H9亞型禽流感病毒抗原偶聯(lián)磁性微粒及其制備方法和應(yīng)用與流程

本發(fā)明涉及生物檢測領(lǐng)域。具體地，涉及一種H9亞型禽流感病毒抗原偶聯(lián)磁性微粒及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：禽流感(Avianinfluenza,AI)是由禽流感病毒(Avianinfluenzavirus,AIV)引起的可感染各種家禽和野生鳥類的一種感染和疾病綜合征。禽流感病毒的血清亞型多而復(fù)雜，同一血清亞型內(nèi)有不同的變異株，不同變異株對不同禽類的致病性又有很大差異。根據(jù)AIV的致病性，將其分為低致病性禽流感(Lowpathogenicavianinfluenza,LPAI)和高致病性禽流感(Highlypathogenicavianinfluenza,HPAI)。H9亞型禽流感病毒屬于低致病性，引起的禽流感主要是由于細菌感染或環(huán)境等其它因素共同作用的結(jié)果。但近年來亞洲爆發(fā)的H9N2亞型禽流感，卻表現(xiàn)了較為嚴重的癥狀，H9N2亞型禽流感病毒致病力在朝著強的方向發(fā)展。在國內(nèi)H9亞型禽流感癥狀更為復(fù)雜，肉仔雞感染后發(fā)病突然，傳播迅速，往往有混和感染。發(fā)病前H9N2免疫反應(yīng)低下，發(fā)病后HI抗體水平顯著提高。20～34日齡雞只多發(fā)生減食或厭食，精神沉郁，咳嗽、噴嚏、甩頭，發(fā)出咯咯叫聲或呼嚕聲，常見鼻眼有分泌物，拉黃白綠稀糞，死亡率較低，和大腸桿菌混和感染時死亡率為30％～50％。成年雞表現(xiàn)形式呈多樣性，主要發(fā)生在免疫過的雞群，感染雞的HI抗體迅速上升，高達13～16log2。病理剖檢變化可見，呼吸系統(tǒng)：氣管、肺、氣囊、鼻竇充血、出血和水腫；多臟器泛發(fā)性密集點狀出血：心、肝、脾、腎、胰腺、胸腺、法氏囊等點狀出血；生殖系統(tǒng)：卵巢萎縮、出血、破裂，輸卵管水腫、出血，卵黃性腹膜炎。H9亞型禽流感抗原HA蛋白是主要的中和性抗原蛋白，其抗體是疫苗免疫后抗體水平的監(jiān)測和病毒感染后抗體水平檢測的主要標的，抗體水平高低與其免疫或感染狀況直接相關(guān)，通過抗體水平的監(jiān)測來制定合理、有效的免疫程序是提高群體免疫水平的保證。現(xiàn)有的檢測機構(gòu)有獸醫(yī)站、疫苗公司、養(yǎng)殖場等存在著大量的樣本，也對大通量的H9亞型禽流感抗體檢測試劑盒和儀器有著需求。目前建立并應(yīng)用的H9亞型禽流感抗體檢測方法有血凝抑制試驗、ELISA方法、病毒中和試驗、免疫熒光法、膠體金試紙條等方法，其中血凝抑制試驗?zāi)壳笆荋9亞型禽流感抗體檢測最常用的方法，通過固定病毒抗原含量，倍比稀釋抗體血清來中和HA血凝素來判斷抗體滴度；ELISA試驗較為靈敏，但難以定量；病毒中和試驗是通過H9亞型禽流感病毒和抗體在細胞上中進行抗原抗體反應(yīng)來判定抗體滴度，能較全面反映中和抗體的高低，全過程為病毒滴定、抗體中和、結(jié)果判定等過程需5-7天時間，全過程只能人工來操作、判定，重復(fù)性差；免疫熒光法通常也是在細胞上操作，存在靈敏度不高，重復(fù)性差等缺點；膠體金方法能快速得出結(jié)果，但是只能定性，難以定量，限制了應(yīng)用范圍?，F(xiàn)有的血凝抑制試驗、ELISA、病毒中和試驗、膠體金等的方法難以滿足。因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)一種高靈敏度、高準確性、花費時間較短的檢測方法。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明第一方面，提供了一種H9亞型禽流感病毒抗原偶聯(lián)的磁性微粒的制備方法，包括步驟：(a)提供磁性微粒溶液、和H9亞型禽流感病毒抗原或其片段；(b)將(a)中的磁性微粒溶液和H9亞型禽流感病毒抗原或其片段進行混合得到磁性微粒溶液和H9亞型禽流感病毒抗原或其片段相偶聯(lián)的混合液，其中，磁性微粒溶液和H9亞型禽流感病毒抗原或其片段的混合比例為1-20.0nmol，較佳地，10mg：1.5-10.0nmol，更佳地，10mg：1.75-4.0nmol。在另一優(yōu)選例中，所述步驟(b)中還包括步驟(b’)：向所述的混合液中加入交聯(lián)劑和/或催化劑，從而獲得經(jīng)交聯(lián)和/或經(jīng)催化的混合液；和/或所述步驟(b)中還包括步驟(b”):向所述的混合中加入標記物，從而獲得經(jīng)標記的混合液。在另一優(yōu)選例中，所述的H9亞型禽流感病毒抗原包括HA蛋白、NA蛋白、或M蛋白。在另一優(yōu)選例中，所述標記物包括發(fā)光標記物，例如，光激發(fā)發(fā)光標記物、電激發(fā)發(fā)光標記物。在另一優(yōu)選例中，所述的發(fā)光標記物包括吖啶酯、堿性磷酸酶、和/或過氧化物酶。在另一優(yōu)選例中，還包括步驟(c)：向(b)所獲得的混合液中加入封閉劑。在另一優(yōu)選例中，所述的磁性微粒與所述的H9亞型禽流感病毒抗原或其片段的結(jié)合方式包括直接偶聯(lián)和間接偶聯(lián)。在另一優(yōu)選例中，所述的間接偶聯(lián)包括通過以下方式介導(dǎo)的偶聯(lián)：鏈霉親和素-生物素介導(dǎo)的偶聯(lián)、抗FITC抗體-FITC偶聯(lián)。在另一優(yōu)選例中，所述的直接偶聯(lián)包括通過磁性微粒羧基與蛋白氨基縮合形成酰胺、磁性微粒氨基與蛋白氨基通過戊二醛交聯(lián)形成五碳橋、或甲苯磺?；判晕⒘Ｅc蛋白氨基共價偶聯(lián)相連接。在另一優(yōu)選例中，所述的磁性微粒核心為氧化鐵。在另一優(yōu)選例中，所述的磁性微粒還含有活性基團。在另一優(yōu)選例中，所述的活性基團包括羥基、羧基、磺?；虬被钚曰鶊F。在另一優(yōu)選例中，所述的磁性微粒的粒徑為0.1-5μm，優(yōu)選地為1-3μm。在另一優(yōu)選例中，所述的磁性微粒溶液中,磁性微粒粒徑CV<3％。在另一優(yōu)選例中，所述H9亞型禽流感病毒抗原或其片段包括：H9亞型禽流感病毒全長、天然H9亞型禽流感病毒片段、重組表達的H9亞型禽流感病毒全長、重組表達的H9亞型禽流感病毒片段，H9亞型禽流感病毒多肽、或H9亞型禽流感病毒化學(xué)合成物。在另一優(yōu)選例中，所述H9亞型禽流感病毒HA蛋白的全長序列如SEQIDNO.:1所示。在另一優(yōu)選例中，所述H9亞型禽流感病毒HA蛋白片段的序列如SEQIDNO.:2所示。在另一優(yōu)選例中，所述H9亞型禽流感病毒HA蛋白多肽片段的序列如SEQIDNO.:3所示。在另一優(yōu)選例中，所述H9亞型禽流感病毒NA蛋白的全長序列如SEQIDNO.:4所示。在另一優(yōu)選例中，所述H9亞型禽流感病毒M蛋白片段的序列如SEQIDNO.:5所示。在另一優(yōu)選例中，所述方法包括步驟：(a)提供磁性微粒溶液、和H9亞型禽流感病毒抗原或其片段；(b)將(a)中的磁性微粒溶液和H9亞型禽流感病毒抗原或其片段進行混合得到混合液，其中，磁性微粒溶液和H9亞型禽流感病毒抗原或其片段的混合比例為10mg：0.6-9.5nmol；(b’)向(b)中加入交聯(lián)劑或催化劑，從而得到經(jīng)交聯(lián)或催化的混合液；(b”)向(b’)經(jīng)交聯(lián)或催化的混合液中加入封閉劑。本發(fā)明第二方面，提供了一種H9亞型禽流感病毒抗原偶聯(lián)的磁性微粒，其中，磁性微粒溶液和H9亞型禽流感病毒抗原或其片段的比例為1-20.0nmol，較佳地，10mg：1.5-10.0nmol，更佳地，10mg：1.75-4.0nmol。在另一優(yōu)選例中，所述H9亞型禽流感病毒抗原偶聯(lián)的磁性微粒由本發(fā)明第一方面所述的方法制成。本發(fā)明第三方面，提供了本發(fā)明第二方面所述H9亞型禽流感病毒抗原偶聯(lián)的磁性微粒的用途，用于制備檢測H9亞型禽流感抗體的檢測試劑和/或試劑盒。本發(fā)明第四方面，提供了一種試劑盒，所述的試劑盒含有容器和說明書，所述的容器內(nèi)含有本發(fā)明第二方面所述的H9亞型禽流感病毒抗原偶聯(lián)的磁性微粒。在另一優(yōu)選例中，所述的容器內(nèi)還含有獨立包裝的質(zhì)控品或校準品、或清洗液。在另一優(yōu)選例中，所述校準品包括H9亞型禽流感病毒抗體陰性或陽性血清稀釋液。在另一優(yōu)選例中，所述清洗液包括含有Tween20的Tris緩沖液或含有Tween20的PBS緩沖液。在另一優(yōu)選例中，所述Tween20的Tris緩沖液濃度為0.05mol/L，pH為8.0。在另一優(yōu)選例中，所述Tween20的PBS緩沖液濃度為0.05mol/L，pH為7.0。在另一優(yōu)選例中，所述的說明書記載了含有本發(fā)明第二方面所述的H9亞型禽流感病毒抗原偶聯(lián)的磁性微粒的使用方法，包括步驟：(i)提供待測樣品、和所述H9亞型禽流感病毒抗原偶聯(lián)的磁性微粒；(ii)將所述待測樣品與所述H9亞型禽流感病毒抗原偶聯(lián)的磁性微?；旌喜⑦M行反應(yīng)；(iii)將(ii)中反應(yīng)后的混合液進行洗滌并加入發(fā)光底物；(iv)對(iii)中加入發(fā)光底物后的混合液進行發(fā)光值檢測，從而定量或定性檢測待測樣品中的H9亞型禽流感病毒抗體。在另一優(yōu)選例中，所述的待測樣品包括血液樣品、體液樣品和組織樣品。本發(fā)明第五方面，提供了一種檢測H9亞型禽流感病毒抗體的檢測方法，包括步驟：(i)提供待測樣品、和所述H9亞型禽流感病毒抗原偶聯(lián)的磁性微粒；(ii)將所述待測樣品與所述H9亞型禽流感病毒抗原偶聯(lián)的磁性微粒混合并進行反應(yīng)；(iii)將(ii)中反應(yīng)后的混合液進行洗滌并加入發(fā)光底物；(iv)對(iii)中加入發(fā)光底物后的混合液進行發(fā)光值檢測，從而定量或定性檢測待測樣品中的H9亞型禽流感病毒抗體。應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附圖說明圖1是本發(fā)明制備實施例1中的校準曲線；圖2是本發(fā)明制備實施例2中的校準曲線；圖3是本發(fā)明制備實施例3中的校準曲線；圖4是本發(fā)明制備實施例4中的校準曲線；圖5是本發(fā)明實驗實施例1中羧基磁珠最適的蛋白用量曲線；圖6是本發(fā)明實驗實施例1中甲苯磺?；胖樽钸m的蛋白用量曲線。具體實施方式本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，首次意外地發(fā)現(xiàn)，采用特定比例的H9亞型禽流感病毒抗原或其片段和磁性微粒進行混合，可以獲得包被飽和均質(zhì)、空間構(gòu)象穩(wěn)定的包被磁性微粒，所包被的磁性微粒上作為H9亞型禽流感病毒抗原的檢測試劑，能夠高靈敏、高準確率地檢出樣本中H9亞型禽流感病毒抗原，且在最大程度上節(jié)省了試劑制備成本。在此基礎(chǔ)上，完成了本發(fā)明。H9亞型禽流感病毒抗原或其片段可用于本發(fā)明的H9亞型禽流感病毒抗原蛋白或其片段沒有特殊限制，可以包括所述天然或重組的H9亞型禽流感病毒抗原蛋白的全長或其片段。優(yōu)選地，可包括H9亞型禽流感病毒HA蛋白全長序列如SEQIDNO.:1所示，其含有560個氨基酸，分子量69kD；H9亞型禽流感病毒HA蛋白片段序列如SEQIDNO.:2所示，其含有112氨基酸，分子量13.6kD；H9亞型禽流感病毒HA蛋白多肽序列如SEQIDNO.:3所示，其含有43氨基酸，分子量5kD；或采用H9亞型禽流感病毒NA蛋白序列如SEQIDNO.:4所示，其含有466個氨基酸，分子量57kD；H9亞型禽流感病毒M蛋白序列如SEQIDNO.:5所示，其含有252個氨基酸，分子量32kD。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能用標準的蛋白質(zhì)純化技術(shù)純化所述多肽。基本上純的多肽在非還原聚丙烯酰胺凝膠上能產(chǎn)生單一的主帶。所述多肽的純度還可以用氨基酸序列進行進一步分析。本發(fā)明的所述蛋白或其片段可以是重組的、天然的、合成的蛋白或其片段。本發(fā)明所述蛋白或其片段可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細菌、酵母、植物)中產(chǎn)生。磁性微粒如本文所用，術(shù)語“磁性微粒”、“磁性顆粒”、“磁珠”可互換使用，指的是內(nèi)部有磁性核心，外部包覆聚合物的微粒。包覆層含有活性基團，可與蛋白、多肽等偶聯(lián)，并不影響蛋白、多肽的免疫活性；磁核使微粒在外部磁場作用下可定向移動聚集，離開磁場之后可在溶液中均勻分散，從而兼顧了抗原抗體的液相反應(yīng)和抗原抗體復(fù)合物與未反應(yīng)物質(zhì)的分離?？捎糜诒景l(fā)明的磁性微粒沒有特殊限制，可以是任何具有磁性核心、表面附有聚合物的磁性顆粒?？捎糜诒景l(fā)明磁性微粒的核心為氧化鐵(Fe3O4)；可用于本發(fā)明磁性顆粒表面的聚合物包括聚苯乙烯、丙烯酸樹脂、聚甲基丙烯酸甲酯等。本發(fā)明磁性微粒的大小優(yōu)選為0.1-5μm，優(yōu)選為1-3μm?？捎糜诒景l(fā)明的磁性微粒通常以微粒群溶液的形式存在，通常，所述微粒群溶液中，微粒大小形狀高度均一，粒徑CV<3％?？捎糜诒景l(fā)明的磁性微粒還可以含有多個活性基團，從而通過化學(xué)交聯(lián)的方式將蛋白、多肽結(jié)合于磁性微粒表面。優(yōu)選地，所述的活性基團包括羥基、羧基、磺?；虬被钚曰鶊F。含有活性基團的磁性微?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)制備獲得或直接市售可得。例如購于日本JSR公司，貨號：MagnosphereTMMS300/Caboxyl的含有羧基的磁性微粒；或購于日本JSR公司，貨號：MagnosphereTMMS300/Tosyl含有甲苯磺?；拇判晕⒘！9亞型禽流感病毒抗原或其片段偶聯(lián)的磁性微粒及其制備方法本發(fā)明提供了一種H9亞型禽流感病毒抗原或其片段偶聯(lián)的磁性微粒及其制備方法，所述方法包括步驟：(a)提供磁性微粒溶液、和H9亞型禽流感病毒抗原或其片段；(b)將(a)中的磁性微粒溶液和H9亞型禽流感病毒抗原或其片段進行混合得到磁性微粒溶液和H9亞型禽流感病毒抗原或其片段相偶聯(lián)的混合液，其中，磁性微粒溶液和H9亞型禽流感病毒抗原或其片段的混合比例為10mg：1.75-16.0nmol；(c)：向(b)所獲得的混合液中加入封閉劑。通常，所述步驟(b)中還包括步驟(b’)：向所述的混合液中加入交聯(lián)劑和/或催化劑，從而獲得經(jīng)交聯(lián)和/或經(jīng)催化的混合液；和/或所述步驟(b)中還包括步驟(b”):向所述的混合中加入標記物，從而獲得經(jīng)標記的混合液。所述方法包括步驟：(a)提供磁性微粒溶液、和H9亞型禽流感病毒抗原或其片段；(b)將(a)中的磁性微粒溶液和H9亞型禽流感病毒抗原或其片段進行混合得到混合液，其中，磁性微粒溶液和H9亞型禽流感病毒抗原或其片段的混合比例為1-20.0nmol，較佳地，10mg：1.5-10.0nmol，更佳地，10mg：1.75-4.0nmol；(b’)向(b)中加入交聯(lián)劑或催化劑，從而得到經(jīng)交聯(lián)或催化的混合液；(b”)向(b’)經(jīng)交聯(lián)或催化的混合液中加入封閉劑?？捎糜诒景l(fā)明的交聯(lián)劑和催化劑沒有特別限制，可以是本領(lǐng)域中常用于磁珠表面包裹的交聯(lián)劑或催化劑。優(yōu)選地，所述的交聯(lián)劑和催化劑包括1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)、戊二醛、硫酸銨?？捎糜诒景l(fā)明的標記物沒有特殊限制，可以是生物檢測領(lǐng)域中用于顯色、顯影的常用標記物。優(yōu)選地，所述標記物包括發(fā)光標記物，例如光激發(fā)發(fā)光標記物、電激發(fā)發(fā)光標記物。例如，所述發(fā)光標記物包括吖啶酯、堿性磷酸酶、和/或過氧化物酶。其可通過本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)進行制備或配置。優(yōu)選的是，所述發(fā)光標記物為吖啶酯時，發(fā)光底物由第一發(fā)光底物和第二發(fā)光底物組成，第一發(fā)光底物為含有0.1mol/L硝酸、0.1％過氧化氫的溶液，第二發(fā)光底物為含有2％Tween-20、0.25mol/LNaOH的溶液；所述發(fā)光標記物為堿性磷酸酶時，發(fā)光底物為以金剛烷為基礎(chǔ)的底物液；所述發(fā)光標記物為過氧化物酶時，發(fā)光底物由第一發(fā)光底物和第二發(fā)光底物組成，第一發(fā)光底物為含有0.5g/L魯米諾、0.1g/L對碘酚的溶液，第二發(fā)光底物為0.625g/L過氧化脲溶液。可用于本發(fā)明H9亞型禽流感病毒抗原或其片段偶聯(lián)的磁性微粒中磁性微粒溶液和H9亞型禽流感病毒抗原或其片段的混合比例為10mg：0.6-9.5nmol，優(yōu)選為10mg：2.0-8.0nmol。在該范圍以下時，發(fā)光值隨蛋白用量增加迅速上升，說明蛋白未完全結(jié)合于磁珠；在該范圍內(nèi)時，發(fā)光值增幅變緩，說明磁珠結(jié)合蛋白接近飽和；而超過該范圍時，發(fā)光值隨蛋白用量增加反而有所降低，說明蛋白開始出現(xiàn)較多的自身交聯(lián)，從而導(dǎo)致了偶聯(lián)磁珠產(chǎn)生構(gòu)型的改變。本發(fā)明中H9亞型禽流感病毒抗原或其片段與磁性微粒之間可通過直接或間接偶聯(lián)。例如，所述的直接偶聯(lián)包括通過磁性微粒羧基與蛋白氨基縮合形成酰胺、磁性微粒氨基與蛋白氨基通過戊二醛交聯(lián)形成五碳橋、甲苯磺?；判晕⒘Ｅc蛋白氨基共價偶聯(lián)相連接。所述的間接偶聯(lián)包括通過以下方式介導(dǎo)的偶聯(lián)：鏈霉親和素-生物素介導(dǎo)的偶聯(lián)、抗FITC抗體-FITC偶聯(lián)。優(yōu)選的方式為：鏈霉親和素包被在磁性微粒上，生物素偶聯(lián)在H9亞型禽流感病毒上，通過鏈霉親和素-生物素作用結(jié)合H9亞型禽流感病毒和磁性微粒；抗FITC抗體包被在磁性微粒上，F(xiàn)ITC交聯(lián)在H9亞型禽流感病毒上，通過抗FITC抗體-FITC相互作用結(jié)合H9亞型禽流感病毒和磁性微粒。本發(fā)明H9亞型禽流感病毒抗原或其片段偶聯(lián)的磁性微粒可用于制備檢測H9亞型禽流感病毒抗體的檢測試劑和/或試劑盒。檢測試劑或試劑盒本發(fā)明提供了一種檢測H9亞型禽流感病毒抗體的檢測試劑或試劑盒，所述的試劑盒含有容器和說明書，所述的容器內(nèi)含有本發(fā)明H9亞型禽流感病毒抗原偶聯(lián)的磁性微粒。優(yōu)選地，所述的容器內(nèi)還含有獨立包裝的質(zhì)控品或校準品、或清洗液；其中，所述校準品包括H9亞型禽流感病毒抗體陰性或陽性血清稀釋液。優(yōu)選地，所述的說明書記載了含有本發(fā)明第二方面所述的H9亞型禽流感病毒抗原偶聯(lián)的磁性微粒的使用方法，包括步驟：(i)提供待測樣品、和所述H9亞型禽流感病毒抗原偶聯(lián)的磁性微粒；(ii)將所述待測樣品與所述H9亞型禽流感病毒抗原偶聯(lián)的磁性微?；旌喜⑦M行反應(yīng)；(iii)將(ii)中反應(yīng)后的混合液進行洗滌并加入發(fā)光底物；(iv)對(iii)中加入發(fā)光底物后的混合液進行發(fā)光值檢測，從而定量或定性檢測待測樣品中的H9亞型禽流感病毒抗體。可用于本發(fā)明的清洗液沒有特別限制，可以為本領(lǐng)域常用的磁珠清洗液，優(yōu)選包括含有Tween20的Tris緩沖液或含有Tween20的PBS緩沖液。在另一優(yōu)選例中，所述Tween20的Tris緩沖液濃度為0.05mol/L，pH為8.0。在另一優(yōu)選例中，所述Tween20的PBS緩沖液濃度為0.05mol/L，pH為7.0。應(yīng)用本發(fā)明H9亞型禽流感病毒抗原偶聯(lián)的磁性微粒及含有其的檢測試劑、檢測試劑盒可有效地用于高效、高靈敏度地檢測待測樣本中的H9亞型禽流感病毒抗體，且所述檢測可以是定性或定量檢測。本發(fā)明有益效果本發(fā)明采用特定粒徑的磁性微粒作為包被載體，采用特定的H9亞型禽流感病毒與磁性微粒之比進行混合并反應(yīng)，獲得了包被均質(zhì)、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的H9亞型禽流感病毒抗原或其片段偶聯(lián)磁性微粒，也節(jié)省了包被蛋白原料，其包被的蛋白充分、檢測范圍較寬，靈敏度較高、反應(yīng)時間非常短(僅需5-10分鐘)，并具有高通量、自動化、可重復(fù)的優(yōu)異特點。下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克?。簩嶒炇沂謨?NewYork：ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。通用方法1.H9亞型禽流感抗體的檢測方法，包括如下步驟：S1、取若干反應(yīng)管，依次加入20μL待測血清或校準品、100μL稀釋液和25μL包被H9亞型禽流感抗原蛋白的磁性懸浮液；S2、37℃下反應(yīng)10分鐘；S3、磁鐵吸附，吸去上清液，每個反應(yīng)管加入300-500μL清洗液，重復(fù)清洗3次，棄去清洗液；S4、向S3中加入100μL堿性磷酸酶標記的H9亞型禽流感抗體溶液；S5、37℃下反應(yīng)10分鐘；S6、重復(fù)步驟S3中的清洗步驟；S7、S6中加入100μL發(fā)光底物；S8、37℃下反應(yīng)5分鐘；S9、用化學(xué)發(fā)光儀檢測發(fā)光值。2.繪制校準曲線，根據(jù)校準曲線計算待測血清中抗體的濃度。以濃度值取對數(shù)為X軸，以發(fā)光值取Logit為Y軸，進行線性擬合，繪制校準曲線。Sn：校準品(除校準品零值外)或樣本發(fā)光值；S0：校準品零值的發(fā)光值。制備實施例1本實施例制備了一種H9亞型禽流感抗體檢測的試劑盒，包括包被H9亞型禽流感抗原蛋白的磁性懸浮液，堿性磷酸酶標記的H9亞型禽流感抗體溶液，稀釋液，校準品，質(zhì)控品，清洗液，發(fā)光底物和反應(yīng)管。包被H9亞型禽流感抗原蛋白的磁性懸浮液的制備：(1)取1mL含磁性微粒(購于日本JSR公司，貨號：MagnosphereTMMS300/Caboxyl)的溶液，濃度為10mg/mL，用0.1mol/LpH為5.0的2-嗎啉乙磺酸(MES)緩沖液清洗2遍，最后懸浮于1mL0.1mol/LpH為5.0的MES緩沖液中；(2)加入純化的H9亞型禽流感抗原蛋白(購自于青島易邦生物工程有限公司)50-500μg；(3)稱取1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)，用0.1mol/LpH為5.0的MES緩沖液溶解，使EDC的濃度為10mg/mL；(4)取(3)中的EDC溶液100μL加入(2)中，37℃下振蕩反應(yīng)2小時；(5)磁鐵吸附，去上清液，用0.01mol/LpH為7.4的PBS溶液(含0.1％的Tween-20)清洗3遍，最后懸浮在0.01mol/LpH為7.4的PBS溶液(含1％的BSA)中，并加入0.1％的ProClinTM300(購于Sigma公司，貨號：48914-U)。所述的磁性微粒為含有羧基基團的磁性微粒。堿性磷酸酶標記的H9亞型禽流感抗體溶液的制備：(1)取1mg堿性磷酸酶，用0.05mol/LpH為9.5的碳酸鹽緩沖液(CB緩沖液)稀釋至10mg/mL；(2)稱取高碘酸鈉(NaIO4)并用0.05mol/LpH為9.5的CB緩沖液溶解，使NaIO4的濃度為12.5mg/mL；(3)取(2)中NaIO4溶液100μL，加入(1)中，振蕩混勻，于2-8℃下避光反應(yīng)1小時；(4)取10μL乙二醇，加入1mL0.05mol/LpH為9.5的CB緩沖液，獲得乙二醇溶液；(5)取(4)中乙二醇溶液100μL加入(3)中，于2-8℃避光反應(yīng)1小時；(6)取H9亞型禽流感單克隆抗體0.5-1mg加入(5)中，混勻后用0.05mol/LpH為9.5的CB緩沖液于2-8℃下避光透析20-24小時；(7)稱取硼氫化鈉(NaBH4)溶于純水中，配制2mg/mL的NaBH4溶液；(8)取(7)中NaBH4溶液10μL，加入(6)中，于2-8℃避光反應(yīng)2小時；(9)過分子篩純化分離未結(jié)合的堿性磷酸酶和H9亞型禽流感單克隆抗體；(10)將(9)中純化后的抗體溶液用含有1％BSA的pH為7.00.05M的3-嗎啉丙磺酸(MOPS)緩沖液稀釋備用。稀釋濃度由預(yù)實驗效果來確定，合適的稀釋濃度為0.1-0.5μg/mL。校準品是經(jīng)標定的含有已知濃度的H9亞型禽流感抗體的緩沖液。校準品的制備：(1)將經(jīng)H9亞型禽流感病毒疫苗強化免疫后獲得的H9亞型禽流感抗體強陽性血清于60℃熱滅活1小時；(2)將(1)中滅活后的強陽性血清經(jīng)0.2μm的微濾膜過濾，加入0.1％的ProClinTM300；(3)將(2)中的血清進行標定，按一定濃度稀釋，得到0，3.13，6.25，12.5，25，50，100，200U/mL系列校準品。質(zhì)控品是經(jīng)標定的H9亞型禽流感抗體陽性雞血清。分為低值質(zhì)控品和高值質(zhì)控品，其中低值質(zhì)控品的質(zhì)控范圍為20-30U/mL，高值質(zhì)控品的質(zhì)控范圍為100-150U/mL。質(zhì)控品用于控制試驗的有效性，定期檢測質(zhì)控品，若超出質(zhì)控范圍，則須使用校準品重新定標。質(zhì)控品的制備：(1)選擇10份以上H9亞型禽流感抗體陽性血清，60℃熱滅活1小時，混合后經(jīng)0.2μm的微濾膜過濾，加入0.1％的ProClinTM300。(2)調(diào)整混合陽性血清至合適的濃度。稀釋液是含有1％BSA，pH為7.4，濃度為0.01mol/L的PBS緩沖液；清洗液是含0.1％Tween-20的0.05mol/LpH為8.0的Tris緩沖液；發(fā)光底物是以金剛烷及其衍生物為基礎(chǔ)的溶液，此例中的發(fā)光底物為Lumi-Phos530，購于Lumigen公司，貨號：P-5000。表1為不同濃度的校準品所對應(yīng)的發(fā)光值，圖1為繪制的校準曲線表1制備實施例2本實施例制備了一種H9亞型禽流感抗體檢測的試劑盒，包括包被H9亞型禽流感抗原蛋白的磁性懸浮液，吖啶酯標記的山羊抗雞IgG抗體(購自北京索萊寶科技有限公司)溶液，稀釋液，校準品，質(zhì)控品，清洗液，第一發(fā)光底物和第二發(fā)光底物，反應(yīng)管。包被H9亞型禽流感抗原蛋白的磁性懸浮液的制備：(1)取1mL含磁性微粒的溶液，濃度為10mg/mL，用0.1mol/LpH為9.5的硼酸緩沖液清洗2遍，最后懸浮于1mL0.1mol/LpH為9.5的硼酸緩沖液中；(2)加入純化的H9亞型禽流感抗原蛋白50-500μg，渦旋混勻；(3)加入0.1mol/LpH為9.5的硼酸緩沖液(含有3mol/L硫酸銨)0.5-1mL，37℃下振蕩反應(yīng)20-24小時；(4)加入0.5mL10％的BSA水溶液，渦旋混勻，37℃振蕩反應(yīng)6-12小時；(5)磁鐵吸附，去上清液，用0.01mol/LpH為7.4的PBS溶液(含0.1％的Tween-20)清洗3遍，最后懸浮在0.01mol/LpH7.4的PBS溶液(含1％BSA)中，并加入0.1％的ProClinTM300。所述的磁性微粒為含有甲苯磺酰基基團的磁性微粒。吖啶酯標記山羊抗雞IgG抗體溶液的制備：(1)取1mg山羊抗雞IgG抗體，用0.05mol/LpH為9.5的CB緩沖液在2-8℃下透析過夜；(2)取含有0.2mg吖啶酯的吖啶酯溶液加入到(1)中，常溫避光反應(yīng)2小時；(3)加入100μL0.1g/mL賴氨酸溶液，常溫避光反應(yīng)2小時；(4)用0.05mol/LpH為9.5的CB緩沖液在2-8℃下避光透析20-24小時；(5)將(4)中的抗體溶液用含有1％BSA的pH為7.00.05mol/L的MOPS緩沖液稀釋備用。校準品的制備方法與制備實施例一相同。質(zhì)控品的制備方法與制備實施例一相同。稀釋液是含有1％BSA，pH為7.4，濃度為0.01mol/L的PBS緩沖液；清洗液是含0.1％Tween-20的0.01mol/LpH為7.0的PBS緩沖液；第一發(fā)光底物為含有0.1mol/L硝酸、0.1％過氧化氫的溶液，第二發(fā)光底物為含有2％Tween-20、0.25mol/LNaOH的溶液。表2為不同校準品濃度所對應(yīng)的發(fā)光值，圖2為繪制的校準曲線。表2制備實施例3本實施例制備了一種H9亞型禽流感抗體檢測的試劑盒，包括包被H9亞型禽流感抗原蛋白的磁性懸浮液，辣根過氧化物酶標記的H9亞型禽流感抗原溶液，稀釋液，校準品，質(zhì)控品，清洗液，第一發(fā)光底物和第二發(fā)光底物，反應(yīng)管。包被H9亞型禽流感抗原蛋白的磁性懸浮液的制備：(1)取1mL含磁性微粒的溶液，濃度為10mg/mL，用0.01mol/LpH為7.4的磷酸鹽(PBS)緩沖液清洗2遍，最后懸浮于1mL0.01mol/LpH為7.4的PBS緩沖液中；(2)加入0.1mL25％(v/v)的戊二醛溶液，37℃振蕩反應(yīng)2小時；(3)用1mL0.01mol/LpH為7.4的PBS緩沖液清洗3遍；(4)加入純化的H9亞型禽流感抗原重組抗原50-500μg，37℃振蕩反應(yīng)20-24小時；(5)加入0.5mL10％牛血清白蛋白(BSA)水溶液，渦旋混勻，37℃振蕩反應(yīng)2小時；(6)用0.01mol/LpH為7.4的PBS溶液(含0.1％的Tween-20)清洗3遍，最后懸浮在0.01mol/LpH7.4的PBS溶液(含1％BSA)中，并加入0.1％的ProClinTM300。所述的磁性微粒為含有氨基基團的磁性微粒。辣根過氧化物酶標記H9亞型禽流感抗原的制備：(1)取1mg辣根過氧化物酶，用0.05mol/LpH為9.5的CB緩沖液稀釋至10mg/mL；(2)稱取NaIO4并用0.05mol/LpH為9.5的CB緩沖液溶解，使NaIO4的濃度為12.5mg/mL；(3)取(2)中NaIO4溶液100μL，加入(1)中，振蕩混勻，于2-8℃下避光反應(yīng)1小時；(4)取10μL乙二醇，加入1mL0.05mol/LpH為9.5的CB緩沖液，獲得乙二醇溶液；(5)取(4)中乙二醇溶液1mL加入(3)中，于2-8℃避光反應(yīng)1小時；(6)取H9亞型禽流感抗原0.5-1mg加入(5)中，混勻后用0.05mol/LpH為9.5的CB緩沖液于2-8℃下避光透析20-24小時；(7)稱取NaBH4溶于純水中，配制2mg/mL的NaBH4溶液；(8)取(7)中NaBH4溶液10μL，加入(6)中，于2-8℃避光反應(yīng)2小時；(9)過分子篩純化；(10)將(9)中純化后的抗原溶液用含有1％BSA的pH7.00.05mol/L的MOPS緩沖液稀釋備用。校準品的制備方法與制備實施例一相同。質(zhì)控品的制備方法與制備實施例一相同。稀釋液是含有1％BSA，pH為7.4，濃度為0.01mol/L的PBS緩沖液；清洗液是含0.1％Tween-20的0.01mol/LpH7.0的PBS緩沖液；第一發(fā)光底物為0.5g/L魯米諾、0.1g/L對碘酚的溶液，第二發(fā)光底物為0.625g/L過氧化脲溶液。表3為校準品不同濃度對應(yīng)的發(fā)光值，圖3為繪制的校準曲線。表3制備實施例4本實施例制備了一種H9亞型禽流感抗體檢測的試劑盒，包括包被鏈霉親和素的磁性懸浮液，堿性磷酸酶標記的H9亞型禽流感病毒抗原，生物素化抗原，校準品，質(zhì)控品，清洗液，發(fā)光底物和反應(yīng)管。包被鏈霉親和素的磁性懸浮液的制備：(1)取1mL含磁性微粒的溶液，濃度為10mg/mL，用0.1mol/LpH為5.0的1-嗎啉乙磺酸(MES)緩沖液清洗2遍，最后懸浮于1mL0.1mol/LpH為5.0的MES緩沖液中；(2)加入鏈霉親和素50-500μg；(3)稱取EDC，用0.1mol/LpH為5.0的MES緩沖液溶解，使EDC的濃度為10mg/mL；(4)取(3)中的EDC溶液100μL加入(2)中，37℃下振蕩反應(yīng)2小時；(5)磁鐵吸附，去上清液，用0.01mol/LpH為7.4的PBS溶液(含0.1％的Tween-20)清洗3遍，最后懸浮在0.01mol/LpH為7.4的PBS溶液(含1％BSA)中，并加入0.1％的ProClinTM300。所述的磁性微粒為含有羧基基團的磁性微粒。堿性磷酸酶標記的H9亞型禽流感病毒抗原溶液的制備：(1)取1mg堿性磷酸酶，用0.05mol/LpH為9.5的CB緩沖液稀釋至10mg/mL；(2)稱取NaIO4并用0.05mol/LpH為9.5的CB緩沖液溶解，使NaIO4的濃度為12.5mg/mL；(3)取(2)中NaIO4溶液100μL，加入(1)中，振蕩混勻，于2-8℃下避光反應(yīng)1小時；(4)取10μL乙二醇，加入1mL0.05mol/LpH為9.5的CB緩沖液，獲得乙二醇溶液；(5)取(4)中乙二醇溶液1mL加入(3)中，于2-8℃避光反應(yīng)1小時；(6)取H9亞型禽流感病毒抗原0.5-1mg加入(5)中，混勻后用0.05mol/LpH為9.5的CB緩沖液于2-8℃下避光透析20-24小時；(7)稱取NaBH4溶于純水中，配制2mg/mL的NaBH4溶液；(8)取(7)中NaBH4溶液10μL，加入(6)中，于2-8℃避光反應(yīng)2小時；(9)過分子篩純化；(10)將(9)中純化后的抗體溶液用含有1％BSA的pH為7.00.05mol/L的MOPS緩沖液稀釋備用。生物素抗原的制備：(1)取1mgH9亞型禽流感病毒抗原，用0.01mol/LpH為7.4的PBS緩沖液在2-8℃下透析過夜；(2)將預(yù)活化的生物素溶于純水中，制備50mmol/L的生物素溶液；(3)取(2)中生物素溶液20μL加入(1)中，常溫反應(yīng)1小時；(4)將(3)中加入100μL0.1g/mL賴氨酸溶液，常溫反應(yīng)1小時；(5)將(4)中溶液用0.01mol/LpH為7.4的PBS緩沖液在2-8℃下透析20-24小時。(6)將(5)中溶液用含有1％BSA的pH為7.00.05mol/L的MOPS緩沖液稀釋備用。校準品的制備方法與制備實施例一相同。質(zhì)控品的制備方法與制備實施例一相同。清洗液是含0.1％Tween-20的0.05MpH8.0的Tris緩沖液；發(fā)光底物是以金剛烷及其衍生物為基礎(chǔ)的溶液。此例中的發(fā)光底物為Lumi-Phos530，購于Lumigen公司，貨號：P-5000。表4為校準品不同濃度對應(yīng)的發(fā)光值，圖4為繪制的校準曲線。表4實驗實施例1H9亞型禽流感病毒抗原或其片段對磁性微粒的比例研究本實施例采用了5種H9亞型禽流感病毒抗原或其片段(SEQIDNO.:1-5)2種磁性微粒((購于日本JSR公司，貨號：MagnosphereTMMS300/Caboxyl)和含有甲苯磺酰基的磁性微粒(購于日本JSR公司，貨號：MagnosphereTMMS300/Tosyl))包被，制備過程如下：本實驗實施例先采用了制備實施例1中所制備的H9亞型禽流感病毒HA蛋白偶聯(lián)磁性微粒，其中H9亞型禽流感病毒HA蛋白全長的加入量為31.3、62.5、125、250、500、1000μg，對應(yīng)物質(zhì)的量為0.45、0.91、1.81、3.62、7.25、14.49nmol；H9亞型禽流感病毒HA蛋白片段的加入量為6.3、12.5、25、50、100、200μg，對應(yīng)物質(zhì)的量為0.46、0.92、1.84、3.68、7.35、14.71nmol；H9亞型禽流感病毒HA蛋白多肽的加入量為2.5、5、10、20、40、80μg，對應(yīng)物質(zhì)的量為0.5、1、2、4、8、16nmol；H9亞型禽流感病毒NA蛋白全長的加入量為25、50、100、200、400、800μg，對應(yīng)物質(zhì)的量為0.44、0.88、1.75、3.51、7.02、14.04nmol；H9亞型禽流感病毒M蛋白片段的加入量為15.7、31.3、62.5、125、250、500μg，對應(yīng)物質(zhì)的量為0.49、0.98、1.95、3.91、7.81、15.63nmol。本實驗實施例還采用了制備實施例2中所制備的H9亞型禽流感病毒HA蛋白偶聯(lián)磁性微粒，其中H9亞型禽流感病毒HA蛋白全長的加入量為31.3、62.5、125、250、500、1000μg，對應(yīng)物質(zhì)的量為0.45、0.91、1.81、3.62、7.25、14.49nmol；H9亞型禽流感病毒HA蛋白片段的加入量為6.3、12.5、25、50、100、200μg，對應(yīng)物質(zhì)的量為0.46、0.92、1.84、3.68、7.35、14.71nmol；H9亞型禽流感病毒HA蛋白多肽的加入量為2.5、5、10、20、40、80μg，對應(yīng)物質(zhì)的量為0.5、1、2、4、8、16nmol；H9亞型禽流感病毒NA蛋白全長的加入量為25、50、100、200、400、800μg，對應(yīng)物質(zhì)的量為0.44、0.88、1.75、3.51、7.02、14.04nmol；H9亞型禽流感病毒M蛋白片段的加入量為15.7、31.3、62.5、125、250、500μg，對應(yīng)物質(zhì)的量為0.49、0.98、1.95、3.91、7.81、15.63nmol。配以堿性磷酸酶標記的H9亞型禽流感病毒溶液、清洗液、發(fā)光底物和反應(yīng)管進行試驗。1.1羧基磁珠的最適蛋白用量用本實施例H9亞型禽流感抗體陽性血清，結(jié)果如表5所示，圖5為包被蛋白用量與其發(fā)光值對應(yīng)的曲線。結(jié)果表明，隨蛋白用量增加，發(fā)光值上升速度逐漸變緩，說明磁珠結(jié)合蛋白接近飽和；而蛋白用量繼續(xù)增加，發(fā)光值反而有所降低，說明蛋白過量，出現(xiàn)了較多的蛋白自身交聯(lián)。因此，對于羧基磁珠，H9亞型禽流感HA蛋白全長、片段、多肽的最適用量為1.81-16.0nmol/10mg磁珠；NA蛋白全長的最適用量為1.75-14.4nmol/10mg磁珠；M蛋白片段的最適用量為1.95-15.63nmol/10mg磁珠。五種蛋白雖然氨基酸數(shù)量、分子量差別很大，但按物質(zhì)的量計算，最佳包被蛋白用量相差不大，都在1.75-16.0nmol/10mg磁珠范圍內(nèi)。其中，1.75-4.00nmol/10mg磁珠效果最好。表5羧基磁珠的最適蛋白用量1.2甲苯磺?；胖榈淖钸m蛋白用量用本實施例檢測H9亞型禽流感抗體陽性血清，結(jié)果如表6所示，圖6為包被蛋白用量與其發(fā)光值對應(yīng)的曲線。隨蛋白用量增加，發(fā)光值上升速度逐漸變緩，說明磁珠結(jié)合蛋白接近飽和。因此，對于甲苯磺?；胖?，H9亞型禽流感HA蛋白全長、片段、多肽的最適用量為1.81nmol/10mg磁珠以上；NA蛋白全長的最適用量為3.51nmol/10mg磁珠以上；M蛋白片段的最適用量為1.95nmol/10mg磁珠以上。五種蛋白雖然氨基酸數(shù)量、分子量差別很大，但按物質(zhì)的量計算，最佳包被蛋白用量相差不大，考慮成本因素，蛋白用量不宜過多，結(jié)合羧基磁珠的結(jié)果，確定五種蛋白的最佳用量范圍為1.75-16.0nmol/10mg磁珠。表6甲苯磺?；胖榈淖钸m蛋白用量實驗實施例2靈敏度實驗分別采用制備實施例1、2、3、4中的試劑盒分別進行靈敏度測試，國外知名廠家生產(chǎn)的H9亞型禽流感抗體檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗，以下簡稱為ELISA試劑盒)同時檢測不同稀釋倍數(shù)的H9亞型禽流感抗體血清，其中，本實施例的試劑盒對每份血樣均做10個重復(fù)檢測，計算變異系數(shù)(CV％＝10個測試結(jié)果的標準偏差/算術(shù)平均值)。以CV％<20％的最大稀釋倍數(shù)作為靈敏度結(jié)果。結(jié)果分別見表7、8、9、10，可見本試劑靈敏度均優(yōu)于ELISA試劑盒，其中表7可見本發(fā)明試劑盒靈敏度<1.93U/mL；表8可見本發(fā)明試劑盒靈敏度<0.89U/mL；表9可見本發(fā)明試劑盒靈敏度<0.95U/mL；表10可見本發(fā)明試劑盒靈敏度<0.96U/mL。表7表8表9表10實驗實施例3重復(fù)性實驗取3例H9亞型禽流感抗體陽性血清，分別采用制備實施例1、2、3、4中的試劑盒分別進行重復(fù)性測試，每天分2批檢測，每批3份血清各做2個測試，兩批試驗至少間隔2小時，連續(xù)檢測5天。每份血清各得到20個檢測數(shù)據(jù)，計算其濃度的變異系數(shù)，結(jié)果如表11、12、13、14。結(jié)果證明，3份血清檢測結(jié)果重復(fù)性良好。表11表12表13表14實驗實施例4符合率實驗分別采用制備實施例1、2、3、4中的試劑盒與ELISA試劑盒同時檢測多份雞血清，檢測結(jié)果如表15-18。結(jié)果顯示，四次實驗中，本試劑與ELISA試劑盒陽性符合率分別為97.5％、97.5％、96.3％、96.3％，陰性符合率分別為95.2％、94.7％、94.4％、94.4％，總體符合率分別為95.6％、95.2％、94.7％、94.7％。表15表16表17表18實驗實施例5H9亞型禽流感病毒疫苗的免疫監(jiān)測濃度<8.0U/mL判定為陰性，濃度≥8.0U/mL判定為陽性；Elisa試劑盒S/N>0.50判定為陰性，S/N≤0.50判定為陽性。在用H9亞型禽流感病毒疫苗免疫后，隨機抽取3只，分別于免疫后0、7、10、14、21、35天抽取血樣檢測H9亞型禽流感抗體，采用制備實施例1、2、3、4中試劑盒進行檢測，檢測結(jié)果如表19-22。結(jié)果顯示，在免疫后10至35天，H9亞型禽流感病毒抗體由陰轉(zhuǎn)陽，且濃度逐漸上升；除第10天本發(fā)明試劑盒檢測結(jié)果為陽性，而ELISA試劑盒檢測結(jié)果為陰性外，兩種試劑檢測結(jié)果一致。表19表20表21表22實驗實施例6特異性實驗分別采用制備實施例1、2、3、4中的試劑盒檢測多種相關(guān)病毒抗體強陽性血清，包括雞傳染性法氏囊病毒抗體(IBDV-Ab)、新城疫病毒抗體(NDV-Ab)、傳染性支氣管炎抗體(IBV-Ab)、禽白血病病毒J亞型抗體(ALV-J-Ab)、雞網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病毒抗體(REV-Ab)。檢測結(jié)果檢測結(jié)果均低于8.0U/mL，均為陰性，未發(fā)現(xiàn)交叉反應(yīng)，見表23、24、25、26。表23相關(guān)病毒抗體IBDV-AbNDV-AbIBV-AbALV-J-AbREV-Ab濃度(U/mL)2.312.923.092.372.91表24相關(guān)病毒抗體IBDV--AbNDV-AbIBV-AbALV-J-AbREV-Ab濃度(U/mL)1.151.401.811.591.64表25相關(guān)病毒抗體IBDV--AbNDV-AbIBV-AbALV-J-AbREV-Ab濃度(U/mL)1.331.181.471.601.40表26相關(guān)病毒抗體IBDV--AbNDV-AbIBV-AbALV-J-AbREV-Ab濃度(U/mL)2.051.731.611.461.72在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。序列表<110>上海鳴捷生物科技有限公司<120>H9亞型禽流感病毒抗原偶聯(lián)磁性微粒及其制備方法和應(yīng)用<130>P2016-1202<160>5<170>PatentInversion3.5<210>1<211>560<212>PRT<213>禽流感病毒（Avianinfluenzavirus）<220><221>misc_feature<223>HA蛋白全長<400>1MetLysAlaLeuSerLeuIleThrIleLeuLeuValValThrValSer151015AsnAlaAspLysIleCysIleGlyTyrGlnSerThrAsnSerThrGlu202530ThrValAspThrLeuThrGluAsnAsnValProValThrHisAlaLys354045GluLeuLeuHisThrGluHisAsnGlyMetLeuCysAlaThrAsnLeu505560GlyArgProLeuIleLeuAspThrCysThrIleGluGlyLeuIleTyr65707580GlyAsnProSerCysAspLeuLeuLeuGlyGlyArgGluTrpSerTyr859095IleValGluArgProSerAlaValAsnGlyMetCysTyrProGlyAsn100105110ValGluAsnLeuGluGluLeuArgSerLeuPheSerSerAlaSerSer115120125TyrGlnArgIleGlnIlePheProAspThrIleTrpAsnValSerTyr130135140SerGlyThrSerLysAlaCysSerAspSerPheTyrArgSerMetArg145150155160TrpLeuThrGlnLysAspAsnAlaTyrProIleGlnAspAlaGlnTyr165170175ThrAsnAsnArgGlyArgSerIleLeuPheMetTrpGlyIleAsnHis180185190ProProThrAspThrThrGlnThrAsnLeuTyrThrArgThrAspThr195200205ThrThrSerValAlaThrGluAspIleAsnArgThrPheLysProLeu210215220IleGlyProArgProLeuValAsnGlyLeuGlnGlyArgIleAspTyr225230235240TyrTrpSerIleLeuLysProGlyGlnThrLeuArgValArgSerAsn245250255GlyAsnLeuIleAlaProTrpTyrGlyHisIleLeuSerGlyGluSer260265270HisGlyArgIleLeuLysThrAspLeuLysLysGlyAsnCysValVal275280285GlnCysGlnThrGluArgGlyGlyLeuAsnThrThrLeuProPheHis290295300AsnValSerLysTyrAlaPheGlyAsnCysProLysTyrIleGlyVal305310315320LysSerLeuLysLeuAlaValGlyLeuArgAsnValProAlaArgAla325330335SerArgGlyLeuPheGlyAlaIleAlaGlyPheIleGluGlyGlyTrp340345350SerGlyLeuValAlaGlyTrpTyrGlyPheGlnHisSerAsnAspGln355360365GlyValGlyMetAlaAlaAspArgGluSerThrGlnLysAlaIleAsp370375380LysIleThrSerLysValAsnAsnIleValAspLysMetAsnLysGln385390395400TyrGluIleIleAspHisGluPheSerGluValGluAlaArgLeuAsn405410415MetIleAsnAsnLysIleAspAspGlnIleGlnAspIleTrpAlaTyr420425430AsnAlaGluLeuLeuValLeuLeuGluAsnGlnLysThrLeuAspGlu435440445HisAspAlaAsnValAsnAsnLeuTyrAsnLysValLysArgAlaLeu450455460GlySerAsnAlaMetGluAspGlyLysGlyCysPheGluLeuTyrHis465470475480LysCysAspAspGlnCysMetGluThrIleArgAsnGlyThrTyrAsn485490495ArgArgLysTyrLysGluGluSerArgLeuGluArgGlnLysIleGlu500505510GlyValLysLeuGluSerGluGlyThrTyrLysIleLeuThrIleTyr515520525SerThrValAlaSerSerLeuValValAlaMetGlyPheAlaAlaPhe530535540LeuPheTrpAlaMetSerAsnGlySerCysArgCysAsnIleSerIle545550555560<210>2<211>112<212>PRT<213>禽流感病毒（Avianinfluenzavirus）<220><221>misc_feature<223>HA蛋白片段<400>2ThrGlnLysAspAsnAlaTyrProIleGlnAspAlaGlnTyrThrAsn151015AsnArgGlyArgSerIleLeuPheMetTrpGlyIleAsnHisProPro202530ThrAspThrThrGlnThrAsnLeuTyrThrArgThrAspThrThrThr354045SerValAlaThrGluAspIleAsnArgThrPheLysProLeuIleGly505560ProArgProLeuValAsnGlyLeuGlnGlyArgIleAspTyrTyrTrp65707580SerIleLeuLysProGlyGlnThrLeuArgValArgSerAsnGlyAsn859095LeuIleAlaProTrpTyrGlyHisIleLeuSerGlyGluSerHisGly100105110<210>3<211>43<212>PRT<213>禽流感病毒（Avianinfluenzavirus）<220><221>misc_feature<223>HA蛋白片段<400>3IleValAspLysMetAsnLysGlnTyrGluIleIleAspHisGluPhe151015SerGluValGluAlaArgLeuAsnMetIleAsnAsnLysIleAspAsp202530GlnIleGlnAspIleTrpAlaTyrAsnAlaGlu3540<210>4<211>123<212>PRT<213>禽流感病毒（Avianinfluenzavirus）<220><221>misc_feature<223>N蛋白全長<400>4MetProAsnAsnAsnGlyLysGlnGlnLysLysLysArgGlyAsnGly151015GlnProValAsnGlnLeuCysGlnMetLeuGlyLysIleIleAlaGln202530GlnAsnGlnSerArgGlyLysGlyProGlyLysLysIleLysAsnLys354045AsnProGluLysProHisPheProLeuAlaThrGluAspAspValArg505560HisHisPheThrSerSerGluArgGlnLeuCysLeuSerSerIleGln65707580ThrAlaPheAsnGlnGlyAlaGlyAlaCysThrLeuSerAspSerGly859095ArgIleSerTyrThrValGluPheSerLeuProThrHisHisThrVal100105110ArgLeuIleArgValThrAlaProSerSerAla115120<210>5<211>252<212>PRT<213>禽流感病毒（Avianinfluenzavirus）<220><221>misc_feature<223>M蛋白全長<400>5MetSerLeuLeuThrGluValGluThrTyrValLeuSerIleIlePro151015SerGlyProLeuLysAlaGluIleAlaGlnArgLeuGluAspValPhe202530AlaGlyLysAsnThrAspLeuGluAlaLeuMetGluTrpLeuLysThr354045ArgProIleLeuSerProLeuThrLysGlyIleLeuGlyPheValPhe505560ThrLeuThrValProSerGluArgGlyLeuGlnArgArgArgPheVal65707580GlnAsnAlaLeuAsnGlyAsnGlyAspProAsnAsnMetAspArgAla859095ValLysLeuTyrLysLysLeuLysArgGluMetThrPheHisGlyAla100105110LysGluValAlaLeuSerTyrSerThrGlyAlaLeuAlaSerCysMet115120125GlyLeuIleTyrAsnArgMetGlyThrValThrThrGluValAlaLeu130135140GlyLeuValCysAlaThrCysGluGlnIleAlaAspSerHisHisArg145150155160SerHisArgGlnMetAlaThrThrThrAsnProLeuIleArgHisGlu165170175AsnArgMetValLeuAlaSerThrThrAlaLysAlaMetGluGlnMet180185190AlaGlySerSerGluGlnAlaAlaGluAlaMetGluValAlaSerGln195200205AlaArgGlnMetValGlnAlaMetArgThrIleGlyThrGlnProSer210215220SerSerAlaGlyLeuLysAspAspLeuIleGluAsnLeuGlnAlaTyr225230235240GlnLysArgMetGlyValGlnMetGlnArgPheLys245250當前第1頁1 2 3