基于功能化金納米粒子的新型比色傳感器檢測毒死蜱的制作方法
基于功能化金納米粒子的新型比色傳感器檢測毒死蜱的方法，屬于分析化學技術領域。
背景技術：
毒死蜱是1965年美國陶氏化學公司研制成功的一種高效光譜殺蟲劑，商品名稱是樂斯本，它屬于雜環類有機磷農藥，40年來已成為一種最大噸位的有機磷農藥。現在已經被廣泛應用于防治水稻、麥類、蔬菜、花卉等作物的害蟲。毒死蜱是一種高效、中毒、廣譜性有機磷殺蟲劑，它的毒性不是很強，但對人體的皮膚有強烈的刺激作用，進入眼中對眼睛也有一定的損傷。少量毒死蜱在高等動物體內可以快速降解為無毒物質。從作用特性上看毒死蜱是屬于神經性毒劑，它的殺毒機制是通過抑制生物體內的神經突觸AchE的活性，從而導致大量的AchE沉積下來，中斷神經傳導，最終可以導致神經麻痹，嚴重時還可導致死亡。
目前，國內外關于毒死蜱的檢測方法主要有：氣相色譜法、酶聯免疫法，以及分子印跡技術。
氣相色譜法能滿足分析要求，但所用儀器通常較為昂貴且復雜，對操作人員的儀器操作技能要求比較高，與此同時樣品準備耗時長、成本高；酶聯免疫法雖然較為快速簡單，但抗干擾能力差，對結構類似的化合物可能存在假陽性誤差，而且抗體的制備難度大，成本高；分子印跡技術雖然靈敏度高，反應速度快，選擇性好，設備簡單，但是它對反應條件要求苛刻，所以這項技術仍然處于實驗室階段，并沒有廣泛應用于實際檢測中。因此十分有必要進一步研究靈敏簡便、易于操作、選擇性高且適用于實際樣品快速檢測的方法。
技術實現要素：
本發明的目的是基于功能化金納米粒子的新型比色傳感器檢測毒死蜱，利用核酸適體的特異性識別及其與金納米粒子靜電吸附作用的優勢，從而提供一種快速檢測毒死蜱的方法，達到快速、簡單、靈敏的檢測毒死蜱的殘留量。
技術問題：基于功能化金納米粒子的新型比色傳感器檢測毒死蜱的方法主要為下述原理：
巰基乙胺修飾的金納米粒子(AuNPs)帶正電性，適配體具有帶負電的磷酸骨架。分散的金納米粒子溶液呈現酒紅色，當一定量的適配體加入到帶正電的金納米粒子溶液中，由于靜電吸附作用，導致金納米粒子發生團聚，溶液顏色由酒紅色變為藍紫色。當毒死蜱與毒死蜱適配體結合后就會形成適配體復合體，引起適配體的構型發生變化，破壞適配體與金納米粒子之間的靜電吸附作用，金納米粒子不發生團聚，顏色不改變。據此，可以對毒死蜱進行定量檢測。
本發明的技術方案：
包括以下步驟：巰基乙胺修飾的金納米粒子的合成；通過測定紫外可見吸收光譜觀察金納米粒子、核酸適配體和目標物毒死蜱體系的反應；利用目標物與適配體的特異性結合檢測毒死蜱并進行實際樣品的檢測。
(1)巰基乙胺修飾的金納米粒子的合成
在避光的條件下，將400μL巰基乙胺鹽酸鹽(0.213M)和40mL氯金酸(1.40mM)加入到100mL圓底燒瓶中，在磁力攪拌器上攪拌20min，注意避光，然后邊攪拌邊迅速加入新配置的NaBH4溶液10mL(10mM)，繼續攪拌30min，最終制得酒紅色溶液，將所得溶液用0.45μm的微孔濾膜過濾，濾液裝入棕色試劑瓶中，在4℃的冰箱中保存，備用。
(2)適配體金納米粒子比色檢測毒死蜱方法建立
向1.5mL離心管中加入20μL毒死蜱適配體(2nM)然后分別加入1μg/mL不同體積的毒死蜱標準溶液，加入蒸餾水稀釋至500μL體系，使得毒死蜱的終濃度分別為1,5,10,20,40,60ng/mL。漩渦混合8min后，再加入60μL金納米粒子(終濃度為0.077nM)，震蕩均勻，反應10min，觀察所得到溶液的顏色，并用紫外分光光度計測定溶液的紫外可見吸收光譜，所有實驗均在室溫下進行。
(3)利用目標物與適配體的特異性結合檢測毒死蜱
向含有60μL AuNPs和2nM核酸適配體的混合體系中，分別加入不同濃度的毒死蜱標準溶液，室溫條件下反應8min后，測定該體系的紫外可見吸收光譜，AuNPs在535nm處的吸收值(A535)將隨著毒死蜱濃度的不同而發生變化。分別以毒死蜱的濃度與A535為橫縱坐標建立標準曲線。
所用的毒死蜱的終濃度依次為：1、5、30、50、70、90、100、110ng/mL。本發明中，毒死蜱的檢出限為0.83ng/mL，線性范圍為1-110ng/mL。
(4)選擇性實驗的測定：
取7個1.5mL的離心管，編號為a～g，分別依次加入，a～g管(60μL AuNPs、2nM核酸適配體和70ng/mL待測物質，待測物質依次有機磷農藥甲胺磷、氨基甲酸酯滅多威、擬除蟲菊酯溴氰菊酯和四種結構類似物啶蟲脒、阿特拉津、吡蟲啉、2,4-D丁酯)，測定體系在400～800nm范圍內的紫外可見吸收光譜。
(5)實際樣品的檢測：取蘋果進行實際樣品的檢測
稱取試樣10g(精確到0.01g)于20mL離心管中，加6g無水硫酸鈉和30mL乙酸乙酯，均質2min，在5000r/min離心5min，上清液過濾于250mL容量瓶中，殘渣加入30mL乙酸乙酯再提取一次，過濾，合并濾液于250mL容量瓶中，備用。如權利要求4所述的方法，加入不同濃度的毒死蜱標準溶液進行測定。
本發明的有益效果：
本發明建立了基于功能化金納米粒子的新型比色傳感器檢測毒死蜱的方法，該方法簡單、快速、靈敏，能夠快速檢測毒死蜱，為今后的監管提供了方便。
附圖說明
圖1不同體系的紫外可見吸收光譜：a AuNPs；b AuNPs和毒死蜱適配體；c AuNPs、毒死蜱、毒死蜱適配體；d AuNPs和毒死蜱
圖2不同濃度的毒死蜱(1、5、30、50、70、90、100、110ng/mL)存在時金納米粒子的紫外可見吸收光譜，插圖為相應的標準曲線
圖3體系中加入不同的檢測物后A535的變化：a～g管(60μL AuNPs、2nM核酸適配體和70ng/mL待測物質，待測物質依次有機磷農藥甲胺磷、氨基甲酸酯滅多威、擬除蟲菊酯溴氰菊酯和四種結構類似物啶蟲脒、阿特拉津、吡蟲啉、2,4-D丁酯)
圖4金納米粒子與含有不同濃度的毒死蜱標準液1、5、10、30、50、70、100、150、200、250ng/mg的蘋果提取液體系的紫外可見吸收光譜和工作曲線圖。
具體實施方式
巰基乙胺修飾的金納米粒子的合成
材料/試劑：四水合氯金酸(AuCl3·HCl·4H2O)硼氫化鈉(NaBH4)巰基乙胺鹽酸鹽(CS)購于上海國藥控股化學試劑有限公司
方法：實驗所需的所有玻璃器皿用王水浸泡24h，用蒸餾水沖洗，并浸泡24h，烘干備用。巰基乙胺修飾的金納米粒子合成步驟具體如下：在避光的條件下，將400μL巰基乙胺鹽酸鹽(0.213M)和40mL氯金酸(1.40mM)加入到100mL圓底燒瓶中，在磁力攪拌器上攪拌20min，注意避光，然后邊攪拌邊迅速加入新配置的NaBH4溶液10mL(10mM)，繼續攪拌30min，最終制得酒紅色溶液，將所得溶液用0.45μm的微孔濾膜過濾，濾液裝入棕色試劑瓶中，在4℃的冰箱中保存，備用。
結果：得到酒紅色的巰基乙胺修飾的金納米粒子溶液
由于金納米粒子溶液的體積會對實驗體系產生一定的影響，因此需要研究金納米粒子的體積的作用效果。
材料/試劑：金納米粒子溶液：自己根據文獻合成
方法：取6個1.5mL的離心管，標號為a～f，向每個管中加入2nM的毒死蜱適配體，然后再分別加入：40、50、60、70、80、90μL金納米粒子溶液，反應完全后，測定上述溶液的紫外可見吸收光譜，計算A535的下降值。
結果：隨著金納米粒子溶液濃度的增加，A535的下降值會先增大后降低，當加入金納米粒子溶液體積為60μL時，該值達到最大，實驗現象最明顯，因此，金納米粒子溶液的最佳體積為60μL。
除此之外，核酸適配體的濃度也會對實驗體系產生一定的影響，因此需要研究適配體濃度的作用效果。材料/試劑：毒死蜱核酸適配體：由生工生物(上海)試劑公司合成
方法：取6個1.5mL的離心管，標號為a～f，向每個管中加入60μL金納米粒子溶液，然后再分別加入：0.2、0.6、1.0、2.0、3.0、4.0nM毒死蜱適配體，加水補齊至500μL，反應一定時間后，測定上述溶液的紫外可見吸收光譜，同時，在另一組離心管中，加入50μL 1μg/mL毒死蜱標準液(終濃度100ng/mL)，向其中加入與上一組相同體積的毒死蜱適配體，渦旋一定時間使其充分結合，再加入60μL金納米粒子溶液并加水補齊至500μL，反應一定時間后，測定紫外可見吸收光譜，將兩次得到的A535做差值。
結果：毒死蜱適配體濃度在2nM以下時，差值逐漸增大，并在2nM時達到峰值，當濃度大于2nM時，差值依然比較大，不過由于適配體濃度過高會影響實驗的靈敏度，因此，適配體的終濃度選為2nM。
除此之外，金納米粒子與毒死蜱適配體反應時間也會對實驗產生作用效果，因此需要對其反應時間進行優化。
材料/試劑：金納米粒子溶液：自己根據文獻合成；毒死蜱核酸適配體：由生工生物(上海)試劑公司合成方法：取一組1.5mL離心管中分別加入60μL金納米粒子溶液和20μL 50nM毒死蜱適配體，加水補至500μL體系，分別反應不同的時間(1-8min)后，測定其紫外可見吸收光譜。
結果：分析可知，金納米粒子與毒死蜱適配體最佳反應時間為7min。
除此之外，毒死蜱和毒死蜱適配體反應時間也會對實驗產生作用效果，因此需要對其反應時間進行優化。
材料/試劑：金納米粒子溶液：自己根據文獻合成；毒死蜱核酸適配體：由生工生物(上海)試劑公司合成；毒死蜱：購買于西格瑪奧德里奇試劑公司
方法：取一組1.5mL離心管，分別加入20μL毒死蜱適配體，50μL毒死蜱標準溶液，每個離心管渦旋混合不同的時間(1-10min)，分別加入金納米粒子溶液60μL，并用水補齊至500μL體系，反應7min后測定其紫外可見吸收光譜。
結果：分析可知，毒死蜱與毒死蜱適配體的最佳反應時間為8min。
該方法用于毒死蜱檢測：
材料/試劑：金納米粒子溶液：自己根據文獻合成；毒死蜱核酸適配體：由生工生物(上海)試劑公司合成；毒死蜱購自西格瑪奧德里奇試劑公司；蘋果購自于當地菜市場
方法：
(1)利用適配體金納米粒子比色法檢測毒死蜱：向含有60μL金納米粒子溶液,2nM核酸適配體的混合體系中，分別加入不同濃度的毒死蜱標準溶液，室溫條件下反應8min后，測定該體系的紫外可見吸收光譜，金納米粒子在535nm處的吸光度值將隨著毒死蜱濃度的不同而發生變化。
(2)所用的毒死蜱標準品濃度依次為：1、5、30、50、70、90、100、110ng/mL，通過測定金納米粒子在535nm處的吸光度值A535，根據A535與毒死蜱的濃度建立標準曲線。
(3)實際樣品的檢測：取蘋果進行實際樣品的檢測
稱取試樣10g(精確到0.01g)于20mL離心管中，加6g無水硫酸鈉和30mL乙酸乙酯，均質2min，在5000r/min離心5min，上清液過濾于250mL容量瓶中，殘渣加入30mL乙酸乙酯再提取一次，過濾，合并濾液于250mL容量瓶中，備用。如權利要求4所述的方法，加入不同濃度的毒死蜱標準溶液進行測定。
(4)實驗體系的驗證：
選擇性實驗：
取8個1.5mL的離心管，編號為a～h，分別依次加入，a～h管(60μL金納米粒子溶液,2nM核酸適配體,70ng/mL待測物質,待測物質依次為有機磷農藥甲胺磷、氨基甲酸酯滅多威、擬除蟲菊酯溴氰菊酯和四種結構類似物啶蟲脒、阿特拉津、吡蟲啉、2,4-D丁酯和毒死蜱),測定上述溶液的在535nm處的吸光度值A535。
結果：分別以毒死蜱的濃度和A535為橫縱坐標建立標準曲線，計算檢出限為0.83ng/mL，線性范圍為1-110ng/mL。
本實驗方法檢測毒死蜱的加標回收試驗結果見下表
SEQUENCE LISTING
<110> 吉林大學
<120> 基于功能化金納米粒子的新型比色傳感器檢測毒死蜱
<160> 1
<210> 1
<211> 90
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cctgccacgt ccgcaagctt agggttacgc ctgcagcgat tcttgatcgc gctgctggta
atccttcttt aagcttggca cccgcatcgt 90
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