負載農藥吡唑醚菌酯樣品的制備方法、用途及其在蘆葦莖枯病原菌中熒光示蹤的應用與流程

本發明涉及農藥負載應用技術領域，特別涉及負載農藥吡唑醚菌酯樣品的制備方法、用途及其在蘆葦莖枯病原菌中熒光示蹤的應用。

背景技術：

介孔二氧化硅納米具有光、電、磁等獨特性質，高度有序且連續可調控的介孔結構，大的比表面積，表面官能團易于修飾，優良的生物相容性等一系列的優點，引起了人們的廣泛關注。碳量子點是熒光碳納米材料中最重要的一種，相對于傳統的半導體量子點和有機染料，熒光碳量子點具有粒徑小、化學惰性高、低毒和易于功能化等優點，廣泛應用于生物醫藥研究。將碳量子點摻雜在介孔二氧化硅上，可以充分發揮二者各自的優點，作為載體材料，沒有在輸送農藥方面的應用報道。

技術實現要素：

有鑒于此，本發明在于提供一種負載農藥吡唑醚菌酯樣品的制備方法，使得制備出來負載農藥吡唑醚菌酯樣品可以負載和釋放農藥吡唑醚菌酯，可用于抑制蘆葦莖枯病病原菌，并且可用于載藥體系在蘆葦莖枯病病原菌中的熒光示蹤。

本發明是通過如下技術方案實現的：

負載農藥吡唑醚菌酯樣品的制備方法，包括如下步驟：

(1)載體材料的制備：制備介孔二氧化硅碳量子點材料作為載體材料；

(2)將農藥吡唑醚菌酯負載在介孔二氧化硅碳量子點材料上，得負載農藥吡唑醚菌酯樣品。

上述負載農藥吡唑醚菌酯樣品的制備方法，在步驟(1)中，包括如下步驟：

(1-1)將十六烷基三甲基溴化銨溶于水中，攪拌，加入氫氧化鈉溶液，加熱；

(1-2)向步驟(1-1)得到的溶液中加入正硅酸乙酯、乙酸乙酯和3-氨丙基三乙氧基硅烷，攪拌；

(1-3)將步驟(1-2)中得到的混合溶液離心，離心后得到的固體用乙醇清洗，再分散于乙醇中，得乙醇懸浮液；

(1-4)向步驟(1-3)得到的溶液中加入飽和氯化氫水溶液，攪拌，除去十六烷基三甲基溴化銨；

(1-5)將步驟(1-4)中得到的溶液離心，離心后得到的固體用乙醇清洗，烘干過夜，然后置于馬弗爐中煅燒，得到介孔二氧化硅碳量子點材料。

上述負載農藥吡唑醚菌酯樣品的制備方法，在步驟(1-1)中：將十六烷基三甲基溴化銨溶于水時，十六烷基三甲基溴化銨與水的質量體積比為0.2:96g/mL；氫氧化鈉溶液的濃度為2mol/L，十六烷基三甲基溴化銨與氫氧化鈉溶液質量體積比為2/7g/mL；將混合液加熱至80℃。

上述負載農藥吡唑醚菌酯樣品的制備方法，在步驟(1-2)中：正硅酸乙酯的加入量與氫氧化鈉溶液的加入量體積之比為2:1，乙酸乙酯的加入量與氫氧化鈉溶液的加入量體積之比為3:0.7，3-氨丙基三乙氧基硅烷與正硅酸乙酯的加入量體積之比為1:4；在80℃條件下攪拌2h；在步驟(1-3)中：用乙醇清洗3次。

上述負載農藥吡唑醚菌酯樣品的制備方法，在步驟(1-4)中：飽和氯化氫水溶液的加入量為40μL，在60℃條件下攪拌3h。

上述負載農藥吡唑醚菌酯樣品的制備方法，在步驟(1-5)中：將離心得到的固體用乙醇清洗2次，在60℃條件下烘干過夜；然后在400℃條件下，置于馬弗爐中煅燒2h。

上述負載農藥吡唑醚菌酯樣品的制備方法，在步驟(2)中，包括如下步驟：

(2-1)將介孔二氧化硅碳量子點材料和吡唑醚菌酯原藥加入到50mL甲醇中，超聲；

(2-2)離心，并用去離子水清洗下層固體；

(2-3)烘干即得負載農藥吡唑醚菌酯樣品。

上述負載農藥吡唑醚菌酯樣品的制備方法，在步驟(2-1)中：介孔二氧化硅碳量子點材料和吡唑醚菌酯原藥質量之比為1:2；在步驟(2-2)中：去離子水清洗3次；在步驟(2-3)中：烘干溫度為40℃。

上述負載農藥吡唑醚菌酯樣品的制備方法，按照上述制備方法制備得到負載農藥吡唑醚菌酯樣品，將負載農藥吡唑醚菌酯樣品用于抑制蘆葦莖枯病原菌。

負載農藥吡唑醚菌酯樣品在蘆葦莖枯病原菌中熒光示蹤的應用，包括如下步驟：

(1)按照上述制備方法得到負載農藥吡唑醚菌酯樣品；

(2)將負載農藥吡唑醚菌酯樣品分散于無菌水中得到樣品溶液，樣品濃度為0.2～10mg/L用樣品溶液處理蘆葦莖枯病原菌菌絲體，使用激光共聚焦顯微鏡觀察。

本發明的有益效果是：

介孔二氧化硅納米具有光、電、磁等獨特性質，高度有序且連續可調控的介孔結構，大的比表面積，表面官能團易于修飾，優良的生物相容性等一系列的優點。碳量子點是熒光碳納米材料中最重要的一種，相對于傳統的半導體量子點和有機染料，具有粒徑小、化學惰性高、低毒和易于功能化等優點。本發明合成了具有嵌入碳量子點的介孔二氧化硅碳量子點材料，其結合了兩者的優點，能夠負載農藥吡唑醚菌酯，成功地建立了具有熒光性質的納米載藥體系，研究了介孔二氧化硅碳量子點材料在不同pH條件下的釋放性質，并在抑菌實驗中通過碳量子點的熒光性質來示蹤納米載藥體系對菌絲體的影響。

附圖說明

圖1載藥樣品和載體材料及原藥的紅外譜圖(Py：吡唑醚菌酯原藥；MSN-CDs：介孔二氧化硅碳量子點材料；MSN-CDs-Py：吡唑醚菌酯載藥樣品)；

圖2載體材料的熒光光譜圖；

圖3載體材料和載藥樣品的氮氣吸附曲線；

圖4載體材料和載藥樣品的孔徑分布圖；

圖5載體材料和載藥樣品及原藥的熱重分析曲線；

圖6-1載體材料的透射電鏡圖(A)；

圖6-2載體材料的掃描電鏡圖(B)；

圖7-1載藥樣品的透射電鏡圖(A)；

圖7-2載藥樣品的掃描電鏡圖(B)；

圖8載體材料的原子力顯微鏡圖；

圖9不同pH條件下樣品的釋放曲線；

圖10 1為CK組的蘆筍莖枯；2為載藥樣品處理的蘆筍莖枯，其中A-熒光圖；B-明場圖；C-熒光與明場的疊加圖。

具體實施方式

為清楚說明本發明中的方案，下面給出優選的實施例并結合附圖詳細說明。

本實施例負載農藥吡唑醚菌酯樣品的制備方法，包括如下步驟：

(1)載體材料的制備：制備介孔二氧化硅碳量子點材料作為載體材料；

(1-1)將十六烷基三甲基溴化銨溶于水中，攪拌，加入氫氧化鈉溶液，加熱；將十六烷基三甲基溴化銨溶于水時，十六烷基三甲基溴化銨與水的質量體積比為0.2:96g/mL；氫氧化鈉溶液的濃度為2mol/L，十六烷基三甲基溴化銨與氫氧化鈉溶液質量體積比為2/7g/mL；將混合液加熱至80℃。

(1-2)向步驟(1-1)得到的溶液中加入正硅酸乙酯、乙酸乙酯和3-氨丙基三乙氧基硅烷，攪拌；正硅酸乙酯的加入量與氫氧化鈉溶液的加入量體積之比為2:1，乙酸乙酯的加入量與氫氧化鈉溶液的加入量體積之比為3:0.7，3-氨丙基三乙氧基硅烷與正硅酸乙酯的加入量體積之比為1:4；在80℃條件下攪拌2h。

(1-3)將步驟(1-2)中得到的混合溶液離心，離心后得到的固體用乙醇清洗3次，再分散于乙醇中，得乙醇懸浮液。

(1-4)向步驟(1-3)得到的溶液中加入40μL飽和氯化氫水溶液，在60℃條件下攪拌3h，除去十六烷基三甲基溴化銨。

(1-5)將步驟(1-4)中得到的溶液離心，離心后得到的固體用乙醇清洗2次，在60℃條件下烘干過夜，然后在400℃條件下置于馬弗爐中煅燒2h，得到介孔二氧化硅碳量子點材料。

(2)將農藥吡唑醚菌酯負載在介孔二氧化硅碳量子點材料上，得負載農藥吡唑醚菌酯樣品。

(2-1)將介孔二氧化硅碳量子點材料和吡唑醚菌酯原藥加入到50mL甲醇中，超聲；介孔二氧化硅碳量子點材料和吡唑醚菌酯原藥質量之比為1:2。

(2-2)離心，并用去離子水清洗下層固體，去離子水清洗3次。

(2-3)烘干即得負載農藥吡唑醚菌酯樣品，烘干溫度為40℃。

本實施例制備方法制備得到負載農藥吡唑醚菌酯樣品，可用于抑制蘆葦莖枯病原菌。

將本實施例制備的負載農藥吡唑醚菌酯樣品分散于無菌水中得到樣品溶液，樣品濃度為0.2～10mg/L，用樣品溶液處理蘆葦莖枯病原菌菌絲體，使用激光共聚焦顯微鏡觀察。

本實施例制備的介孔二氧化硅碳量子點材料的性質表征、負載農藥吡唑醚菌酯樣品的性質表征以及通過碳量子點的熒光性質來示蹤納米載藥體系對菌絲體的影響的試驗如下(以下內容中，介孔二氧化硅碳量子點材料稱為載體材料，負載農藥藥吡唑醚菌酯樣品稱為載藥樣品)：

(1)載藥量及包封率測定實驗

稱取載藥樣品，加入甲醇溶液，進行超聲洗脫負載上的吡唑醚菌酯農藥，每次超聲40min，離心后吸取上層洗脫液后繼續超聲洗脫，共洗脫5次，合并得到的洗脫液，定容于25mL的容量瓶中，用移液器吸取1mL的洗脫液，過0.22μm的有機系濾膜后，進高效液相色譜檢測洗脫液中吡唑醚菌酯的含量。根據公式分別計算出載藥樣品的載藥量和包封率。

其中，實驗結果表明，載藥樣品的載藥量為12.98％±0.95，包封率為15.90％。

(2)紅外實驗

通過圖1所示的紅外圖譜可知，吡唑醚菌酯在1546、1481和1358cm^-1處的特征峰均能在載藥樣品上看到，說明吡唑醚菌酯已成功的負載在載體材料上。而位于1088、966、804、467cm^-1處的特征峰為載體材料的官能團。

(3)熒光光譜實驗

稱取載體材料，用超純水配置成濃度均為1mg/mL的懸浮液，應用熒光光譜儀測其熒光性質。通過圖2所示的熒光譜圖可知，在激發波長為360nm條件下，載體材料在448nm處的發射波長下有吸收峰，證明該材料有熒光性質。

(4)比表面積及孔徑測定

載體材料的比表面積與孔徑可通過Brunauer-Emmett-Teller(BET)方法來表征。根據圖3所示氮氣吸附-解吸附等溫曲線可知，載體材料的等溫線符合典型的VI等溫線特征，說明載體材料具有介孔結構，該結論與透射電鏡實驗的分析結果一致。依據BET法計算得出的載體材料的比表面積為433.10m²/g，而載藥樣品的比表面積僅為190.66m²/g，由此也可說明吡唑醚菌酯已成功負載于載體材料上。由載體材料和載藥樣品的孔徑分布曲線(圖4)可知，載體材料的平均孔徑為4.82nm，屬于介孔范疇；而載藥樣品的平均孔徑為6.57nm，大于載體材料的平均孔徑，可能是由于載體上的大部分介孔被吡唑醚菌酯小分子占據，從而造成平均孔徑增大。

(5)熱重分析實驗

應用熱重分析儀對載體材料、載藥樣品和吡唑醚菌酯原藥進行熱重分析實驗，如圖5所示。

(6)微觀形貌

稱取適量的樣品，用超純水分散后，制樣后進行掃描電鏡和透射電鏡觀察。由圖6-1、圖6-2、圖7-1和圖7-2可看出，載體材料為表面光滑的球形顆粒，且大小均勻，平均粒徑為180±6nm，而載藥樣品的粒徑與載體材料相比，粒徑增長不大。

(7)原子力顯微鏡實驗

取載體材料分散于乙醇中，吸取一滴懸浮液滴于處理過的云母片上，待溶劑揮發干后，將樣品片置于檢測臺上進行原子力顯微鏡觀察。如圖8所示，即載體材料的原子力顯微鏡圖，圖中可得出載體材料的地形高度的統計學分布，而且從圖中可知，載體材料為表面光滑的球形，這與掃描電鏡的實驗結果一致。

(8)釋放實驗

采用透析袋法進行釋放實驗。截取長度為7cm，截留分子量為12000的透析袋，加入溶于5ml釋放介質的樣品，將整個透析袋置于200ml的釋放介質中，于200rpm，室溫的搖床上進行釋放實驗。每隔一定的時間，取樣1ml后，過0.22μm的水系濾膜后，進高效液相色譜檢測釋放出的吡唑醚菌酯的量。每次取樣后，補加1ml的釋放介質。根據公式計算出載藥樣品的累計釋放率。

其中，V:每次的取樣體積，1ml；Ci:第i次取樣的濃度，mg/ml；V0:釋放介質的總體積，200ml；Cn:第n次取樣的濃度，mg/ml；m:載藥樣品中吡唑醚菌酯的質量，mg。

釋放介質(體積分數)：30％乙醇+70％不同pH的緩沖溶液+0.5％吐溫-80。

pH＝5.0和7.0的緩沖溶液由磷酸氫二鈉-檸檬酸配制，pH＝9.0的緩沖溶液由甘氨酸和氫氧化鈉配制。

(9)生物活性測定實驗：

稱取載體材料、載藥樣品及吡唑醚菌酯原藥，分散于無菌水中，配成母液，進行蘆筍莖枯真菌抑制實驗。采用帶毒平板法進行生物活性測定實驗，將母液用定量的PDA稀釋成一系列不同的濃度，分別為0.2、0.5、1、2、5、10ppm，即平板所加入的樣品濃度不同，接菌餅后進行生物活性測定實驗。每24h記錄菌落的生長直徑，根據公式計算出不同樣品對蘆筍莖枯的抑制率。

試驗結果如圖9所示。

(10)載藥樣品對真菌作用的熒光實驗

將生物活性測定實驗中被樣品處理過的菌絲體取出一小塊，制樣，置于激光共聚焦顯微鏡下觀察，試驗結果如圖10所示。

上述實施例僅僅是為清楚地說明本發明創造所作的舉例，而并非對本發明創造具體實施方式的限定。對于所屬領域的普通技術人員來說，在上述說明的基礎上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這里無需也無法對所有的實施方式予以窮舉。凡在本發明的精神和原則之內所引伸出的任何顯而易見的變化或變動仍處于本發明創造權利要求的保護范圍之中。