一種人ABO血型反定型膠體金試紙條及其制備方法和應用與流程

本發明屬于血型檢測領域，具體的涉及一種人ABO血型反定型膠體金試劑條及其制備方法。

背景技術：

ABO血型系統是根據紅細胞表面有無特異性抗原A和B來劃分血液類型系統。其將血型分為O、A、B及AB血型。A型血紅細胞上含A抗原，血清中含抗B抗體；B型血紅細胞上含B抗原，血清中含抗A抗體；O型血紅細胞上則沒有A和B抗原，血清中含抗A和抗B抗體；AB型血紅細胞上含A和B兩種抗原，血清中則不含抗A和抗B抗體。A抗原和抗A抗體，B抗原和抗B抗體會發生免疫結合反應，使紅細胞發生凝聚。

ABO血型是由紅細胞表面抗原和血清中的抗體兩者共同決定的。利用標準的抗A及抗B抗體檢測紅細胞抗原，稱之為正定型；用標準的A及B抗原檢測血清中的抗體，稱之為反定型。正反定型同時檢測，才能正確判斷ABO血型。

正確的血型鑒定是保證臨床輸血安全和搶救生命的重要工作，ABO血型檢測是常規的輸血前血型血清學檢測項目之一，為了保證正確的血型鑒定，衛生部在2000年發文(衛醫法[2000]184號)明確規定：每位供血及受血的個體均要進行ABO血型正反定型。

目前臨床實驗室最常用的ABO血型反定型的鑒定方法是血凝試驗和微柱凝膠試驗。血凝試驗具有技術要求高，主觀性強，易出現差錯，成本高等缺點，同時，用到的標準A型、B型和O型紅細胞保存期短，且容易發生微生物污染及溶血現象。微柱凝膠法檢測時則需要特制的凝膠卡，同時需配備專用離心機，檢測成本較高。

膠體金技術是二十世紀八十年代后期發展起來的高科技技術。膠體金是由氯金酸(HAuCl4)在還原劑如白磷、抗壞血酸、枸櫞酸鈉等作用下，聚合成為特定大小的金顆粒，并由于靜電作用成為一種穩定的膠體狀態，稱為膠體金。根據膠體金的一些物理性狀，如高電子密度、顆粒大小、形狀及顏色反應，加上結合物的免疫和生物學特性，因而使膠體金廣泛地應用于免疫學、組織學、病理學和細胞生物學等領域。

目前，急需一種使用方便、有效期長、準確性好、成本較低的檢測ABO血型的鑒定方法。

技術實現要素：

本發明的目的是提供一種使用方便、有效期長、便于保存和運輸、準確性好、成本較低的檢測ABO血型反定型的膠體金試劑條。

本發明的另一目的是提供一種檢測ABO血型反定型的膠體金試劑條的制備方法。

本發明采用的技術方案是：一種人ABO血型反定型膠體金試紙條，由底板、樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜和吸水紙組成；底板中部鋪設一層硝酸纖維素膜，在底板的入樣端設有樣品墊和膠體金墊，膠體金墊的兩端分別與樣品墊和硝酸纖維素膜搭接，硝酸纖維素膜的檢測區上設有A抗體顯色帶、B抗體顯色帶和質控帶；底板的出樣端設有吸水紙，吸水紙端部與硝酸纖維素膜的端部搭接；所述的膠體金墊是，將膠體金試劑與人血型A抗原蛋白和人血型B抗原蛋白混合均勻后，吸附在玻璃纖維上制得；所述的A抗體顯色帶上吸附有人血型抗A抗體；所述的B抗體顯色帶上吸附有人血型抗B抗體；所述的質控帶上設有人血型抗A抗體和人血型抗B抗體雙抗體。

上述的一種人ABO血型反定型膠體金試紙條，所述的人血型A抗原蛋白和人血型B抗原蛋白是天然提取的人血型A抗原蛋白和人血型B抗原蛋白，或者是基因重組的人血型A抗原蛋白和人血型B抗原蛋白。

上述的一種人ABO血型反定型膠體金試紙條，所述的基因重組的人血型A抗原蛋白的DNA序列如SEQ ID NO.1所示；所述的基因重組的人血型B抗原蛋白的DNA序列如SEQ IDNO.2所示。

上述的一種人ABO血型反定型膠體金試紙條，所述的基因重組的人血型A抗原蛋白和基因重組的人血型B抗原蛋白的制備方法如下：

1)提取人全血中的總DNA；

2)以DNA為模板，通過設計的特異性引物，利用PCR方法擴增，分別得到A抗原

PCR擴增產物或B抗原PCR擴增產物；其中，所述的特異性引物是：

上游引物PA1：5'-ATGGAGCCCC CGGACGCACC-3'；

下游引物PA2：5'-AGTCGTGAGC AGAGGCTTCG-3'；

上游引物PB1：5'-ATGGAGCCCC CGGACGCACC-3'；

下游引物PB2：5'-AGTCGTGAGC AGAGGCTTCG-3'；

3)將得到的A抗原PCR擴增產物和B抗原PCR擴增產物分別與質粒pMD18-T進行T克隆，得到重組質粒pMD18-T/A和pMD18-T/B；

4)將重組質粒pMD18-T/A及pMD18-T/B分別和表達載體pUCm-4T-1同時進行BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切，連接，分別制得重組表達載體pUCm-4T-1/A或pUCm-4T-1/B；

5)將重組表達載體pUCm-4T-1/A或pUCm-4T-1/B分別轉化到Ecoli.BL21表達宿主菌中，篩選陽性表達菌株；

6)將篩選的含重組表達載體pUCm-4T-1/A的陽性表達菌株或含重組表達載體pUCm-4T-1/B的陽性表達菌株，經誘導表達，純化后，得到基因重組的人血型A抗原蛋白和人血型B抗原蛋白。

上述的一種人ABO血型反定型膠體金試紙條，步驟2)中，

PCR反應體系為：20μL體系：Mg²⁺1.5mmol/L，dNTP 0.2mmol/L，Taq酶1U，引物各5pmol/L，樣品DNA 100～200ng，超純水余量；

PCR反應程序為：95℃10min；94℃20s，63℃30s，72℃lmin，進行10個循環；94℃20s，60℃30s，72℃1min，進行25個循環；72℃延伸5min；4℃保存。

上述的一種人ABO血型反定型膠體金試紙條，步驟6)中，所述的誘導表達是：將篩選的含重組表達載體pUCm-4T-1/A的陽性表達菌株或含重組表達載體pUCm-4T-1/B的陽性表達菌株，接種于LB培養基中，37℃過夜培養，次日按1:100擴大培養至菌液OD600nm＝0.6時，于菌液中加入IPTG至終濃度為0.4mmol/L，37℃誘導12h。

上述的一種人ABO血型反定型膠體金試紙條，步驟6)中，所述的純化是：將誘導表達后的菌液，以12000r/min離心10min，富集菌體，菌體用20mmol/L pH為8.0的Tris-HCl緩沖液，按1:10的體積比，重懸菌體，冰浴超聲破碎至菌懸液澄清，4℃，12000r/min離心10min，收集上清液，上清液中加入SDS loading buffer，取沉淀物，沉淀物用尿素溶解，8000r/min離心10min，收集上清液，上清液再加入SDS loading buffer，煮沸10min，10000r/min離心10min，得純化的基因重組的人血型A抗原蛋白和基因重組的人血型B抗原蛋白。

上述的一種人ABO血型反定型膠體金試紙條的制備方法，方法如下：

1)將氯金酸與還原劑枸櫞酸鈉混合，于沸騰狀態下，攪拌30分鐘，調節pH為5.5，得膠體金試劑；將膠體金試劑與人血型A抗原蛋白和人血型B抗原蛋白混合均勻后，吸附在玻璃纖維上，制得膠體金墊，備用；

2)在硝酸纖維素膜的檢測區上，將混合均勻的人血型抗A抗體滴加于A抗體顯色帶上；將混合均勻的人血型抗B抗體滴加于B抗體顯色帶上；將人血型抗A抗體和人血型抗B抗體雙抗體滴加于質控帶上；制得硝酸纖維素膜，備用；

3)先在底板上鋪設硝酸纖維素膜，然后在樣品的入樣端，先鋪設膠體金墊，膠體金墊的一端與硝酸纖維素膜搭接，另一端搭接樣品墊，再將樣品墊與底板連接；

4)在樣品的出樣端，鋪設吸水紙，吸水紙的一端與硝酸纖維素膜搭接。

上述的一種人ABO血型反定型膠體金試紙條在反定型檢測人ABO血型中的應用。方法如下：將待測血液樣品滴加于樣品墊上，隨著虹吸作用，血液樣品向前泳動，與膠體金墊上的人血型A抗原蛋白或人血型B抗原蛋白反應，繼續前行，根據在A抗體顯色帶和/或B抗體顯色帶上的顯色，判斷待測血液樣品的血型，質控帶必須顯色，否則檢測失效。

本發明的原理是：血清樣品中所含的A、B抗體與試紙條上的膠體金標記的抗原發生特異性結合，形成攜帶膠體金的抗原-抗體*膠體金復合物，在層析作用下，樣品中相應的抗原-抗體*膠體金復合物繼續泳動至硝酸纖維素膜的檢測區，被檢測區抗體捕獲，可以進一步形成抗體-抗原-抗體*膠體金雙抗體夾心復合物，并在檢測線上聚積顯現出一條可見的顯色反應。如樣品中沒有待測抗原或抗體，則不發生結合，即不顯色。在硝酸纖維素膜檢測區附近再固定上針對金標結合物相應的抗體作為質控帶，無論樣品中有無待測物，質控帶應都顯示，若無，則檢測失敗。

本發明的有益效果是：本發明制備的快速檢驗血型的膠體金試紙條，不僅可檢測血液中的抗體，也可檢測陳舊血跡、唾液等中的抗體。本發明整個檢測過程不超過5分鐘，快速準確，靈敏度高，特異性強，不需要其它儀器設備，技術要求低。

附圖說明

圖1為本發明的結構示意圖。

圖2為本發明基因重組的人血型A抗原蛋白基因與人血型B抗原蛋白基因的RT-PCR產物鑒定圖。

圖3為本發明PMD18-T/A與PMD18-T/B質粒的PCR鑒定圖。

圖4為本發明PMD18-T/A與PMD18-T/B質粒的酶切圖。

圖5為本發明pUCm-4T-1/A與pUCm-4T-1/B質粒的PCR鑒定圖。

圖6為本發明pUCm-4T-1/A和pUCm-4T-1/B質粒的酶切鑒定圖。

具體實施方式

下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。

實施例1一種人ABO血型反定型膠體金試紙條

如圖1所示，一種人ABO血型反定型膠體金試紙條，由底板(1)、樣品墊(2)、膠體金墊(3)、硝酸纖維素膜(5)和吸水紙(4)組成。

底板(1)中部鋪設一層硝酸纖維素膜(5)，硝酸纖維素膜(5)的檢測區上設有A抗體顯色帶(5-1)、B抗體顯色帶(5-2)和質控帶(5-3)。所述的A抗體顯色帶(5-1)上吸附有人血型抗A抗體；所述的B抗體顯色帶(5-2)上吸附有人血型抗B抗體；所述的質控帶(5-3)上吸附有人血型抗A抗體和人血型抗B抗體雙抗體。

在底板(1)的入樣端設有樣品墊(2)和膠體金墊(3)，膠體金墊(3)的兩端分別與樣品墊(2)和硝酸纖維素膜(5)搭接。

所述的膠體金墊(3)是，將膠體金試劑與人血型A抗原蛋白和人血型B抗原蛋白混合均勻后，吸附在玻璃纖維上制得。

所述的人血型A抗原蛋白和人血型B抗原蛋白可以選用天然提取的人血型A抗原蛋白和人血型B抗原蛋白。

所述的人血型A抗原蛋白和人血型B抗原蛋白也可以選用基因重組的人血型A抗原蛋白和人血型B抗原蛋白。所述的基因重組的人血型A抗原蛋白的DNA序列如SEQ ID NO.1所示；所述的基因重組的人血型B抗原蛋白的DNA序列如SEQ ID NO.2所示。

底板(1)的出樣端設有吸水紙(4)，吸水紙(4)端部與硝酸纖維素膜(5)的端部搭接。

實施例2一種人ABO血型反定型膠體金試紙條的制備方法

方法如下：

Trizol plus，PrimeScriptTMRT-PCR試劑盒，Prime STAR PCR Mix，DL2000Marker、DL5000 Marker，ligation mix連接試劑盒，BamHI、XhoI限制性內切酶，IPTG等試劑購于寶生物工程(大連)有限公司。

質粒抽提試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒等購自OMEGA。

(一)基因重組的人血型A抗原蛋白

1.提取人全血中的總DNA

收集4例中國漢族無償捐血者，根據血庫操作規程，采集靜脈全血，運用快速鹽析法，從全血白膜層抽提基因組DNA，作為DNA模板。

2.PCR擴增

1)引物設計

根據Genbank登錄號為AY845133的A抗原全基因序列，設計擴增A抗原基因DNA片段的特異性引物，在上下游引物的末端同時引入BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切位點，預期的擴增片段長度約為1887bp。經設計擴增A抗原基因的特異性引物如下：

上游引物PA1：5'-ATGGAGCCCC CGGACGCACC-3'；

下游引物PA2：5'-AGTCGTGAGC AGAGGCTTCG-3'；

2)PCR擴增

以DNA為模板，通過設計的特異性引物，利用PCR方法擴增，得到A抗原PCR擴增產物。

PCR反應體系為：20μL體系：Mg²⁺1.5mmol/L，dNTP 0.2mmol/L，Taq酶1U，引物各5pmol/L，樣品DNA 100～200ng，超純水余量。

PCR反應程序為：95℃10min；94℃20s，63℃30s，72℃lmin，進行10個循環；94℃20s，60℃30s，72℃1min，進行25個循環；72℃延伸5min；4℃保存。

3)RT-PCR產物的檢測

電泳鑒定擴增片段，于2％瓊脂糖凝膠上檢測擴增產物，電壓為10v/cm，電泳20min左右。使用DNA分子標記DL2000(TAKARA,大連寶生物)標記目的片段長度，結果如圖2所示，由圖2可見，擴增片段為1887bp，與預期相符。

4)PCR特異片段的回收和純化

使用MontageTM PCR Centrifugal Filter Devices試劑盒(MILLIPORE公司)對擴增產物回收和純化。

3.構建重組表達載體

1)進行T克隆，構建重組質粒PMD18-T/A

將鑒定正確的PCR特異片段按DNA膠回收試劑盒說明書純化回收產物，將膠回收產物末端加A，方法：普通2×Taq酶Mix 2.5μL，膠回收產物7.5μL，混勻，72℃延伸30min，得加A后的目的片段。

加A后的目的片段與載體pMD18-T的連接反應在離心管中進行。連接反應體系為：

混勻后，16℃水浴反應2～4h或者過夜，得連接產物-重組質粒pMD18-T/A。

將5μL重組質粒PMD18-T/A轉入DH5a感受態細胞中，緩慢吹打混勻，冰上放置30min；42℃熱激90s，冰浴2min，加入445μL LB液體培養基，37℃200～250r/min振蕩培養1h，4000r/min離心2min，混勻；將菌液均勻地涂布于含有抗生素的LB瓊脂平板上，待菌液被吸收后置于37℃恒溫箱過夜培養到單個菌落出現；挑菌，37℃300r/min振蕩培養過夜。

菌液PCR篩選陽性克隆：以變渾濁的菌液為模板，PCR擴增A基因。產物用1％瓊脂糖凝膠電泳檢查擴增結果。

重組質粒的酶切鑒定：按照質粒抽提試劑盒(OMEGA)操作步驟進行質粒抽提，經BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定，酶切體系：10×buffer1μl，BamHⅠ0.5μl，XhoⅠ0.5μl，重組質粒8μl。37℃酶切1.5h，酶切產物用1％瓊脂糖電泳鑒定，結果如圖3和圖4所示。

鑒定結果：由圖3和圖4可見，A基因連接至T-Vector后，經PCR及酶切鑒定后A基因長度為1887bp，得到了預期的條帶。

2)構建重組表達載體pUCm-4T-1/A

將重組質粒PMD18-T/A和表達載體pUCm-4T-1同時進行BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切，連接，制得重組表達載體pUCm-4T-1/A。

連接反應體系：目的基因片段5.5μl，表達載體2μl，2×T4DNA Ligase Mix 7.5μl。瞬離，混勻，16℃連接過夜。

重組表達載體pUCm-4T-1/A的轉化和鑒定方法與T克隆步驟中的轉化和鑒定的方法相同，最后測序確認，結果如圖5和圖6。

鑒定結果：將A基因克隆至pUCm-4T-1載體，經PCR及酶切鑒定后均得到預期的條帶，重組質粒pUCm-4T-1/A中A的長度為1887bp，圖5中M：DL2000Marker。pUCm-4T-1/A的BamHⅠ或XhoⅠ酶切產物，圖6中M：DL5000Marker。pUCm-4T-1/A測序結果通過NCBI上Blastn同源性比對分析表明，載體中插入的基因片段大小為1887bp，與預期一致，表明重組表達載體構建成功。

4.轉化

將重組表達載體pUCm-4T-1/A轉化到Ecoli.BL21表達宿主菌中，篩選陽性表達菌株。

5.誘導表達

將篩選的含重組表達載體pUCm-4T-1/A的陽性表達菌株，接種于LB培養基中，37℃過夜培養，次日按1:100擴大培養至菌液OD600nm＝0.6時，于菌液中加入IPTG至終濃度為0.4mmol/L，37℃誘導12h。

6.純化

將誘導表達后的菌液，以12000r/min離心10min，富集菌體，菌體用20mmol/L pH為8.0的Tris-HCl緩沖液，按1:10的體積比，重懸菌體，冰浴超聲破碎至菌懸液澄清，4℃，12000r/min離心10min，收集上清液，取上清液80ul，加入20ul 5×SDS loading buffer，取沉淀物，沉淀物用1ml 8M尿素溶解，8000r/min離心10min，收集上清液，取80ul上清液加入20ul 5×SDS loading buffer，煮沸10min，10000r/min離心10min，得到基因重組的人血型A抗原蛋白。

產物經大連寶生物檢測，其DNA序列如SEQ ID NO.1所示。

(二)基因重組的B抗原蛋白

1)提取人血中的總DNA

收集4例中國漢族無償捐血者，根據血庫操作規程，采集靜脈全血，運用快速鹽析法，從全血白膜層抽提基因組DNA，作為DNA模板。

2)PCR擴增

1、引物設計

根據Genbank登錄號為AY845133的B抗原全基因序列，設計擴增B抗原基因DNA片段的特異性引物，在上下游引物的末端同時引入BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切位點，預期的擴增片段長度約為188bp。經設計擴增B抗原基因的特異性引物如下：

上游引物PB1：5'-ATGGAGCCCC CGGACGCACC-3'；

下游引物PB2：5'-AGTCGTGAGC AGAGGCTTCG-3'；

2、PCR擴增

以DNA為模板，通過設計的特異性引物，利用PCR方法擴增，得到B抗原PCR擴增產物。

PCR反應體系為：20μL體系：Mg²⁺1.5mmol/L，dNTP 0.2mmol/L，Taq酶1U，引物各5pmol/L，樣品DNA 100～200ng，超純水余量；

PCR反應程序為：95℃10min；94℃20s，63℃30s，72℃lmin，進行10個循環；94℃20s，60℃30s，72℃1min，進行25個循環；72℃延伸5min；4℃保存。

3、RT-PCR產物的檢測

電泳鑒定擴增片段，于2％瓊脂糖凝膠上檢測擴增產物，電壓為10v/cm，電泳20min左右。使用DNA分子標記DL2000(TAKARA,大連寶生物)標記目的片段長度，結果如圖2所示，由圖2可見，擴增片段為1887bp，與預期相符。

4、PCR特異片段的回收和純化

使用MontageTM PCR Centrifugal Filter Devices試劑盒(MILLIPORE公司)對擴增產物回收和純化。

3)構建重組表達載體

1.進行T克隆，構建重組質粒PMD18-T/B

將鑒定正確的PCR特異片段按DNA膠回收試劑盒說明書純化回收產物，將膠回收產物末端加A，方法：普通2×Taq酶Mix 2.5μL，膠回收產物7.5μL，混勻，72℃延伸30min，得加A后的目的片段。

加A后的目的片段與載體pMD18-T的連接反應在離心管中進行。連接反應體系為：

混勻后，16℃水浴反應2～4h或者過夜，得連接產物-重組質粒PMD18-T/B。

將5μL重組質粒PMD18-T/B轉入DH5a感受態細胞中，緩慢吹打混勻，冰上放置30min；42℃熱激90s，冰浴2min，加入445μL LB液體培養基，37℃200～250r/min振蕩培養1h，4000r/min離心2min，混勻；將菌液均勻地涂布于含有抗生素的LB瓊脂平板上，待菌液被吸收后置于37℃恒溫箱過夜培養到單個菌落出現；挑菌，37℃300r/min振蕩培養過夜。

菌液PCR篩選陽性克隆：以變渾濁的菌液為模板，PCR擴增B基因。產物用1％瓊脂糖凝膠電泳檢查擴增結果。

重組質粒的酶切鑒定：按照質粒抽提試劑盒(OMEGA)操作步驟進行質粒抽提，經BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定，酶切體系：10×buffer1μl，BamHⅠ0.5μl，XhoⅠ0.5μl，重組質粒8μl。37℃酶切1.5h，酶切產物用1％瓊脂糖電泳鑒定，結果如圖3和圖4所示。

鑒定結果：由圖3和圖4可見，B基因連接至T-Vector后，經PCR及酶切鑒定后B基因長度為1887bp，得到了預期的條帶。

2.構建重組表達載體pUCm-4T-1/B

將重組質粒PMD18-T/B和表達載體pUCm-4T-1同時進行BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切，連接，制得重組表達載體pUCm-4T-1/B。

連接反應體系：目的基因片段5.5μl，表達載體2μl，2×T4DNA Ligase Mix 7.5μl。瞬離，混勻，16℃連接過夜。

重組表達載體pUCm-4T-1/B的轉化和鑒定方法與T克隆步驟中的轉化和鑒定的方法相同，最后測序確認，結果如圖5和圖6。

鑒定結果：將B基因克隆至pUCm-4T-1載體，經PCR及酶切鑒定后均得到預期的條帶，重組質粒pUCm-4T-1/B中B的長度為1887bp，圖5中M：DL2000Marker。pUCm-4T-1/B的BamHⅠ或XhoⅠ酶切產物，圖6中M：DL5000Marker。pUCm-4T-1/B測序結果通過NCBI上Blastn同源性比對分析表明，載體中插入的基因片段大小為1887bp，與預期一致，表明重組表達載體構建成功。

4)轉化

將重組表達載體pUCm-4T-1/B轉化到Ecoli.BL21表達宿主菌中，篩選陽性表達菌株。

5)誘導表達

將篩選的含重組表達載體pUCm-4T-1/B的陽性表達菌株，接種于LB培養基中，37℃過夜培養，次日按1:100擴大培養至菌液OD600nm＝0.6時，于菌液中加入IPTG至終濃度為0.4mmol/L，37℃誘導12h。

6)純化

將誘導表達后的菌液，以12000r/min離心10min，富集菌體，菌體用20mmol/L pH為8.0的Tris-HCl緩沖液，按1:10的體積比，重懸菌體，冰浴超聲破碎至菌懸液澄清，4℃，12000r/min離心10min，收集上清液，取上清液80ul，加入20ul 5×SDS loading buffer，取沉淀物，沉淀物用1ml 8M尿素溶解，8000r/min離心10min，收集上清液，取80ul上清液加入20ul 5×SDS loading buffer，煮沸10min，10000r/min離心10min，得到基因重組的人血型B抗原蛋白。

產物經大連寶生物檢測，其DNA序列如SEQ ID NO.2所示

(三)制備膠體金墊

將氯金酸與還原劑枸櫞酸鈉混合，于沸騰狀態下，攪拌30分鐘，制得粒徑大小為40nm～60nm的膠體金顆粒溶液，調節pH至5.5，制得膠體金試劑；然后加入基因重組的人血型A抗原蛋白和人血型B抗原蛋白，于室溫下，反應5分鐘，3000r/min離心3分鐘，棄上清，沉淀即為重組AB抗原金粒子，然后將重組AB抗原金粒子吸附在玻璃纖維上制得膠體金墊，備用；

(四)硝酸纖維素膜

兔抗A、B抗原多克隆抗體的制備

1)人重組A、B抗原經FCA或FIA充分乳化后。將抗原液與佐劑等比例混合后，置于混合器上使之劇烈振蕩使抗原充分乳化，振蕩后，1000rpm離心一分鐘，如水相和油相不分層即可注射。首次免疫用FCA，以后都用FIA。

2)免疫方法采用背部多點注射法。每次免疫的抗原量約100μg。免疫次數在四五次即可。

在硝酸纖維素膜的檢測區上，將混合均勻的人血型抗A抗體滴加于A抗體顯色帶(5-1)上；將混合均勻的人血型抗B抗體滴加于B抗體顯色帶(5-2)上；將人血型抗A抗體和人血型抗B抗體雙抗體滴加于質控帶(5-3)上；制得硝酸纖維素膜，備用；

(五)制備

1)先在底板上鋪設硝酸纖維素膜，然后在樣品的入樣端，先鋪設膠體金墊，膠體金墊的一端與硝酸纖維素膜搭接，另一端在搭接樣品墊，再將樣品墊與底板連接；

2)在樣品的出樣端，鋪設吸水紙，吸水紙的一端與硝酸纖維素膜搭接。

實施例3一種人ABO血型反定型膠體金試紙條的應用

(一)方法如下

采用實施例2制備的人ABO血型反定型膠體金試紙條。

將待檢血清樣品50ul滴加于樣品墊1上，等待3～5分鐘，隨著毛細作用，血液樣品上前移動，與膠體金墊上的人血型A抗原蛋白或人血型B抗原蛋白反應，繼續前行，根據在A抗體顯色帶(5-1)和/或B抗體顯色帶(5-2)上的顯色情況，判斷待測血液樣品的血型，控制線必須顯色，否則檢測失效。

(二)結果判定

B抗體顯色帶顯色，則是A型血；A抗體顯色帶顯色，則是B型血；A和B抗體顯色帶均顯色，則是O型血；A和B抗體顯色帶均不顯色，則是AB型血。但上述結果需質控帶均顯色才為有效結果，否則無效。

(三)檢測

1.穩定性：將新制備的ABO反定型免疫膠體金試劑置于37℃保存7d(相當于在2～8℃保存1年)，再測定特異性，外觀完好，無非特異性。

2.靈敏度：檢測稀釋度為0.1μg/L的抗-A、抗-B標準血清，經檢測，結果靈敏準確。

3.特異性：記錄結果出現的時間、反應5min時判斷血型，結果顯示，只能與相應的紅細胞抗體發生凝集，無非特異性凝集，結果準確率100％。

4.準確性：隨機收集已知血型的臨床常規標本，進行血型鑒定，計算準確率，達到100％。

5.精密性：精密性檢測要求同一樣本重復檢測10次，結果一致。

<110> 何偉

<120> 一種人ABO血型反定型膠體金試紙條及其制備方法和應用

<160> 2

<210> 1

<211> 1887

<212> DNA

<213> 基因重組A抗原蛋白

<400> 1

1 ATGGAGCCCC CGGACGCACC GGCCCAGGCG CGCGGGGCCC CGCGGCTGCT GTTGCTCGCA

61 GTCCTGCTGG CGGCGCACCC AGATGCCCAG GCGGAGGTGC GCTTGTCTGT ACCCCCGCTG

121 GTGGAGGTGA TGCGAGGAAA GTCTGTCATT CTGGACTGCA CCCCTACGGG AACCCACGAC

181 CATTATATGC TGGAATGGTT CCTTACCGAC CGCTCGGGAG CTCGCCCCCGCCTAGCCTCG

241 GCTGAGATGC AGGGCTCTGA GCTCCAGGTC ACAATGCACG ACACCCGGGG CCGAAGTCCC

301 CCATACCAGC TGGACTCCCA GGGGCGCCTG GTGCTGGCTG AGGCCCAGGT GGGCGACGAG

361 CGAGACTACG TGTGCGTGGT GAGGGCAGGG GCGGCAGGCA CTGCTGAGGC CACTGCGCGG

421 CTCAACGTGT TTGCAAAGCC AGAGGCCACT GAGGTCTCCC CCAACAAAGG GACACTGTCT

481 GTGATGGAGG ACTCTGCCCA GGAGATCGCC ACCTGCAACA GCGGGAACGG GAACCCGGCC

541 CCCAAGATCA CGTGGTATCG CAACGGGCAG CGCCTGGAGG TGCCCGTAGA GATGAACCCA

601 GAGGGCTACA TGACCAGCCG CACGGTCCGG GAGGCCTCGG GCCTGCTCTC CCTCACCAGC

661 ACCCTCTACC TGCGGCTCCG CAAGGATGAC CGAGACGCCA GCTTCCACTG CGCCGCCCAC

721 TACAGCCTGC CCGAGGGCCG CCACGGCCGC CTGGACAGCC CCACCTTCCA CCTCACCCTG

781 CACTATCCCA CGCAGCACGT GCAGTTCTGGGTGGGCAGCC CGTCCACCCC AGCAGGCTGG

841 GTACGCGAGG GTGACACTGT CCAGCTGCTC TGCCGGGGGG ACGGCAGCCC CAGCCCGGAG

901 TATACGCTTT TCCGCCTTCA GGATGAGCAG GAGGAAGTGC TGAATGTGAA TCTCGAGGGG

961 AACTTGACCC TGGAGGGAGT GACCCGGGGC CAGAGCGGGA CCTATGGCTG CAGAGTGGAG

1021 GATTACGACG CGGCAGATGA CGTGCAGCTC TCCAAGACGC TGGAGCTGCG CGTGGCCTAT

1081 CTGGACCCCC TGGAGCTCAG CGAGGGGAAG GTGCTTTCCT TACCTCTAAA CAGCAGTGCA

1141 GTCGTGAACT GCTCCGTGCA CGGCCTGCCC ACCCCTGCCC TACGCTGGAC CAAGGACTCC

1201 ACTCCCCTGG GCGATGGCCC CATGCTGTCG CTCAGTTCTA TCACCTTCGA TTCCAATGGC

1261 ACCTACGTAT GTGAGGCCTC CCTGCCCACA GTCCCGGTCC TCAGCCGCAC CCAGAACTTC

1321 ACGCTGCTGG TCCAAGGCTC GCCAGAGCTA AAGACAGCGG AAATAGAGCC CAAGGCAGAT

1381 GGCAGCTGGA GGGAAGGAGA CGAAGTCACA CTCATCTGCT CTGCCCGCGG CCATCCAGAC

1441 CCCAAACTCA GCTGGAGCCA ATTGGGGGGC AGCCCCGCAG AGCCAATCCC CGGACGGCAG

1501 GGTTGGGTGA GCAGCTCTCT GACCCTGAAA GTGACCAGCG CCCTGAGCCG CGATGGCATC

1561 TCCTGTGAAG CCTCCAACCC CCACGGGAAC AAGCGCCATG TCTTCCACTT CGGCACCGTG

1621 AGCCCCCAGA CCTCCCAGGC TGGAGTGGCC GTCATGGCCG TGGCCGTCAG CGTGGGCCTC

1681 CTGCTCCTCG TCGTTGCTGT CTTCTACTGC GTGAGACGCA AAGGGGGCCC CTGCTGCCGC

1741 CAGCGGCGGG AGAAGGGGGC TCCGCCGCCA GGGGAGCCAG GGCTGAGCCA CTCGGGGTCG

1801 GAGCAACCAG AGCAGACCGG CCTTCTCATG GGAGGTGCCT CCGGAGGAGC CAGGGGTGGC

1861 AGCGGGGGCTTCGGAGACGA GTGCTGA

<210> 2

<211> 1887

<212> DNA

<213> 基因重組B抗原蛋白

<400> 2

1 ATGGAGCCCC CGGACGCACC GGCCCAGGCG CGCGGGGCCC CGCGGCTGCT GTTGCTCGCA

61 GTCCTGCTGG CGGCGCACCC AGATGCCCAG GCGGAGGTGC GCTTGTCTGT ACCCCCGCTG

121 GTGGAGGTGA TGCGAGGAAA GTCTGTCATT CTGGACTGCA CCCCTACGGG AACCCACGAC

181 CATTATATGC TGGAATGGTT CCTTACCGAC CGCTCGGGAG CTCGCCCCCGCCTAGCCTCG

241 GCTGAGATGC AGGGCTCTGA GCTCCAGGTC ACAATGCACG ACACCCGGGG CCGCAGTCCC

301 CCATACCAGC TGGACTCCCA GGGGCGCCTG GTGCTGGCTG AGGCCCAGGT GGGCGACGAG

361 CGAGACTACG TGTGCGTGGT GAGGGCAGGG GCGGCAGGCA CTGCTGAGGC CACTGCGCGG

421 CTCAACGTGT TTGCAAAGCC AGAGGCCACT GAGGTCTCCC CCAACAAAGG GACACTGTCT

481 GTGATGGAGG ACTCTGCCCA GGAGATCGCC ACCTGCAACA GCCGGAACGG GAACCCGGCC

541 CCCAAGATCA CGTGGTATCG CAACGGGCAG CGCCTGGAGG TGCCCGTAGA GATGAACCCA

601 GAGGGCTACA TGACCAGCCG CACGGTCCGG GAGGCCTCGG GCCTGCTCTC CCTCACCAGC

661 ACCCTCTACC TGCGGCTCCG CAAGGATGAC CGAGACGCCA GCTTCCACTG CGCCGCCCAC

721 TACAGCCTGC CCGAGGGCCG CCACGGCCGC CTGGACAGCC CCACCTTCCA CCTCACCCTG

781 CACTATCCCA CGGAGCACGT GCAGTTCTGG GTGGGCAGCC CGTCCACCCC AGCAGGCTGG

841 GTACGCGAGG GTGACACTGT CCAGCTGCTC TGCCGGGGGG ACGGCAGCCC CAGCCCGGAG

901 TATACGCTTT TCCGCCTTCA GGATGAGCAG GAGGAAGTGC TGAATGTGAA TCTCGAGGGG

961 AACTTGACCC TGGAGGGAGT GACCCGGGGC CAGAGCGGGA CCTATGGCTG CAGAGTGGAG

1021 GATTACGACG CGGCAGATGA CGTGCAGCTC TCCAAGACGC TGGAGCTGCG CGTGGCCTAT

1081 CTGGACCCCC TGGAGCTCAG CGAGGGGAAG GTGCTTTCCT TACCTCTAAA CAGCAGTGCA

1141 GTCGTGAACT GCTCCGTGCA CGGCCTGCCC ACCCCTGCCC TACGCTGGAC CAAGGACTCC

1201 ACTCCCCTGG GCGATGGCCC CATGCTGTCG CTCAGTTCTA TCACCTTCGA TTCCAATGGC

1261 ACCTACGTAT GTGAGGCCTC CCTGCCCACA GTCCCGGTCC TCAGCCGCAC CCAGAACTTC

1321 ACGCTGCTGG TCCAAGGCTC GCCAGAGCTA AAGACAGCGG AAATAGAGCC CAAGGCAGAT

1381 GGCAGCTGGA GGGAAGGAGA CGAAGTCACA CTCATCTGCT CTGCCCGCGG CCATCCAGAC

1441 CCCAAACTCA GCTGGAGCCA ATTGGGGGGC AGCCCCGCAG AGCCAATCCC CGGACGGCAG

1501 GGTTGGGTGA GCAGCTCTCT GACCCTGAAA GTGACCAGCG CCCTGAGCCG CGATGGCATC

1561 TCCTGTGAAG CCTCCAACCC CCACGGGAAC AAGCGCCATG TCTTCCACTT CGGCACCGTG

1621 AGCCCCCAGA CCTCCCAGGC TGGAGTGGCC GTCATGGCCG TGGCCGTCAG CGTGGGCCTC

1681 CTGCTCCTCG TCGTTGCTGT CTTCTACTGC GTGAGACGCA AAGGGGGCCC CTGCTGCCGC

1741 CAGCGGCGGG AGAAGGGGGC TCCGCCGCCA GGGGAGCCAG GGCTGAGCCA CTCGGGGTCG

1801 GAGCAACCAG AGCAGACCGG CCTTCTCATG GGAGGTGCCT CCGGAGGAGC CAGGGGTGGC

1861 AGCGGGGGCTTCGGAGACGA GTGCTGA