口蹄疫和偽狂犬病二聯快速檢測試紙條的制作方法

本實用新型總體涉及動物疫病快速診斷試紙條，具體涉及口蹄疫和偽狂犬病二聯快速檢測試紙條。

背景技術：

口蹄疫(foot-and-mouth disease，FMD)是一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，豬、牛、羊等偶蹄類動物最易感。豬口蹄疫的發病率高，傳播迅速，可造成母豬流產、仔豬大批死亡，帶來嚴重的經濟損失。我國對口蹄疫采取強制免疫策略，每年都會使用大量的滅活疫苗，并監測疫苗免疫效果，提高動物臨床抗體水平。如何區分疫苗免疫動物和野毒感染動物成為影響口蹄疫防控的關鍵。在口蹄疫疫苗生產過程中，3ABC非結構蛋白會被除去，因此動物接種口蹄疫疫苗不產生3ABC抗體。因此，檢測3ABC蛋白抗體，可作為診斷野毒感染的重要指標。

偽狂犬病(Pseudorabies virus，PRV)是一種豬的急性傳染病，主要侵害生殖系統，可導致母豬不孕、流產、死胎，哺乳仔豬大量死亡，對成年育肥豬豬可引起生長停滯、增重緩慢等，是危害養豬業的重大傳染病之一。疫苗免疫接種是防控偽狂犬病的重要措施。目前，可用的偽狂犬疫苗均為弱毒活疫苗，能否鑒別免疫動物和野毒感染動物是偽狂犬病凈化的關鍵。通過基因工程技術構建缺失GE蛋白基因的偽狂犬病毒突變株，所制備的疫苗接種動物，不會誘導產生GE蛋白抗體。所以，通過檢測GE蛋白抗體，可以精確區分偽狂犬疫苗免疫豬群和野毒感染豬群。

隨著生物技術的發展，目前市面上已經有豬口蹄疫3ABC和偽狂犬病GE抗體檢測試劑盒，但主要是酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測法。ELISA操作繁瑣，耗時較長，而且需要儀器，不利于臨床實地的疾病診斷。之后出現了一種類似專利CN103792373A的膠體金快速檢測卡，但是只能單一診斷偽狂犬病野毒感染。豬口蹄疫、偽狂犬病對懷孕母豬和仔豬危害大，嚴重破壞養豬業可持續發展，研制快速、多聯的疾病診斷技術具有重大意義。

技術實現要素：

本實用新型的目的在于：提供一種動物疫病快速診斷試紙條，該試紙條可同時診斷豬口蹄疫和偽狂犬病的野毒感染。

本實用新型通過以下技術方案實現：該試紙條包括底板、包被膜、玻璃纖維膜、吸水紙和樣品墊；其中，包被膜的底面粘貼在底板上，包被膜正面的兩端分別粘貼玻璃纖維膜和吸水紙；在玻璃纖維膜遠離吸水紙一端的正面粘貼樣品墊；在包被膜上設有檢測線I、檢測線II和質控線。

檢測線I包被口蹄疫病毒3ABC蛋白，檢測線II包被偽狂犬病毒GE蛋白，質控線包被兔抗葡萄球菌A蛋白IgG抗體；玻璃纖維膜上噴涂有葡萄球菌A蛋白(SPA)膠體金顆粒標記偶聯物。

本實用新型試紙條應用雙抗原夾心法，當被檢樣品中含有3ABC或GE抗體時，則在樣品墊處與SPA蛋白結合，形成“SPA抗原-抗體復合物”，并在吸水紙的作用下向前滲透泳動。當復合物到達檢測線I，3ABC抗體與口蹄疫病毒3ABC蛋白發生特異性結合，形成“SPA抗原-3ABC抗體-3ABC抗原復合物”，在包被膜上出現肉眼可見的色帶。當復合物到達檢測線II，GE抗體與偽狂犬病毒GE蛋白發生特異性結合，形成“SPA抗原-GE抗體-GE抗原復合物”，在包被膜上出現肉眼可見的色帶。當被檢樣品中不含3ABC和GE抗體時，膠體金標記的SPA泳動至質控線，與兔抗葡萄球菌A蛋白IgG抗體結合，在包被膜上出現肉眼可見的色帶。檢測時，吸取待檢血清樣品1滴，滴到樣品墊上，觀察檢測線I、II和質控線是否出現紅色色帶，從而判定動物是否被口蹄疫、偽狂犬野毒感染。

本實用新型的積極效果是：

1、本實用新型操作便捷，不需要儀器設備，結果判讀簡單。在檢測一份血清樣品時，可同時診斷豬口蹄疫和偽狂犬病野毒感染。能夠滿足基層組織、農戶對于重大疫病診斷的需求。

2、本實用新型采用雙抗原夾心法，不受樣品的宿主來源限制，除了診斷豬口蹄疫和偽狂犬病野毒感染，還可用于多種動物口蹄疫野毒感染的鑒別診斷。

3、本實用新型將免疫層析法與膠體金技術相結合，研制出快速診斷試紙條。相對于ELISA，試紙條原輔料更為簡單，成本低，有益于推廣應用。

附圖說明

圖1為本實用新型試紙條的側面結構示意圖。圖中1：底板；2：包被膜；3：玻璃纖維膜；4：吸水紙；5：樣品墊。

圖2為圖1的正面結構示意圖。圖中6：檢測線I；7：檢測線II；8：質控線。

圖3為口蹄疫野毒感染陽性和偽狂犬野毒感染陽性結果示意圖。包被膜2上的檢測線I6、檢測線II7和質控線8均出現紅色色帶。

圖4為口蹄疫野毒感染陽性和偽狂犬野毒感染陰性結果示意圖。包被膜2上的檢測線I6和質控線8均出現紅色色帶，檢測線II7不出現紅色色帶。

圖5為偽狂犬野毒感染陽性和口蹄疫野毒感染陰性結果示意圖。包被膜2上的檢測線II7和質控線8均出現紅色色帶，檢測線I6不出現紅色色帶。

圖6為口蹄疫野毒感染陰性和偽狂犬野毒感染陰性結果示意圖。包被膜2上的質控線8出現紅色色帶，檢測線I6和檢測線II7均不出現紅色色帶。

圖7為本實用新型檢測無效結果示意圖。包被膜2上的質控線8、檢測線I6和檢測線II7均不出現紅色色帶。

圖8為本實用新型檢測無效結果示意圖。包被膜2上的質控線8不出現紅色色帶，檢測線I6和檢測線II7出現紅色色帶。

圖9為本實用新型檢測無效結果示意圖。包被膜2上的質控線8和檢測線I6均不出現紅色色帶，檢測線II7出現紅色色帶。

圖10為本實用新型檢測無效結果示意圖。包被膜2上的質控線8和檢測線II7均不出現紅色色帶，檢測線I6出現紅色色帶。

具體實施方式

下面結合附圖具體介紹本實用新型的口蹄疫和偽狂犬病二聯快速檢測試紙條。本領域技術人員應該理解，下面描述的實施例只是為了更好地理解本實用新型，并不用來限制本實用新型。

如圖1所示，根據本實用新型的口蹄疫和偽狂犬病二聯快速檢測試紙條包括底板1、包被膜2、玻璃纖維膜3、吸水紙4以及樣品墊5。其中，包被膜2粘貼在底板1上面，包被膜2正面的兩端分別粘貼玻璃纖維膜3和吸水紙4。在玻璃纖維膜3遠離吸水紙4的一端的正面粘貼樣品墊5。底板1通常為PVC材質，包被膜2為硝酸纖維素膜(NC膜)。在玻璃纖維膜3上涂覆有膠體金標記SPA蛋白。

如圖2所示，在包被膜2上設有檢測線I6、檢測線II7和質控線8。檢測線I6包被口蹄疫病毒3ABC蛋白，檢測線II7包被偽狂犬病毒GE蛋白，質控線8包被兔抗葡萄球菌A蛋白IgG抗體。所述檢測線I6、檢測線II7和質控線8在包被膜2上呈3條線平行排列，依據檢測線I6、檢測線II7和質控線8是否出現紅色色帶來進行結果判定。

下述實施例中的主要原材料來源為：口蹄疫病毒3ABC蛋白、偽狂犬病毒GE蛋白由鄭州中道生物技術有限公司制備。其它試劑和材料均可來源于商業途徑。所述的實驗方法，若無特別說明，均為常規實驗方法。

本實用新型所述試紙條采用3條帶顯色的膠體金免疫層析法制備，顯示條帶為紅色色帶，具體制備方法如下：

1.1包被膜2的制備

在硝酸纖維素膜上分別噴涂口蹄疫病毒3ABC蛋白、偽狂犬病毒GE蛋白和兔抗葡萄球菌A蛋白IgG抗體，并呈3條線平行排列，分組組成檢測線I6、檢測線II7和質控線8。37℃烘干處理2小時，置裝有干燥劑的密封袋中保存備用。

檢測線I6：調試噴膜儀，噴液量為1ul/cm，用包被緩沖液稀釋口蹄疫病毒3ABC蛋白，濃度為2.5mg/mL，用噴膜儀噴涂劃線。

檢測線II7：調試噴膜儀，噴液量為1ul/cm，用包被緩沖液稀釋偽狂犬病毒GE蛋白，濃度為3.0mg/mL，用噴膜儀噴涂劃線。

質控線8：調試噴膜儀，噴液量為1ul/cm，用包被緩沖液稀釋兔抗葡萄球菌A蛋白IgG抗體，濃度為1mg/mL，用噴膜儀噴涂劃線。

所述包被緩沖液配方：稱取牛血清白蛋白0.01g，十二水合磷酸氫二鈉30.072g，磷酸二氫鉀2.176g，用超純水溶解，并定容至1000mL。

包被膜2上所劃3條線應細致均勻，相鄰兩線間隔0.4-1.0cm。

1.2玻璃纖維膜3的制備

(1)膠體金溶液的制備

將雙蒸水置于磁力攪拌器上加熱至沸騰，迅速加入濃度為1％的氯金酸溶液至終濃度為0.02％。煮沸5分鐘，之后加入濃度為1％的檸檬酸三鈉溶液，加樣體積為氯金酸溶液的1.8倍。煮沸10分鐘后，冷卻至室溫，再用雙蒸水調整氯金酸濃度為0.02％，常溫避光保存備用。

(2)膠體金標記SPA玻璃纖維膜3的制備

用5M碳酸鉀調節膠體金溶液PH值至7.5-8.0，按60ug抗體/mL膠體金溶液的比例加入SPA蛋白，混勻后靜置5分鐘。再按5％體積的量加入10％牛血清白蛋白溶液，混勻后靜置5分鐘。10000rpm離心30分鐘，棄去上清，用標記洗滌液洗滌1次。沉淀用十分之一初始膠體金體積的金標蛋白保存液溶解，然后按照每毫升溶液鋪10cm²的量噴涂于玻璃纖維膜3上。真空干燥3小時，置裝有干燥劑的密封袋中保存備用。

所述10％牛血清白蛋白溶液：取牛血清白蛋白100g，用雙蒸水定容至1000mL。

所述標記洗滌液：取牛血清白蛋白4g，聚乙二醇8000 2g，聚乙烯吡咯烷酮2g，蔗糖2g，Tris 1.211g，用雙蒸水定容至1000mL，并調節PH至8.1。

所述金標蛋白保存液：取牛血清白蛋白25g，聚乙二醇8000 5g，Tris 10.2g，氫氧化鈉2.5g，吐溫207.5mL，用雙蒸水定容至1000mL，并調節PH至8.5。

1.3大板組條

各組份規格(長×寬)：底板1(30cm×7.6cm)、包被膜2(30cm×2.0cm)、樣品墊5(30cm×3.0cm)、涂覆膠體金標記SPA蛋白的玻璃纖維膜3(30cm×0.7cm)和吸水紙4(30cm×3.2cm)。

各層的組合方式如下：將包被膜2粘貼在底板1上面，包被膜2正面的兩端分別粘貼玻璃纖維膜3和吸水紙4。在玻璃纖維膜3遠離吸水紙4的一端的正面粘貼樣品墊5。即在底板1上按順序依次粘貼包被膜2、玻璃纖維膜3、吸水紙4、樣品墊5。

1.4切條

用切條機將大板切成單條，每條寬度為3-5cm。

下面再詳細描述本實用新型的試紙條檢測原理和結果判定。

2.1試紙條檢測原理

本實用新型試紙條應用雙抗原夾心法，用SPA蛋白作為捕獲抗原，用口蹄疫病毒3ABC和偽狂犬病毒GE蛋白作為檢測抗原。其原理是當被檢樣品中含有3ABC或GE抗體時，則在樣品墊5處與SPA蛋白結合，形成“SPA抗原-抗體復合物”，并在吸水紙4的作用下向前滲透泳動。當復合物到達檢測線I6，3ABC抗體與口蹄疫病毒3ABC蛋白發生特異性結合，形成“SPA抗原-3ABC抗體-3ABC抗原復合物”，在包被膜2上出現肉眼可見的色帶。當復合物到達檢測線II7，GE抗體與偽狂犬病毒GE蛋白發生特異性結合，形成“SPA抗原-GE抗體-GE抗原復合物”，在NC膜上出現肉眼可見的色帶。當溶液泳動至質控線8，與兔抗葡萄球菌A蛋白IgG抗體結合，在包被膜2上出現肉眼可見的色帶。檢測時，吸取待檢血清樣品1滴，滴到樣品墊5上，觀察檢測線I6、II7和質控線8是否出現紅色色帶，從而判定動物是否被口蹄疫、偽狂犬病野毒感染。

2.2試紙條結果判定

下面結合附圖，具體介紹本實用新型試紙條的結果判定標準。

如圖3所示，包被膜2上的檢測線I6、檢測線II7和質控線8均出現紅色色帶，則口蹄疫和偽狂犬病均為野毒感染陽性。

如圖4所示，包被膜2上的檢測線I6和質控線8均出現紅色色帶，檢測線II7不出現紅色色帶，則口蹄疫野毒感染陽性，而偽狂犬病野毒感染陰性。

如圖5所示，包被膜2上的檢測線II7和質控線8均出現紅色色帶，檢測線I6不出現紅色色帶，則口蹄疫野毒感染陽性和偽狂犬病野毒感染陰性。

如圖6所示，包被膜2上的質控線8出現紅色色帶，檢測線I6和檢測線II7均不出現紅色色帶，則口蹄疫和偽狂犬病均為野毒感染陰性；

當出現以下幾種情況時，檢測結果無效：包被膜2上的質控線8、檢測線I6和檢測線II7均不出現紅色色帶(圖7)；包被膜2上的質控線8不出現紅色色帶，檢測線I6和檢測線II7出現紅色色帶(圖8)；包被膜2上的質控線8和檢測線I6不出現紅色色帶，檢測線II7出現紅色色帶(圖9)；包被膜2上的質控線8和檢測線II7不出現紅色色帶，檢測線I6出現紅色色帶(圖10)。