飽和甘汞電極；
以及對電極，其為鉑絲電極。
在其中一個實施例中，所述HAuCl4的重量百分比濃度為2％；所述NaBH4的重量百分比濃度為0.5wt％。
在其中一個實施例中，所述透析的截留分子量MW為14000。
實施例1
本發明所述基于復合材料的免疫傳感器包括：
工作電極，其基底電極為玻碳電極，其表面之內向外依次修飾有g-C3N4-F127-Au和antiHSP90；參比電極，其為飽和甘汞電極；以及對電極，其為鉑絲電極。
所述工作電極采用下述方法制備：
步驟一，g-C3N4-F127-Au的制備：
取0.15g F127溶解在5mL水中過夜。在該溶液中加入10mg g-C3N4超聲6h。在黑暗條件下加入200μL HAuCl4(2％)到上述的懸濁液中，攪拌2h。為了還原HAuCl4，在上述溶液中迅速加入0.6mL新制的NaBH4(0.5wt％)攪拌1小時。最后，經過透析過夜(MW＝14000)，得到g-C3N4-F127-Au。制備好的復合材料儲存在常溫4℃的冰箱里。
步驟二，antiHSP90/g-C3N4-F127-Au電極的制備：
將玻碳電極(GCE)拋光至呈鏡面，然后超聲洗滌、室溫下干燥。5μL g-C3N4-F127-Au滴到電極表面，干燥后，將5μLantiHSP90(1μmol/L)溶液滴在g-C3N4-F127-Au修飾的電極表面上，室溫下干燥。
采用HITACHI H-7650(HITACHI，日本)測定g-C3N4-F127-Au的形貌特征，其中電壓為80kV。結果見圖1，由圖1可知，g-C3N4-F127-Au粒子分布均勻，粒子呈規則球形。證明該復合材料被成功合成。
采用Cary 5000的紅外變換分光光度計(VARIAN，美國)測定g-C3N4和g-C3N4-F127-Au并得到其紅外光譜圖，測量范圍是3500cm-1到500cm-1。如圖2所示，曲線a和曲線b中，在波數2850cm-1附近的吸收峰為C-H的特征吸收峰。在1400cm-1附近的峰是C-N的特征峰，說明g-C3N4-F127-Au復合材料已經成功制備。
另外，也可以使用Cary 5000UV-vis-NIR分光光度計(Varian,美國)測定g-C3N4–F127-Au并得到其紫外光譜圖。由圖3可知，F127在200～800nm的波長中沒有吸收峰。在320nm處，g-C3N4和g-C3N4–F127-Au有相似的吸收峰，由文獻可知，這是碳化氮的特征吸收峰。此外，g-C3N4–F127-Au在520nm處有一個強的吸收峰，由文獻可知，這是Au的特征吸收峰。因此，進一步證明g-C3N4-F127-Au被成功合成。
通過Chirascan(Applied photophysics，英格蘭)測定得到圓二光譜圖，由此證明g-C3N4-F127-Au良好的生物相容性。圖4中是g-C3N4-F127-Au(a)、HSP90/g-C3N4-F127-Au/GCE(b)的CD曲線。從圖4中可知，在加入g-C3N4-F127-Au前后，HSP90的峰高和峰位置都沒有明顯的變化。由此說明g-C3N4-F127-Au具有良好的生物相容性。
采用線性伏安法(LSV)，對GCE、g-C3N4-F127-Au/GCE、antiHSP90/g-C3N4-F127-Au/GCE、HSP90/antiHSP90/g-C3N4-F127-Au/GCE分別進行電化學性能檢測。使用PBS溶液(含有0.1mol/L KCl)的pH＝7，檢測的掃描速率為100mV/s，掃描范圍是-0.2～0.7V。
采用線性伏安法(LSV)對g-C3N4-F127-Au、antiHSP90/g-C3N4-F127-Au/GCE、HSP90/antiHSP90/g-C3N4-F127-Au/GCE的電化學性能進一步檢測：配制pH＝7的PBS溶液(含有0.1mol/L KCl)，其中檢測的掃描速率為100mV/s，掃描范圍是0.2～0.8V。圖5中曲線a是玻碳電極表面修飾了g-C3N4-F127-Au的LSV圖，由于g-C3N4-F127-Au具有良好的導電性，因此電流較大，曲線b是antiHSP90/g-C3N4-F127-Au/GCE的LSV圖，由于抗體的導電能力較差，電流信號降低，曲線c即HSP90/HSP90α/g-C3N4-F127-Au/GCE的LSV圖，相比于曲線a和曲線b更加低，說明HSP90能夠被特異結合到HSP90α/g-C3N4-F127-Au/GCE，極大地增加了空間位阻，抑制了[Fe(CN)6]3-/4-的電子得失。我們構建的該傳感器電化學性能良好，對檢測HSP90有比較好的靈敏度。
利用本發明所述基于復合材料的免疫傳感器分別檢測Hb、Mb、HSP70和HSP90，結果見圖8。從圖8中可以看出本發明所述檢測方法檢測HSP90濃度時，對HSP90的靈敏度遠高于其他三個物質，說明該傳感器對于Hb、Mb和HSP70具有良好的抗干擾性。由于HSP70和HSP90都屬于HSP家族且分子量相近，說明本發明所述HSP90的檢測方法，檢測的精確度很高。
本發明所述基于復合材料的免疫傳感器檢測HSP90的方法，包括以下步驟：
(1)采用antiHSP90/g-C3N4-F127-Au/GCE電極為工作電極、飽和甘汞電極用作參比電極、Pt絲電極用作對電極，正確連接在電化學工作站上；電化學工作站用的是CHI660D(上海，中國)。
(2)建立檢測HSP90濃度的標準曲線：配制不同的濃度的HSP90，分別為0.049，0.097，0.24，0.49，0.97，1.70，2.43mM，滴在HSP90α/g-C3N4-F127-Au/GCE上，對其進行示差脈沖伏安掃描，記錄峰電流Ipa，將所述的峰電流Ipa與HSP90標準溶液濃度c繪制Ipa-c工作曲線，建立檢測HSP90濃度的標準曲線。計算得出線性方程為：Ipa(μA)＝8.73c(mg/mL)+6.29(R＝0.99)。分別見圖6和圖7。
(3)取鴨肉、豬肉以及鵝肉三種樣品分別進行分析儀器檢測和本發明所述電化學免疫傳感器檢測檢測，結果見下表：
所得數值均是每個樣品平行五次測定得到，并取其平均值。
由上表可見：本發明所述免疫傳感器測得的數據是與分析儀器中測得的數據結果相吻合。這些數據均說明了本發明所述免疫傳感器的靈敏度、準確度以及抗干擾性均較高，其用于檢測HSP90，檢測結果準確。
盡管本發明的實施方案已公開如上，但其并不僅僅限于說明書和實施方式中所列運用，它完全可以被適用于各種適合本發明的領域，對于熟悉本領域的人員而言，可容易地實現另外的修改，因此在不背離權利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發明并不限于特定的細節和這里示出與描述的圖例。
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