本發明涉及一種proANP快速檢測試紙卡及相關應用，屬于臨床檢測領域。
背景技術：
：心力衰竭是各種心臟結構或功能性疾病導致心室充盈和(或)射血能力受損而引起的一組綜合征，它是老年人住院或者死亡的最常見原因之一。隨著人口老齡化及心肌梗死生存率的上升，心力衰竭作為心血管疾病中唯一一個發病率和流行性仍在持續上升的疾病，其防治已成為近年來臨床心臟病學研究的熱點。心鈉素前體(proANP)由心肌細胞合成，儲存在分泌顆粒中，激素釋放進入血液循環的主要刺激來自心肌細胞的伸展。心鈉素前體釋放時分解為等分子的具有生物活性的proANP(99-126)和N末端proANP(1-98)，后者較前者穩定，對心鈉素的波動分泌比較不敏感，可以較好地反映心鈉素的慢性分泌水平。在心衰患者血液中心鈉素和腦鈉素均升高，其血漿濃度與心衰的嚴重程度成正比。數據表明，proANP可能是早期心臟功能失調的一個明顯的生物標志物。目前，針對proANP的檢測方法主要為酶聯免疫法(ELISA)和放射免疫分析法；并且主要依賴于進口，但是ELISA法定量準確性差、操作時間長、自動化程度低，多用于定性檢測；放射免疫分析法靈敏度較高，操作簡單，測量準確，缺點是所需時間較長，存在放射性污染和輻射危險；膠體金免疫層析方法雖然具有樣本用量少，簡便快速，成本低的優勢，但是靈敏度較低，一般只能定性，不能定量，特別是重復性差這一缺點限制了其在臨床上的應用，尤其不適用于需通過準確定量來幫助對疾病進行診斷的體液標志蛋白的定量檢測。熒光免疫層析是建立在酶聯免疫吸附試驗、乳膠凝集試驗、單克隆抗體技術和免疫熒光微球標記技術基礎上的以熒光微球為標記物,利用特異的抗原抗體反應來放大反應，通過熒光定量分析儀判定結果的新技術。該技術具有簡單、快速、準確和無污染等優點，在臨床醫學檢測、激素檢測、食品安全檢測、藥物殘留和毒品快速檢測諸多診斷領域迅速發展。技術實現要素：本發明的目的是提供一種心鈉素前體(proANP)定量熒光免疫層析檢測試紙卡；所述試紙卡是在PVC板上順次相互搭接經過處理的樣品墊、吸附有稀土熒光微球標記抗體的結合墊、包被有檢測線和質控線的硝酸纖維素膜和吸水墊，組裝后形成試紙卡。在本發明的一個實施方案中，所述稀土熒光微球摻雜有銪元素；所述稀土熒光微球的直徑為50-100nm。在本發明進一步地實施方案中，吸附有稀土熒光微球標記抗體的制備方法如下：1、稀土熒光微球的活化；2、稀土熒光微球標記的proANP抗體的制備：將proANP單克隆抗體用與上述活化的稀土熒光微球混合，反應過夜；然后加入硼氫化鈉反應；再加入等體積的封閉液，封閉過夜；離心洗滌3遍，重懸于的100mMTris-HCl緩沖液中(含0.5％BSA和0.2％木質素磺酸鈉)，4℃避光保存備用。在一個具體實施方案中，所述封閉液組成為含1.0％BSA和0.1％木質素磺酸鈉的50mMTris-HCl緩沖液，pH6.5。在本發明另一個實施方案中，所述吸附熒光微球標記的抗體的結合墊通過以下方法制備：將玻璃纖維膜浸泡于含2.5％木質素磺酸鈉和2.5％BSA的100mMTris-HCl緩沖液中，pH7.0；浸泡，然后取出烘箱烘干，將玻璃纖維膜置于噴臺上，用微定量噴頭將稀土熒光微球標記的proANP單克隆抗體溶液噴到玻璃纖維膜，即得。在本發明又一個實施方案中，所述包被有檢測線和質控線的硝酸纖維素膜的制備方法如下：用包被稀釋液將proANP單克隆抗體和羊抗小鼠IgG抗體制成溶液，將它們分別作為檢測線和質控線平行噴灑于硝酸纖維素膜上進行包被，然后置于烘箱中烘干。在一個具體實施方案中，所述包被稀釋液為含0.5％木質素磺酸鈉的100mMTris-HCl緩沖液，pH7.0。在本發明又一個實施方案中，所述樣品墊的制備方法如下：將玻璃纖維膜浸泡于0.25MTris緩沖液(pH7.5)，含1.2％TritonX-100，2.5％BSA的處理液中，于4℃浸泡4個小時，然后置于烘箱中，37℃烘干4小時。在本發明中，所述試紙卡的組裝過程如下：在PVC板上依次粘貼經過處理的樣品墊、吸附有稀土熒光微球標記的抗體的結合墊、包被有檢測線和質控線的硝酸纖維素膜和吸水墊，組裝后得到試紙大板，按照要求切割成4mm寬，將試紙裝入塑料卡內形成試紙卡。所述試劑盒，檢測方法為：1)將檢測試劑及樣本平衡至室溫，取出試紙卡，平放；2)精確吸取100μl血清樣本，樣本為全血時吸取150μl樣本，加入到樣本孔中，15-30分鐘內用熒光免疫層析分析儀定量判定結果；3)設置好儀器相關參數后將試紙卡放入倉內進行檢測，儀器將顯示出樣品濃度的定量測定結果。在熒光免疫層析試紙卡的制備過程中，一般在封閉和涂布抗體或熒光微球標記抗體過程中，會加入表面活性劑來輔助封閉和維持抗體穩定性的作用。但是本領域常用的TritonX-100、吐溫20和PVP等，但是對于熒光標記抗體來說，傳統表面活性劑的穩定性作用不佳，并且熒光微球中銪元素的發光強度隨著保存時間延長而明顯減弱，而本發明發現當封閉液及涂布液中添加木脂素磺酸鈉作為表面活性劑時，不僅抗體穩定性效果極佳，并且熒光微球發光強度隨著時間延長沒有出現減弱現象。具體實施方式還可進一步通過實施例來理解本發明，其中所述實施例說明了一些制備或使用方法。然而，要理解的是，這些實施例不限制本發明。現在已知的或進一步開發的本發明的變化被認為落入本文中描述的和以下要求保護的本發明范圍之內。在本發明中，在無特殊說明的前提下，“％”代表重量百分比。實施例1proANP檢測試紙卡制備包被有檢測線和質控線的硝酸纖維素膜的制備：用包被稀釋液將proANP單克隆抗體和羊抗小鼠IgG抗體調整濃度到5mg/ml，膜液量為2μl/cm，將它們分別作為檢測線和質控線平行噴灑于硝酸纖維素膜上進行包被，檢測線和質控線間隔為5mm，然后置于烘箱中，37℃烘干4小時。包被稀釋液為含0.5％木質素磺酸鈉的100mMTris-HCl緩沖液，pH7.0。吸附熒光微球標記的抗體的結合墊制備：1、稀土熒光微球的醛基化：取15mg稀土熒光微球，用50mM，pH9.0的碳酸鹽緩沖液，采用離心法洗滌3遍，離心速度為12000rpm，時間為10分鐘，最后重懸于200μl的上述碳酸鹽緩沖液中。加入400μl醛基化的葡聚糖，混勻，室溫下暗反應4小時。采用同樣的離心法洗滌和重懸到200μl的上述碳酸鹽緩沖液中，置于4℃備用。2、稀土熒光微球標記的proANP抗體的制備：將5mg的proANP單克隆抗體用上述碳酸鹽緩沖液于4℃透析過夜，然后與上述醛基化的稀土熒光微球混合，4℃反應過夜。然后，加入硼氫化鈉至終濃度15mM，4℃反應6小時；再加入等體積的封閉液(50mM的Tris-HCl緩沖液，pH6.5，含1.0％BSA和0.1％木質素磺酸鈉)，4℃封閉過夜；然后用50mMpH6.5的Tris-HCl緩沖液，采用離心法洗滌3遍，重懸于200μl的100mMTris-HCl緩沖液中(含0.5％BSA和0.2％木質素磺酸鈉)，4℃避光保存備用。3、將玻璃纖維膜浸泡于100mMTris-HCl緩沖液中(含2.5％木質素磺酸鈉，2.5％BSA，pH7.0)，4℃浸泡4小時，然后取出37℃烘箱烘干4小時，備用。將玻璃纖維膜在Bio-DotXYZ3050三維噴點平臺上，用Bio-JetQuanti300非接觸式微定量噴頭將稀土熒光微球標記的proANP單克隆抗體溶液噴到玻璃纖維膜，37℃烘干4小時，備用。在檢測線中涂布的proANP單克隆抗體和結合墊中的熒光微球標記用的proANP單克隆抗體為配對抗體，均為N末端proANP(NT-proANP)單克隆抗體，購自Genetex公司(USA)。試紙卡的組裝：在PVC板上依次粘貼經過處理的樣品墊、吸附有稀土熒光微球標記的抗體的結合墊、包被有檢測線和質控線的硝酸纖維素膜和吸水墊，組裝后得到試紙大板，按照要求切割成4mm寬，將試紙裝入塑料卡內形成試紙卡。實施例2試紙卡線性范圍、精密度和靈敏度測試取含量為0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10和20nmol/L的proANP標準品溶液，用試紙卡進行測定。檢測方法：將檢測試劑及樣本平衡至室溫，取出試紙卡(實施例1制備)，平放；精確吸取100μl標準品樣本，加入到試紙卡的樣本孔中，20分鐘后用熒光免疫層析分析儀進行檢測。線性：以熒光強度值和對應的標準品濃度建立標準曲線，具體為Y(熒光強度)＝116.27X+3.4，R2值>0.999，說明本發明試紙卡在0.01-2020nmol/L范圍內線性良好。靈敏度：采用PBS緩沖液作為空白對照，以空白對照2倍熒光強度作為最低檢測濃度(即靈敏度)，結果表明：0.01nmol/L標準品平行測定5次的平均熒光強度為4.7RLU；而空白對照的平均熒光強度為1.4RLU。說明試紙卡的靈敏度可達0.01nmol/L。精密度：取已知高濃度和低濃度proANP含量的全血樣本，樣本proANP含量分別為0.68nmol/L和8.43nmol/L；采用實施例1制備試紙卡重復測定10次，計算CV。結果表明proANP含量為0.68nmol/L的低濃度樣本的CV為2.06％；高濃度樣本的CV為1.41％。實施例3穩定性測試將實施例1制備的試紙卡在37℃環境下放置3個月，然后按照實施例2的方法測定試劑盒的標準曲線及R2值，并采用1nmol/L的proANP標準品對試劑盒進行精密度考察(平行測定10次，計算CV％)，具體結果如下：對比例1試紙卡制備同實施例1，區別在于，在制備各步驟中不添加木質素磺酸鈉。對比例2試紙卡制備同實施例1，區別在于，在制備各步驟中將木質素磺酸鈉替換為等量的SDS。對比例3試紙卡制備同實施例1，區別在于，在制備各步驟中將木質素磺酸鈉替換為等量的吐溫20。對比例4試紙卡制備同實施例1，區別在于，在結合墊制備步驟3中將木質素磺酸鈉含量為3.5％。實施例4臨床測試從醫院收集心衰患者及健康人的血液樣本，采用實施例1試紙卡對樣本進行測定，并且采用相同樣本通過放射免疫方法進行測定，結果見下表：樣本編號實施例1放免法11.34nmol/L1.36nmol/L20.89nmol/L0.87nmol/L31.59nmol/L1.63nmol/L45.63nmol/L5.67nmol/L57.27nmol/L7.29nmol/L65.92nmol/L5.99nmol/L本
發明內容僅僅舉例說明了要求保護的一些具體實施方案，其中一個或更多個技術方案中所記載的技術特征可以與任意的一個或多個技術方案相組合，這些經組合而得到的技術方案也在本申請保護范圍內，就像這些經組合而得到的技術方案已經在本發明公開內容中具體記載一樣。當前第1頁1 2 3