一種同時測定舒血寧注射液中多組分含量的方法與流程

本發(fā)明涉及藥物檢測領(lǐng)域，更具體地說，本發(fā)明涉及一種同時測定舒血寧注射液中多組分含量的高效液相色譜檢測方法。
背景技術(shù)：
：舒血寧注射液在臨床用于心血管病及周圍循環(huán)障礙性疾病的治療，是通過多靶點多環(huán)節(jié)起作用的。它可以降低高同型半胱氨酸(Hcy)帶來的心血管風(fēng)險；降低與動脈粥樣硬化發(fā)生、演變和發(fā)展有關(guān)的促炎因子血漿C反應(yīng)蛋白(CRP)；降低具有強烈的收縮血管和促進血小板聚集的血栓素B2(TXB2)；降低對細(xì)胞及細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能可造成種種損傷的血清過氧化脂質(zhì)(LOP)；降低廣泛存在于各種組織和細(xì)胞中內(nèi)源性縮血管活性物質(zhì)內(nèi)皮素(ET)；降低作為血小板和內(nèi)皮細(xì)胞活化程度的血液測定指標(biāo)P選擇素(P-s)；降低參與動脈粥樣硬化的初始、發(fā)展、斑塊糜爛、破裂及血栓并發(fā)癥全過程的可溶性血管外周血粒細(xì)胞表面粘附分子(CDlla)；降低應(yīng)激狀態(tài)下增高的神經(jīng)內(nèi)分泌激素(ACTH、ET、CORT、TXB2、PGI2)，避免血管損傷加重；降低增高的血液流變學(xué)指標(biāo)；降低病理損傷時升高的血漿腦鈉肽(BNP)；降低促使神經(jīng)細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞發(fā)生凋亡，在細(xì)胞凋亡與細(xì)胞生存調(diào)節(jié)中發(fā)揮極其重要作用的糖原合成酶激酶3β；阻止白細(xì)胞的活化，抑制白細(xì)胞變形性的下降及黏附性的增加而減輕腦缺血后腦損傷；降低影響細(xì)胞順利吸收營養(yǎng)、氧氣、削弱細(xì)胞正常功能的蘊粵；降低引起蛋白質(zhì)、核酸等生命大分子的交聯(lián)聚合，且具有細(xì)胞毒性的丙二醛(MDA)。同時，能提高患者體內(nèi)消除生物體在新陳代謝過程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)，源于生命體的活性物質(zhì)—SOD；升高能舒張血管，抑制血小板黏附聚集、清除自由基、維持正常的心排血量，具有細(xì)胞保護作用的一氧化氮。舒血寧注射液的活性成分為銀杏葉提取物，其有效成分主要為黃酮苷類和萜類內(nèi)酯活性物質(zhì)，舒血寧質(zhì)量控制方法普遍是測定這兩類成分的含量。王京輝等提供了一種舒血寧注射液、銀杏葉提取物及銀杏葉指紋圖譜(藥物分析雜志，2008，28(7)1026～1030頁)；周欣等提供了一種銀杏葉片劑中銀杏黃酮的HPLC指紋圖譜(中國藥學(xué)雜志，2005年1月第40卷第2期，93～95頁)；帥麗英等提供了一種銀杏葉提取物的HPLC/UV指紋圖譜(中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2011年5月第8卷第15期，55～57頁)等。上述指紋圖譜可以對銀杏葉提取物或銀杏提取物相關(guān)制劑的質(zhì)量控制起到一定作用。但是指紋圖譜的缺點是無法定量的評價其有效成分的含量。CN104034826提供了一種使用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器檢測銀杏葉萜類內(nèi)酯的方法，采用該方法可以同時檢測4種萜類內(nèi)酯；劉會等公開了一種以HPLC-UV法測定銀杏葉提取物中3個黃酮醇苷含量，并以HPLC-ELSD法測定4個萜類內(nèi)酯含量的方法(中華中醫(yī)藥雜志(原中國醫(yī)藥學(xué)報)2015年2月第30卷第2期，第598～601頁)。上述方法是采用不同的檢測方法分別檢測萜類內(nèi)酯和黃酮醇苷，缺點是需要采用不同的儀器、不同的樣品處理條件分別進樣，從而導(dǎo)致操作步驟繁雜，工藝簡便性不足。崔大明等公開了一種采用RP-HPLC測定銀杏葉提取物類脂質(zhì)體中的3種銀杏黃酮苷(槲皮素、山奈素、異鼠李素)以及4種萜類內(nèi)酯(銀杏內(nèi)酯A、銀杏內(nèi)酯B、銀杏內(nèi)酯C、白果內(nèi)酯)含量的方法(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2013，35(4):446～449，462)；任艷平等公開了一種采用HPLC－MS同時測定舒血寧注射液中銀杏內(nèi)酯A(GA)、銀杏內(nèi)酯B(GB)、銀杏內(nèi)酯C(GC)、白果內(nèi)酯、(BB)以及槲皮素(QCT)、異鼠李素(ISR)和山柰酚(KAE)等7個成分含量的方法(藥物分析雜志，2013，33(2)第220～224頁)。上述方法與指紋圖譜方法相比，可以檢測并標(biāo)定有效成分含量，能夠更好的控制產(chǎn)品質(zhì)量。另外，由于可以同時檢測黃酮苷和萜類內(nèi)酯，大大簡化了操作流程。在上述的眾多檢測方法中同時測定多種成分含量時需用到每一種成分的對照品，這樣會讓多指標(biāo)綜合質(zhì)量控制在實際生產(chǎn)和檢測工作中會因檢測成本過高而使質(zhì)量控制指標(biāo)減少，不利于藥材質(zhì)量的全面評價。由此可見，嘗試引入一測多評方法以實現(xiàn)各類成分的同時檢測是規(guī)范和完善舒血寧注射液的質(zhì)量控制的必備之選。張方等公開了一種“一測多評法同時測定舒血寧注射液中6中黃酮類成分”(《中國藥師》，2015年第18卷第10期，1652～1656頁)的方法；楊艷模等公開了一測多評技術(shù)在銀杏葉提取物及其金雞制劑中的應(yīng)用研究(湖南中醫(yī)藥大學(xué)碩士學(xué)位論文，2014年)。但是，上述兩種方法的可檢測的組分較少，且不能同時檢測黃酮類和酚酸類成分，因此有必要進行更深入研究，開發(fā)更好的檢測技術(shù)。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種同時測定舒血寧注射液中14種黃酮苷類組分和2種酚酸類組分含量的檢測方法。使用這種方法，可以更好的控制制劑的質(zhì)量，保證用藥的安全性，能夠更好地指導(dǎo)生產(chǎn)，使生產(chǎn)工藝控制更加嚴(yán)格合理，使消費者能夠全面認(rèn)識產(chǎn)品質(zhì)地。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為：一種采用高效液相色譜法同時測定舒血寧注射液中黃酮苷類和酚酸類組分含量的方法，該法采用的色譜條件為：固定相是以十八烷基鍵合硅膠為填料的色譜柱；柱溫33℃～37℃；洗脫流速為0.1～0.5mL/min；流動相A是含質(zhì)量比0.1％的甲酸的水溶液；流動相B是甲醇和乙腈的混合溶劑，體積比是1：1；進行梯度洗脫，梯度條件為：時間(min)A(％)B(％)0881288515107723157723167624257030266535346535358812采用二極管陣列檢測器，采用270nm～290nm范圍內(nèi)的紫外波長檢測酚酸類組分，并同時采用350nm～370nm范圍內(nèi)的紫外波長檢測黃酮苷類成分。在一些實施方案中，色譜柱優(yōu)選的柱溫為35℃。在一些實施方案中，所述洗脫流速優(yōu)選0.3mL/min。在一些實施方案中，優(yōu)選采用280nm的紫外波長檢測酚酸類組分。在一些實施方案中，優(yōu)選采用360nm的紫外波長檢測黃酮苷類組分。在一些實施方案中，優(yōu)選采用280nm的紫外波長檢測酚酸類組分，同時采用360nm的紫外波長檢測黃酮苷類組分。在一些實施方案中，優(yōu)選采用外標(biāo)法計算所述黃酮苷類和酚酸類組分的含量。在一些實施方案中，優(yōu)選采用一測多評法計算所述黃酮苷類和酚酸類組分的含量，其中黃酮苷類組分以蘆丁為內(nèi)標(biāo)，酚酸類組分以隱綠原酸為內(nèi)標(biāo)。在一些實施方案中，進樣體積為1μL。在一些實施方案中，所述色譜柱為ACQUITYUPLCBEHC18色譜柱。在一些實施方案中，所述色譜柱規(guī)格為1.7μm，2.1×150mm。本發(fā)明所述的2種酚酸類組分分別為原兒茶酸和隱綠原酸；所述的14種黃酮類組分分別為碟豆素、蘆丁、異槲皮苷、槲皮素-3-O-葡萄糖基(1→2)鼠李糖苷、山奈酚-3-O-蕓香糖苷、紫云英苷、大波斯菊苷、水仙苷、異鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷、3-O-{2-O-[6-O-(對羥基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}-槲皮素、槲皮素、3-O-{2-O-[6-O-(對羥基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-(1-2)鼠李糖基}-山奈酚、山奈酚、異鼠李素。本發(fā)明的方法與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點和積極效果：(1)本發(fā)明的方法能在同一個高效液相色譜條件下同時測定舒血寧注射液中14種黃酮苷類組分和2種酚酸類組分的含量，避免了在檢測中頻繁更換液相條件，提高了工作效率，適合工業(yè)大生產(chǎn)的要求。(2)本發(fā)明的方法耐用性好，容易實現(xiàn)，所用儀器設(shè)備及試劑均是常規(guī)用品，試驗參數(shù)也是常規(guī)參數(shù)，無苛刻條件，成本低，大多數(shù)實驗室的條件均能滿足。(3)本發(fā)明的一測多評法，選取兩個廉價、易得、穩(wěn)定的成分作為內(nèi)參物完成對其他14種成分的同時測定，解決其他成分對照品不易獲得所導(dǎo)致的檢測方法難以運用到實際生產(chǎn)的問題。附圖附圖1：混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液在280nm吸收波長的色譜圖；附圖2：混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液在360nm吸收波長的色譜圖；附圖3：舒血寧注射液在280nm吸收波長的色譜圖；附圖4：舒血寧注射液在360nm吸收波長的色譜圖；附圖1至附圖4均為：1：原兒茶酸；2：隱綠原酸；3：碟豆素；4：蘆??；5：異槲皮苷；6：槲皮素-3-O-葡萄糖基(1→2)鼠李糖苷；7：山奈酚-3-O-蕓香糖苷；8：紫云英苷；9：大波斯菊苷；10：水仙苷；11：異鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷；12：3-O-{2-O-[6-O-(對羥基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}-槲皮素；13：槲皮素；14：3-O-{2-O-[6-O-(對羥基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-(1-2)鼠李糖基}-山奈酚；15：山奈酚；16：異鼠李素。具體實施方案下述是結(jié)合具體實施例進一步闡述本發(fā)明。但這些實施例僅限于說明本發(fā)明而不是用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體實驗條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件。實施例：1、色譜條件色譜柱：ACQUITYUPLCBEHC18(1.7μm,2.1×150mm)；流動相B：甲醇/乙腈(1:1)；流動相A：超純水(含0.1％甲酸)；流速：0.3mL/min；柱溫：35℃；進樣體積：1μL；二極管陣列檢測器：采用280nm紫外波長檢測酚酸類組分，并同時采用360nm紫外波長檢測黃酮苷類組分；分析時間：35min；梯度洗脫方法：時間(min)A(％)B(％)08812885151077231577231676242570302665353465353588122.溶液的配制(1)對照品儲備液的制備精密稱取原兒茶酸、隱綠原酸、碟豆素、蘆丁、異槲皮苷、槲皮素-3-O-葡萄糖基(1→2)鼠李糖苷、山奈酚-3-O-蕓香糖苷、紫云英苷、大波斯菊苷、水仙苷、異鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷、3-O-{2-O-[6-O-(對羥基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}-槲皮素、槲皮素、3-O-{2-O-[6-O-(對羥基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-(1-2)鼠李糖基}-山奈酚、山奈酚、異鼠李素對照品5mg，分別加甲醇配成濃度為1mg/mL的單一對照品儲備液，置4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?2)樣品制備方法將舒血寧注射液以14000r/min的速度離心10min，取上清液，將上清液再以14000r/min的速度離心10min，取上清液，作為舒血寧注射液樣品儲備液置4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?3)測定方法外標(biāo)法：精密量取對照品溶液和供試品溶液各1μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。一測多評法：精密量取對照品溶液和供試品溶液各1μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按加校正因子的替代對照品法以峰面積計算，即得，其中校正因子見表1。3.方法學(xué)考察(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線將上原兒茶酸、隱綠原酸、碟豆素、蘆丁、異槲皮苷、槲皮素-3-O-葡萄糖基(1→2)鼠李糖苷、山奈酚-3-O-蕓香糖苷、紫云英苷、大波斯菊苷、水仙苷、異鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷、3-O-{2-O-[6-O-(對羥基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}-槲皮素、槲皮素、3-O-{2-O-[6-O-(對羥基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-(1-2)鼠李糖基}-山奈酚、山奈酚、異鼠李素對照品配制成濃度分別為40ug/ml、40ug/ml、150ug/ml、200ug/ml、50ug/ml、100ug/ml、200ug/ml、50ug/ml、40ug/ml、200ug/ml、40ug/ml、100ug/ml、40ug/ml、100ug/ml、40ug/ml、30ug/ml的混合母液，并以2倍逐級稀釋成8個點。將上述混合母液按照上述色譜條件進樣1μl，記錄峰面積，紫外波長280nm下得譜圖圖1，紫外波長360nm下的譜圖圖2。紫外條件下，以進樣濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得直線回歸方程。分別以信噪比S/N3:1和10:1作為檢測限(LOD)和最低定量限(LOQ)。其標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍見表1。從表中可以得知，16個化合物在線性范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)均大于0.999，表明16個化合物線性關(guān)系良好。(2)相對校正因子的計算相對校正因子的計算方法有兩種：一是將各化合物標(biāo)準(zhǔn)曲線截距校正為零后，斜率之比即為各化合物的校正因子；二是按照定義fa/b＝fa/fb＝(Aa/Ca)/(Ab/Cb)，其中A為化合物的峰面積，C為濃度，求得各個校正因子后計算平均值即得。黃酮苷類化合物以蘆丁為內(nèi)標(biāo)，酸類化合物以隱綠原酸為內(nèi)標(biāo)，各化合物均適合第一種計算方法。各化合物的相對校正因子于表1中。表1標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍、LODs、LOQs和相對校正因子(RCF)注：A：原兒茶酸；B：隱綠原酸；C：碟豆素；D：蘆丁；E：異槲皮苷；F：槲皮素-3-O-葡萄糖基(1→2)鼠李糖苷；G：山奈酚-3-O-蕓香糖苷；H：紫云英苷；I:大波斯菊苷；J：水仙苷；K：異鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷；L：3-O-{2-O-[6-O-(對羥基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}-槲皮素；M：槲皮素；N：3-O-{2-O-[6-O-(對羥基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-(1-2)鼠李糖基}-山奈酚；O：山奈酚；P：異鼠李素。(3)精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗分別制備低、中、高三個濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，對供試品溶液進行日內(nèi)、日間精密度和穩(wěn)定性的考察。日內(nèi)精密度為低、中、高三個水平的同一份供試品溶液在一天內(nèi)連續(xù)進樣6次，日間精密度為連續(xù)3天內(nèi)連續(xù)進樣6次。穩(wěn)定性實驗為低、中、高3個濃度的供試品溶液分別在0、2、4、6、8、12、24h內(nèi)進樣。重復(fù)性實驗為平行制備6份舒血寧注射液樣品溶液，連續(xù)進樣。分別按外標(biāo)法和“一測多評”法求得各化合物的回收率，并計算RSD值，重復(fù)性實驗結(jié)果見表1，精密度和穩(wěn)定性實驗結(jié)果見表2、表3。結(jié)果表明，該方法準(zhǔn)確、穩(wěn)定、重復(fù)性高，可以用于舒血寧注射液含量測定。表2外標(biāo)法計算精密度、穩(wěn)定性試驗結(jié)果注：A：原兒茶酸；B：隱綠原酸；C：碟豆素；D：蘆?。籈：異槲皮苷；F：槲皮素-3-O-葡萄糖基(1→2)鼠李糖苷；G：山奈酚-3-O-蕓香糖苷；H：紫云英苷；I:大波斯菊苷；J：水仙苷；K：異鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷；L：3-O-{2-O-[6-O-(對羥基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}-槲皮素；M：槲皮素；N：3-O-{2-O-[6-O-(對羥基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-(1-2)鼠李糖基}-山奈酚；O：山奈酚；P：異鼠李素。表3一標(biāo)多評法計算精密度、穩(wěn)定性試驗結(jié)果注：A：原兒茶酸；B：隱綠原酸；C：碟豆素；D：蘆??；E：異槲皮苷；F：槲皮素-3-O-葡萄糖基(1→2)鼠李糖苷；G：山奈酚-3-O-蕓香糖苷；H：紫云英苷；I:大波斯菊苷；J：水仙苷；K：異鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷；L：3-O-{2-O-[6-O-(對羥基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}-槲皮素；M：槲皮素；N：3-O-{2-O-[6-O-(對羥基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-(1-2)鼠李糖基}-山奈酚；O：山奈酚；P：異鼠李素。(4)加樣回收率取已知含量的舒血寧注射液置容量瓶中，分別精密加入舒血寧注射液中各個化合物含量的80％、100％、120％，每個濃度平行操作3份，按照“2(2)樣品溶液的制備”項下方法進行處理，以(測得量-原有量)/加標(biāo)量×100％計算回收率，并分別按外標(biāo)法和“一測多評”法求得各化合物的加樣回收率，并計算RSD值，結(jié)果見表4和5。結(jié)果顯示，各化合物的加樣回收率均在94.9％-105％之間，RSD值均小于5％。表4外標(biāo)法計算加樣回收率注：A：原兒茶酸；B：隱綠原酸；C：碟豆素；D：蘆??；E：異槲皮苷；F：槲皮素-3-O-葡萄糖基(1→2)鼠李糖苷；G：山奈酚-3-O-蕓香糖苷；H：紫云英苷；I:大波斯菊苷；J：水仙苷；K：異鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷；L：3-O-{2-O-[6-O-(對羥基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}-槲皮素；M：槲皮素；N：3-O-{2-O-[6-O-(對羥基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-(1-2)鼠李糖基}-山奈酚；O：山奈酚；P：異鼠李素。表5一測多評法計算加樣回收率注：A：原兒茶酸；B：隱綠原酸；C：碟豆素；D：蘆丁；E：異槲皮苷；F：槲皮素-3-O-葡萄糖基(1→2)鼠李糖苷；G：山奈酚-3-O-蕓香糖苷；H：紫云英苷；I:大波斯菊苷；J：水仙苷；K：異鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷；L：3-O-{2-O-[6-O-(對羥基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}-槲皮素；M：槲皮素；N：3-O-{2-O-[6-O-(對羥基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-(1-2)鼠李糖基}-山奈酚；O：山奈酚；P：異鼠李素。4.樣品含量測定“一測多評”分析方法用來測定舒血寧注射液中兩種類型的成分：酚酸類和黃酮類成分。3批舒血寧注射液在“1色譜條件”下依次測定，色譜圖如圖3和圖4所示。將外標(biāo)法和一測多評法結(jié)果進行對比，結(jié)果列于表6。結(jié)果表明，“一測多評”分析方法和“外標(biāo)法”得出的結(jié)果基本一致(RSDs<5％)，說明“一測多評”方法可以用來對舒血寧注射液進行質(zhì)量控制。表63批舒血寧注射液16個化學(xué)成分的含量注：A：原兒茶酸；B：隱綠原酸；C：碟豆素；D：蘆?。籈：異槲皮苷；F：槲皮素-3-O-葡萄糖基(1→2)鼠李糖苷；G：山奈酚-3-O-蕓香糖苷；H：紫云英苷；I:大波斯菊苷；J：水仙苷；K：異鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷；L：3-O-{2-O-[6-O-(對羥基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}-槲皮素；M：槲皮素；N：3-O-{2-O-[6-O-(對羥基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-(1-2)鼠李糖基}-山奈酚；O：山奈酚；P：異鼠李素；E.M代表外標(biāo)法法計算出的含量，N.M代表“少標(biāo)多評”法計算出的含量，R.D為相對偏差。5校正因子驗證為了進一步驗證相對校正因子的適用性，將舒血寧注射液按照“2(2)樣品溶液的制備”項下方法進行處理，分別在不同波長、不同溫度下計算相對矯正因子，并與以上實驗所得校正因子進行比較分析。結(jié)果如表7所示,在不同溫度下，相對校正因子穩(wěn)定可靠，在不同波長下有所差異，但較穩(wěn)定。表7校正因子驗證結(jié)果注：A：原兒茶酸；B：隱綠原酸；C：碟豆素；D：蘆??；E：異槲皮苷；F：槲皮素-3-O-葡萄糖基(1→2)鼠李糖苷；G：山奈酚-3-O-蕓香糖苷；H：紫云英苷；I:大波斯菊苷；J：水仙苷；K：異鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷；L：3-O-{2-O-[6-O-(對羥基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-鼠李糖基}-槲皮素；M：槲皮素；N：3-O-{2-O-[6-O-(對羥基-反-香豆酰)-葡萄糖基]-(1-2)鼠李糖基}-山奈酚；O：山奈酚；P：異鼠李素。應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3