在熒光微球表面定向包被抗體的方法及其在糖化載脂蛋白A1檢測中的用途與流程

本公開涉及醫學檢驗領域，具體地，涉及一種在熒光微球表面定向包被抗體的方法及其在糖化載脂蛋白A1檢測中的用途。
背景技術：
：免疫試紙快速檢測技術是基于免疫層析原理建立起來的一種適用于現場檢測的技術，典型的免疫試紙包括樣品墊、標記墊、包被膜和吸收墊。以微孔膜作為固相載體，經滲透和毛細管虹吸作用使待測樣品中的抗體或抗原與膜上包被的抗原或抗體結合，通過標記墊上標記物來呈現反應結果。常見的標記材料包括膠體金標記及熒光標記，熒光標記的優點在于可以進行定量分析。而樣品中的待檢測物與標記墊中熒光標記材料的結合效率是決定檢測成功與否的關鍵因素。因此如何增強待檢測物與標記物的結合是提高檢測靈敏度和準確性所必須解決的技術問題。技術實現要素：本公開的目的是提供一種提高待檢測物與標記物的結合效果的方法。為達到上述目的，本公開的第一個方面提供了一種在熒光微球表面定向包被抗體的方法，所述方法包括：將抗體與熒光微球按照1-4：300的質量比在pH為8.0-8.5的反應緩沖液中結合反應20-40min獲得抗體標記微球；其中，所述熒光微球表面具有羥基官能團；所述反應緩沖液為含有質量體積百分比為0.8-1.2％的帶氨基基團的烷基硅氧烷和質量體積百分比為9-11％的BSA的硼酸鹽緩沖液。可選的，所述帶氨基基團的烷基硅氧烷為(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷、(3-氨基丙基)二甲基乙氧基硅烷和(3-氨基丙基)二甲基甲氧硅烷中的至少一種。可選的，所述熒光微球為聚苯乙烯包埋鑭系元素微球、聚乙烯包埋量子點微球或聚苯乙烯包埋有機熒光染料微球。可選的，在所述反應緩沖液中，抗體的用量按質量體積百分比計為1.5-2％。可選的，所述方法還包括在結合反應前用pH為8.0-8.5的硼酸鹽緩沖液對抗體透析16-24小時。可選的，所述抗體為糖化載脂蛋白A1的單克隆抗體、糖化載脂蛋白A1多克隆抗體或載脂蛋白A1單克隆抗體。本公開的第二個方面提供一種抗體標記微球，所述抗體標記微球是利用本公開的第一個方面所述的方法制備的。本公開的第三個方面還提供了本公開的第二個方面所述的抗體標記微球在免疫檢測中的用途，包括檢測糖化載脂蛋白A1。本公開的第四個方面提供一種熒光免疫層析試紙條，所述試紙條的標記墊上含有本公開第二個方面所述的抗體標記微球。可選的，所述標記墊上含有的抗體標記微球是將所述抗體標記微球以2-3mg/mL的濃度溶于噴涂緩沖液中，使用3-5μL/cm的噴涂速度通過噴金點膜機噴涂在標記墊上干燥后得到的；其中，所述噴涂緩沖液為含有質量體積百分比為0.3-0.7％的BSA和質量體積百分比為0.2-0.3％的Tween-20的濃度為0.01-0.03M的磷酸鹽緩沖液，所述噴涂緩沖液的pH值為7.2-7.6。通過上述技術方案，本公開提供了在熒光微球表面定向包被抗體的方法，利用該方法使得抗體更傾向于以Fc區段去接近熒光微球表面的羥基官能團，而使得Fab區段得以向外伸展。本公開的技術具有以下優點：可以提高抗體的利用率，改善試劑性能，提高試劑在用于檢測時的靈敏度；本公開的方法不需共價修飾抗體的步驟，從而減少了抗體活性的損失，當用于制備熒光免疫層析試紙條時可以有效控制試紙條的批間差；本公開的包被工藝較其他方法更加簡化和易操作。特別的，當利用本公開所提供的方法和抗體標記微球進行糖化載脂蛋白A1的檢測時，可以獲得更高的檢測靈敏度和特異性。本公開的其他特征和優點將在隨后的具體實施方式部分予以詳細說明。附圖說明附圖是用來提供對本公開的進一步理解，并且構成說明書的一部分，與下面的具體實施方式一起用于解釋本公開，但并不構成對本公開的限制。在附圖中：圖1是抗體標記微球結構示意圖A為熒光微球，B為抗體，C為APTES，D為抗體標記微球；圖2是人糖化載脂蛋白A1熒光標記免疫層析試紙條陰性結果示意圖；圖3是人糖化載脂蛋白A1熒光標記免疫層析試紙條陽性結果示意圖。附圖標記說明1樣品墊2標記墊3T線4基膜5C線6吸水墊7基板具體實施方式以下結合附圖對本發明的具體實施方式進行詳細說明。應當理解的是，此處所描述的具體實施方式僅用于說明和解釋本發明，并不用于限制本發明。本公開的第一個方面提供了一種在熒光微球表面定向包被抗體的方法，所述方法包括：將抗體與熒光微球按照1-4：300的質量比在pH為8.0-8.5的反應緩沖液中結合反應20-40min獲得抗體標記微球；其中，所述熒光微球表面具有羥基官能團；所述反應緩沖液為含有質量體積百分比為0.8-1.2％的帶氨基基團的烷基硅氧烷和質量體積百分比為9-11％的BSA的硼酸鹽緩沖液。在本公開的一種優選的實施方式中，為了進一步提高抗體的利用率，抗體與熒光微球的質量比優選為1.5-3.5:300。其中，在進行結合反應前，可以先用pH為8.0-8.5的硼酸鹽緩沖液對抗體透析16-24小時。所述透析過程可以按照本領域常規的抗體透析方法進行，可選的，透析的溫度為3-5℃；透析結束后可以將含有抗體的溶液調整濃度后備用。可選的，所述方法可以包括先用磷酸鹽緩沖液或硼酸鹽緩沖液將熒光微球進行復溶后再將熒光微球溶液與抗體溶液混合。本公開中，若無特殊說明，所述的硼酸鹽緩沖液的濃度為0.03-0.07M，pH為8.0-8.5，磷酸鹽緩沖液的濃度為0.01-0.03M，pH為7.2-7.6。其中，所述帶氨基基團的烷基硅氧烷為(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷、(3-氨基丙基)二甲基乙氧基硅烷和(3-氨基丙基)二甲基甲氧硅烷中的至少一種，特別優選的，所述帶氨基基團的烷基硅氧烷為(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(APTES)。其中，所述熒光微球為聚苯乙烯包埋鑭系元素微球、聚乙烯包埋量子點微球或聚苯乙烯包埋有機熒光染料微球。其中，所述熒光微球的尺寸優選為50-300nm。其中，在所述反應緩沖液中，抗體的用量按質量體積百分比計為1.5-2％。特別優選的，為了進一步提高烷基硅氧烷對熒光微球的包被效果、提高抗體的利用率、以及使得抗體在熒光微球表面能夠更好的吸附，所述反應緩沖液中抗體的用量按質量體積百分比計為1.6-1.8％。其中，在本公開第一個方面的一種具體實施方式中，所述抗體為糖化載脂蛋白A1的單克隆抗體、糖化載脂蛋白A1多克隆抗體或載脂蛋白A1單克隆抗體。本公開的第二個方面提供一種抗體標記微球，所述抗體標記微球是利用本公開的第一個方面所述的方法制備的。本公開所述的抗體標記微球的結構的核心部分為熒光微球，熒光微球表面包被有帶氨基基團的烷基硅氧烷，抗體的Fc結構片段接近熒光微球表面的羥基官能團，抗體的Fab結構片段向外伸展，使得抗體更容易與待測的抗原相結合，抗體標記微球的結構如圖1所示。在本公開的一種具體的實施方式中，所述抗體為糖化載脂蛋白A1的單克隆抗體，所述熒光微球為聚苯乙烯熒光微球，所述帶氨基基團的烷基硅氧烷為3-氨基丙基三乙氧基硅烷。本公開的第三個方面還提供了本公開的第二個方面所述的抗體標記微球在免疫檢測中的用途，所述用途包括檢測糖化載脂蛋白A1。所述免疫檢測包括通過特異性識別的抗原抗體反應原理進行檢測的技術，包括熒光免疫層析試紙檢測技術、免疫熒光技術、酶聯免疫吸附技術、酶免疫組化技術等。本公開的第四個方面提供一種熒光免疫層析試紙條，所述試紙條的標記墊上含有本公開第二個方面所述的抗體標記微球。在本公開第四個方面的一種具體的實施方式中，所述試紙條包括在基板上依次相連接的吸水墊、基膜、標記墊和樣品墊；所述基膜上設置有C線和T線，所述C線上包被有IgG的抗體，所述標記墊中含有包被了第一單克隆抗體的抗體標記微球；所述T線上包被有第二單克隆抗體。其中，熒光免疫層析試紙條的檢測原理可能包括：將待檢樣品滴入樣品墊中，若樣品中有待測抗原，待檢樣品中的待測抗原先和所述抗體標記微球表面的第一單克隆抗體結合，由于毛細管作用，待測抗原和抗體標記微球形成的復合體沿基膜向前泳動，到達檢測線時遇到包被在硝酸纖維素基膜上的第二單克隆抗體，由于第一單克隆抗體和第二單克隆抗體分別能與待測抗原的不同抗原表位結合，從而形成“抗體標記微球-待測抗原-第二單克隆抗體”復合體，從而使得熒光微球富集在檢測線上，形成特異性的層析線；沒有和待測抗原結合的抗體標記微球則會直接通過檢測線，達到質控線后被質控線上的IgG抗體捕獲，從而使得熒光微球富集在質控線上形成層析線，即判為陽性結果；若樣品中無待測抗原，由于無法在檢測線上形成“抗體標記微球-待測抗原-第二單克隆抗體”復合體，從而使得檢測線上不會產生熒光微球富集，沒有和待測抗原結合的抗體標記微球則會直接通過檢測線，達到質控線后被質控線上的IgG抗體捕獲，從而使得熒光微球富集在質控線上，即判為陰性結果。可選的，所述標記墊上含有的抗體標記微球是將所述抗體標記微球以2-3mg/mL的濃度溶于噴涂緩沖液中，使用3-5μL/cm的噴涂速度通過噴金點膜機噴涂在標記墊上干燥后得到的；其中，所述噴涂緩沖液為含有質量體積百分比為0.3-0.7％的BSA和質量體積百分比為0.2-0.3％的Tween-20的濃度為0.01-0.03M的磷酸鹽緩沖液，所述噴涂緩沖液的pH值為7.2-7.6。在本公開的一種實施方式中，可以首先繪制待測抗原的標準曲線從而利用該標準曲線對待測抗原進行定量檢測。標準曲線的繪制：將待測抗原標準品配制成梯度濃度標準溶液進行熒光強度測定，以T線、C線的熒光強度比值(T線檢測值/C線檢測值)為縱坐標，待測抗原標準溶液濃度為橫坐標，建立方程并擬合成標準曲線。在本公開第四個方面的一種具體的實施方式中，所述待測抗原為糖化載脂蛋白A1。以下通過實施例進一步詳細說明本公開：以下實施例中，除特別說明外硼酸鹽緩沖液的濃度為0.03-0.07M，pH為8.0-8.5，磷酸鹽緩沖液的濃度為0.01-0.03M，pH為7.2-7.6。實施例1本實施例用于說明本公開所述的方法。制備糖化載脂蛋白A1抗體溶液：用硼酸鹽緩沖液將糖化載脂蛋白A1抗體(CosmoBio,Tokyo,Japan)透析得到糖化載脂蛋白A1抗體溶液，透析溫度為4℃，透析時間18h；將糖化載脂蛋白A1抗體溶液濃度調整為1.6mg/mL。抗體的定向包被：用125μL緩沖液將2.4mg聚苯乙烯熒光微球(聚苯乙烯包埋有機熒光染料微球，尺寸為200nm)懸浮后，加10μl糖化載脂蛋白A1抗體溶液到熒光微球懸浮液中，使所述的糖化載脂蛋白A1抗體與熒光微球的質量比約為1:150，加入工作濃度為1mg/mL的3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)和工作濃度為10mg/mL的BSA形成反應緩沖液，室溫反應30min后在15000rpm、4℃條件下離心收集得到抗體標記微球1。實施例2采用實施例1的方法制備抗體標記微球，區別僅在于，APTES的工作濃度為0.8mg/mL，BSA的工作濃度為9mg/mL，制備獲得抗體標記微球2。實施例3采用實施例1的方法制備抗體標記微球，區別僅在于，APTES的工作濃度為1.2mg/mL，BSA的工作濃度為11mg/mL，制備獲得抗體標記微球3。實施例4采用實施例1的方法制備抗體標記微球，區別僅在于，聚苯乙烯熒光微球的用量為4.8mg，糖化載脂蛋白A1抗體與熒光微球的質量比為1：300，制備獲得抗體標記微球4。實施例5采用實施例1的方法制備抗體標記微球，區別僅在于，聚苯乙烯熒光微球的用量為1.2mg，糖化載脂蛋白A1抗體與熒光微球的質量比為1：75，制備獲得抗體標記微球5。實施例6采用實施例1的方法制備抗體標記微球，區別僅在于，將APTES替換為等質量的(3-氨基丙基)二甲基乙氧基硅烷，制備獲得抗體標記微球6。對比例1采用實施例1的方法制備抗體標記微球，區別僅在于，反應體系中不添加APTES，制得抗體標記微球D1。對比例2采用實施例1的方法制備抗體標記微球，區別僅在于，所述帶氨基基團的烷基硅氧烷的工作濃度為1.5mg/mL，制得抗體標記微球D2。制備例1-8用噴金點膜機將第二單克隆抗體和兔抗鼠IgG噴于硝酸纖維素膜上，形成相互平行的檢測T線和質控C線，然后烘干；分別將抗體標記微球1-6和D1-D2分別以2.3mg/mL的濃度溶于噴涂緩沖液中，使用4μL/cm的噴涂速度均勻的噴涂在標記墊上，所述噴涂緩沖液為含有0.3-0.7％的BSA和0.2-0.3％的Tween-20濃度為0.01-0.03M磷酸鹽緩沖液，pH值為7.2-7.6。對于T線和C線，噴金點膜機的噴涂速度為1μL/cm，T線為濃度1mg/mL的第二單克隆抗體，C線為濃度1mg/mL的兔抗鼠IgG抗體。然后將樣品墊、金標墊、噴有T線和C線的基膜(硝酸纖維素膜)和吸水紙依次連接組裝，而后裁切包裝備用。共得到8種熒光免疫層析試紙。測試例1本測試例用于說明熒光免疫層析試紙條(即利用抗體標記微球1-6和D1-D2制備的試紙條)在檢驗實際樣本時的敏感性和特異性。(1)樣品制備：采集人血清100μL。(2)檢測：取試紙條，室溫平衡10分鐘，打開包裝取出試紙條；將50μL血清與50μL的含0.2％(質量體積百分比)BSA濃度為0.02M，pH為7.4的磷酸鹽緩沖液混勻后，從中取80μL混合液加入到試紙條樣品墊上，靜置15分鐘后，將試紙條按照箭頭方向插入干式熒光免疫檢測儀中判定結果。(3)結果判定：當時紙條質控線有熒光，檢測線無熒光，判為陰性，記為“－”；當試紙條質控線有熒光，同時檢測線有熒光，判為陽性，記為“+”；檢測熒光強度與待檢抗原量成正比，熒光越強說明待檢抗原含量越高，質控線無熒光條帶則判為試紙條失效。陰性和陽性結果示意圖如圖2、3所示，箭頭所指分別為加樣處和層析方向。選用購買的含有60mg/mL人血清白蛋白、100ng/mL癌胚抗原、1.6mg/mL高密度脂蛋白HDL的溶液和糖化載脂蛋白A1標準品進行特異性測定，檢測結果如表1所示，結果表明，用抗體標記微球1-6制備的試紙條可以特異性識別人糖化載脂蛋白A1，但與人血清白蛋白、癌胚抗原、高密度脂蛋白HDL不呈現陽性反應。而用對比例制備的抗體標記微球D1和D2制備的試紙則出現了非特異性的檢測結果，說明利用本公開所述的方法對抗體進行定向包被可以提高檢測的特異性。表1試紙條特異性試驗結果試紙人糖化載脂蛋白A1標準品人血清白蛋白癌胚抗原高密度脂蛋白HDL1+---2+---3+---4+---5+---6+---D1+-+-D2++--將人糖化載脂蛋白A1進行梯度稀釋，用試紙條進行靈敏度檢測，檢測結果見表2，表2結果顯示，用抗體標記微球1-6制備的試紙條的靈敏度可達10ng/mL，而用對比例制備的抗體標記微球D1和D2制備的試紙則出現了試紙條靈敏度僅為100ng/mL和1μg/mL的檢測結果，說明利用本公開所述的方法對抗體進行定向包被可以提高檢測的靈敏度，提高抗體的利用率。表2試紙條靈敏度試驗結果以上結合附圖詳細描述了本公開的優選實施方式，但是，本公開并不限于上述實施方式中的具體細節，在本公開的技術構思范圍內，可以對本公開的技術方案進行多種簡單變型，這些簡單變型均屬于本公開的保護范圍。另外需要說明的是，在上述具體實施方式中所描述的各個具體技術特征，在不矛盾的情況下，可以通過任何合適的方式進行組合，為了避免不必要的重復，本公開對各種可能的組合方式不再另行說明。此外，本公開的各種不同的實施方式之間也可以進行任意組合，只要其不違背本公開的思想，其同樣應當視為本公開所公開的內容。當前第1頁1 2 3