本發明涉及一種次黃嘌呤的檢測方法。
背景技術：
：魚肉中含有容易被人體所消化吸收的蛋白質，并且這些蛋白質的含量有很多。蛋白質不僅含量多，其中還含有人體所需的不同種類氨基酸，亮氨酸和賴氨酸是人體需求最多魚中含有量也豐富的兩大氨基酸。魚肉是所有肉類中最容易消化的，消化繼而被人體吸收的轉化率能夠達到90％。魚肉中的脂肪含量相對較低，與畜肉相比，含量只在1％-10％。魚肉中的脂肪也是很容易被人們消化吸收的，它呈中性，人們的消化率能夠接近百分之百。無機鹽也是魚肉中含量非常豐富的，不僅在于它的含量比畜肉多十到五十倍之間，種類也高達十種以上。更為重要的是人體必不可少的微量元素也儲存在魚肉當中。魚肝是魚中的脂肪，這類脂肪中維生素A和維生素D的含量很多，與畜肉的含量相比，更勝的不只一籌。魚類新鮮度的檢測關系到魚制品的安全衛生和營養程度各個方面，在魚制品的加工制作買賣過程中有至高無上的作用。魚類早期從新鮮到次新鮮再到腐敗這一系列的變化過程中，次黃嘌呤的含量是不斷上升的，魚類在腐敗以前都可以用次黃嘌呤的含量檢測魚的新鮮度。如今，用來檢測水產品新鮮程度的方式，大部分為傳統檢測。其中有人們容易從外觀著手的感官評價，也有需要相關儀器藥品，由專業檢測人員驗證的微生物檢測和化學指標測定。如果將這三種方法同時用到水產品新鮮度的檢測中，結果理論來說會準確。可是，如此將會花費大量的人力物力和時間。跟傳統的檢測方法相比，諸如生物傳感器、新鮮度指示卡、電子舌、電子鼻這些能夠快速方便的方式的研究也如雨后春筍一般，但在實地應用層面卻并不多見。水產品新鮮度的檢測方法大致可以分為：人體感官層次上的測試、物理方面的測試、化學方面的測試等。其中物理檢測有激光檢測、僵硬指數測試，化學檢測有很多，比如pH值檢測、k值測定、揮發性鹽基氮的測定和丙二醛的測定等。過去人們用于檢測魚類新鮮度的一些方法的實驗儀器設備昂貴，操作方法需要專業人員進行專業作業，時間及人員的付出上不可估量，推行的難度較大。技術實現要素：本發明目的是提供一種易操作、完成速度快、易廣泛推廣的檢測魚中次黃嘌呤含量的方法。為達到上述目的，本發明的一種檢測魚中次黃嘌呤含量的方法是按下述步驟進行的：步驟一、取魚肉研磨至泥狀，離心取上清液，用過濾膜過濾后去除沉淀蛋白；步驟二、然后離心取上清液，用辣根過氧化物酶和黃嘌呤氧化酶偶聯催化，再用紫外分光光度計進行檢測獲取次黃嘌呤的含量。進一步限定：步驟一中取5g魚肉研磨。步驟一中所述去除沉淀蛋白是按下述步驟制備的：向用過濾膜過濾的濾液中加入0.1mL10％(質量)三氯醋酸，攪拌混勻。步驟二中偶聯催化是：向上清液中依次加入3mL的苯酚、3mL4-氨基安替比林、3mLTris-HCL緩沖液(pH8.0)、3mL疊氮鈉和3mL辣根過氧化物酶，加100μL黃嘌呤氧化酶和10mL樣品液，置于37℃的恒溫水浴鍋內保溫8min，然后煮沸2min后加入1mL濃度為71.389mg/mL的Na2CO3溶液，放入冰水中冷卻，用紫外分光光度計測量。步驟二中紫外分光光度計測量波長為508nm。本發明中酶測定法原理：次黃嘌呤在進行一系列化學反應的過程中，是在黃嘌呤氧化酶的作用下，伴著1mol分子氧和1mol水的情況下，生成了1mol尿酸和1mol過氧化氫。過氧化氫在辣根過氧化物酶的作用下，分解的產物，能夠讓4-氨基安替比林與苯酚反應，生成一種化合物，這種化合物是亞醌類化合物，能顯出紅色。在整個反應中，黃嘌呤氧化酶和辣根過氧化物酶充足的前提下，由紅色化合物測定出的吸光度值大小(可見光范圍內)，就可以推測出樣品中次黃嘌呤的含量。本發明的方法簡單，完成速度快，設計合理，準確度高，數據參考性強，操作容易，無須特制實驗儀器，即使用現有檢測儀器就能達到檢測目的，有利于大面積推廣和使用。本發明用于判斷魚的新鮮度。本發明通過檢測鯽魚中次黃嘌呤的含量來判斷魚肉的新鮮度，實現了對魚肉新鮮度的準確判定。本發明對鯽魚早期品質新鮮度變化的檢測，有助于鯽魚新鮮度變化的及時發現。具體實施方式實施例1：本實施例中檢測魚中次黃嘌呤含量的方法是按下述步驟進行的：步驟一、固體放入小號離心管，加蒸餾水，放入圓槽中，在其對稱位置放入同樣型號的魚類處理：把魚洗干凈，剪去魚鰓魚尾，剪成小塊，取5g魚肉，用研缽充分研磨至泥狀后，將離心管，并添加一樣多的蒸餾水，保證對稱位置重量平衡的前提下，打開低速離心機開關，設置成5000r/min，10min離心，之后用塑料吸管提取上清液到注射器中，蓋上過濾膜擠壓過濾10mL至燒杯，按壓過程中若發現出液體速率下降，及時更換新的過濾膜。在過濾好的液體中，用塑料滴管加入10％三氯醋酸0.1mL，拿玻璃棒攪拌，混勻沉淀蛋白。步驟二、然后倒入新的小號離心管中，添加同樣多的蒸餾水，用同樣的方法放置對側的小號離心管，放入低速離心機5000r/min低速離心20min，用塑料吸管取上清液到試管用進行紫外分光光度計法檢驗；紫外分光光度計法：在試管中用各自的10mL吸量管和洗耳球依次加入3mL的苯酚、3mL4-氨基安替比林、3mLTris-HCL緩沖液(pH8.0)、3mL疊氮鈉、3mL辣根過氧化物酶，用移液槍和無菌槍頭加100μL黃嘌呤氧化酶，酶液濃度為0.32U·mL-1，及10mL的上層清液。提前打開恒溫水浴鍋定在37℃預熱，將試管中的液體混勻，待水浴鍋達到37℃后，放置在恒溫水浴鍋中計時保溫8min。同時，將800mL的燒杯中加入足夠沒過試管中液體水平面的水，打開電熱套，加熱水至沸騰后把試管放入其中，煮沸2min終止反應，改成用塑料滴管加入Na2CO3溶液1mL即可，之后立即用手套將試管轉移放入冰水中冷卻。完成上述步驟后，可打開電腦及紫外分光光度計，讓其自檢合格后，以不加入次黃嘌呤的蒸餾水做參比溶液，把比色皿洗凈，用擦鏡紙將玻璃面擦拭干凈，倒入相應濃度的溶液潤洗2-3次。用定波長檢測方式，在電腦上將檢測波長調至508nm，讓其調零自檢后，將參比溶液放入紫外分光光度計中，保證鏡面可以通過光束照射，蓋好樣品室蓋，按下“Autozero”按鈕，儀器自動進行校準(校準工作只需要在第一次測量時進行，只要不改編參比溶液和測量波長范圍的情況下，只需校準一次)，在樣品池放入樣品液，單機“測量”命令按鈕，進行測量工作。表1次黃嘌呤檢測梯度的測試判斷依據新鮮魚類：次黃嘌呤≤3.6×10-4g/5g；次新鮮魚類:3.6×10-4g/5g<次黃嘌呤≤5.9×10-4g/5g；腐敗魚類:黃嘌呤>5.9×10-4g/5g。下述實驗驗證發明效果：1不同濃度次黃嘌呤溶液吸光度檢測表2.次黃嘌呤濃度為0.02mmol/L情況下吸光度值次數12345平均值Abs0.05400.05420.05410.05390.05380.0540表3.次黃嘌呤濃度為0.04mmol/L情況下吸光度值次數12345平均值Abs0.05960.05930.05950.05920.05940.0594表4.次黃嘌呤濃度為0.06mmol/L情況下吸光度值次數12345平均值Abs0.06410.06390.06390.06380.06380.0639表5.次黃嘌呤濃度為0.08mmol/L情況下吸光度值次數12345平均值Abs0.15210.15200.15190.15220.15230.1521表6.次黃嘌呤濃度為0.1mmol/L情況下吸光度值次數12345平均值Abs0.17150.17170.17190.17170.17170.1717表7.次黃嘌呤濃度為0.12mmol/L情況下吸光度值2雙酶法偶聯分光光度計測魚中次黃嘌呤表8.魚肉重量1號2號3號4號燒杯重量(g)97.596.598.598.4總重量(g)162.8172167.8167.7魚肉重量(g)65.375.569.369.3儲存溫度冷凍-18℃冷藏4度℃15℃30℃表9.30℃時，魚的新鮮程度。表10.15℃時，魚的新鮮程度。表11.4℃時，魚的新鮮程度魚類在不同儲存溫度下新鮮度的變化是不同的，30℃的魚腐敗的最快，其次是15℃的魚，然后是4℃的魚，最后是-18℃的魚。30℃保存條件下，6h內是新鮮的，10h內是次新鮮的，12h以上就腐敗了。15℃保存條件下，9h內是新鮮的，15h內是次新鮮的，18h以上就腐敗了。4℃保存條件下，8h內是新鮮的，16h內是次新鮮的，24h以上就腐敗了。-18℃保存條件下，儲存的時間會相對長一些，2個月的魚肉仍可食用。為了方便人們即使食用健康的魚還可以得出以下結論：30℃實驗組：夏天買完鮮活魚類沒有即使食用，室外儲存魚類時，應在10小時之前盡快食用。若超過10小時依舊沒有食用此魚，之后就不要再食用此魚。15℃實驗組：春秋天買完鮮活魚類沒有即使食用，室外儲存魚類時，應在15小時之前盡快食用。若超過15小時依舊沒有食用此魚，之后就不要再食用此魚。4℃實驗組：冬天以及儲存在冰箱冷藏室的鮮活魚類沒有即使食用，應在16小時之前盡快食用。若超過16小時依舊沒有食用此魚，之后就不要再食用此魚。-18℃實驗組：使用冰箱冷凍室保存鮮活魚類沒有即使食用的情況下，2個月之內都可放心食用。上述實驗用準確的數據提示人們在購買完鮮活魚類的儲存中不要超出相應的天數，為人們可以更加健康的食用魚類具有指導意義。本發明的檢測方式簡單，完成速度快，數據參考性強的方向：檢測方式簡單是要人們能夠更容易的操作，普通人也能把握技術要領，讓檢測魚類的行為大眾化。完成速度快是說檢測的方法時間不要過長，能夠讓人在短時間內就得出魚類是何種新鮮程度的結論。數據參考性強是說測出的數據要能準確的反應魚類的新鮮程度，讓檢測具有權威性。本發明不破壞食材的無損化方向：從前的實驗技術都是需要提取相應的魚肉，對提取下來的魚肉做進一步的檢驗。而現在要發展的方向是提取更少的魚肉，或者說是不用提取魚肉就能夠完成實驗的測量，得出可靠的結論。讓樣品在檢測的過程中損失的盡量少。本發明更商品化、實用化方向：現在很多檢測魚類新鮮程度的實驗方法都需要在實驗室中，有相應的實驗器材才能完成實驗測量，實驗設備的價格也會相對偏高。而將來的檢測不是說讓實驗儀器消失，而是說實驗儀器盡可能的變小變便宜，能夠方便人們隨時及時的測量。讓檢測的機器能成為人們手中的商品，讓人們為了能提高魚類食用質量去進行魚類新鮮度的檢測。當前第1頁1 2 3