一種采用高效液相色譜檢測厄貝沙坦氫氯噻嗪片中有關(guān)物質(zhì)的方法與流程

本發(fā)明屬于分析化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種采用高效液相色譜檢測厄貝沙坦氫氯噻嗪片中有關(guān)物質(zhì)的方法。
背景技術(shù)：
：厄貝沙坦氫氯噻嗪片為Sanofi公司研制開發(fā)，商品名為安博諾(COAPROVEL)。于1998年在英國上市，并于2004年在中國成功上市。由于兩種藥物的降壓機(jī)制不同，組成復(fù)方制劑后產(chǎn)生協(xié)同作用降壓并增強(qiáng)降壓效果，且能夠互相補(bǔ)充其不足，減少或抵消單藥長期用藥可能出現(xiàn)的不良反應(yīng)，從而增加患者服藥的順應(yīng)性。根據(jù)文獻(xiàn)和美國藥典標(biāo)準(zhǔn)，氫氯噻嗪原料藥和片劑中的己知雜質(zhì)為4-氨基-6-氯-1，3苯二磺酰胺，有可能產(chǎn)生的降解產(chǎn)物有氯噻嗪。厄貝沙坦片中己知雜質(zhì)為厄貝沙坦雜質(zhì)A，由于兩種主藥的理化性質(zhì)差別較大，為能使兩種主藥與雜質(zhì)有效分離，又能節(jié)約分析時間，亟需建立一種檢測方法對其進(jìn)行控制。目前，僅有美國藥典論壇上記載了用于厄貝沙坦氫氯噻嗪片雜質(zhì)檢測的方法，但此方法中的雜質(zhì)精磺胺保留時間過于提前，而且溶劑峰存在干擾，厄貝沙坦出峰時間靠后，峰型較差，檢查時間過長，氫氯噻嗪與其雜質(zhì)氯噻嗪不能完全分離。因此，建立一個準(zhǔn)確有針對性的梯度洗脫程序檢測厄貝沙坦氫氯噻嗪片及其雜質(zhì)的方法具有非常重要的意義。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種采用高效液相色譜檢測厄貝沙坦氫氯噻嗪片中有關(guān)物質(zhì)的分析方法，從而實(shí)現(xiàn)厄貝沙坦氫氯噻嗪及其雜質(zhì)的分離和測定，保證該復(fù)方制劑的純度，實(shí)現(xiàn)其終產(chǎn)品的質(zhì)量控制。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的：一種采用高效液相色譜檢測厄貝沙坦氫氯噻嗪片中有關(guān)物質(zhì)的方法，該檢測方法包括如下步驟：(1)色譜條件色譜柱：氰基鍵和硅膠柱流動相：0.01mol/L磷酸鹽緩沖溶液作為流動相A，甲醇和乙腈的混合溶液作為流動相B；檢測波長：220nm流速：1.0ml/min進(jìn)樣體積：10μL柱溫：25℃溶劑：甲醇、乙腈、酸性水的混合溶液梯度洗脫：時間(min)流動相A(％)流動相B(％)07525107525116040206040217525307525(2)供試品：準(zhǔn)確稱取供試品細(xì)粉約厄貝沙坦150mg,置100ml量瓶中，加溶劑30ml，超聲10分鐘，放冷，用溶劑稀釋至刻度，搖勻，慮過；精密量取續(xù)濾液7.5ml，置50ml量瓶中，用溶劑稀釋至刻度，搖勻即得；(3)對照品：對照品溶液(a)：取厄貝沙坦對照品15mg，精密稱定，置25ml量瓶中，加溶劑5ml超聲2分鐘使溶解，用溶劑稀釋至刻度，搖勻，即得；對照品溶液(b)：取氫氯噻嗪對照品20mg，精密稱定，置200ml量瓶中，加溶劑10ml超聲2分鐘使溶解，用溶劑稀釋至刻度，搖勻，即得；對照品溶液(c)：厄貝沙坦雜質(zhì)A對照品貯備液：取厄貝沙坦雜質(zhì)A對照品2.5mg，置25ml量瓶中，加溶劑超聲2分鐘使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得；對照品溶液(d)：精磺胺對照品貯備液：取精磺胺對照品2.5mg，置50ml量瓶中，加溶劑超聲2分鐘使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得；系統(tǒng)適用性對照品溶液：精密量取上述對照品溶液儲備液(a)、(b)、(c)、(d)各4.2ml、2.5ml、0.5ml、3.0ml置同一100ml量瓶中，加溶劑稀釋至刻度，搖勻，即得；(4)測定方法:取對照溶液20μl注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)檢測靈敏度，使厄貝沙坦峰高約為滿量程的5％；再精密量取供試品溶液與對照溶液各20μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至厄貝沙坦峰保留時間的2倍；按下列公式計算各雜質(zhì)的含量；其他單個雜質(zhì)峰面積不得大于對照溶液的主峰面積的0.2％，各雜質(zhì)峰面積的和不得大于對照溶液主峰面積的1.0％。(5)計算公式所述氰基鍵和硅膠柱的規(guī)格為250×4.6mm，5μm；所述氰基鍵和硅膠柱選自ZORBAXCN；所述0.01mol/L磷酸鹽緩沖液的配制方法為為：稱取磷酸二氫鉀1.36g，加水溶解并定容至900mL，使溶解，加三乙胺2ml，用稀磷酸調(diào)pH值至3.2，加水稀釋至1000ml；所述的流動相B為甲醇和乙腈的混合溶液，其體積比為甲醇：乙腈＝10:15；在步驟(1)中，所述溶劑中，甲醇：乙腈：酸性水的體積比為30:45:25；所述的酸性水為磷酸調(diào)節(jié)pH值為2.0的水溶液。附圖說明圖1厄貝沙坦紫外掃描譜圖圖2氫氯噻嗪紫外掃描譜圖圖3厄貝沙坦氫氯噻嗪及其雜質(zhì)的專屬性譜圖。圖4改變緩沖液pH值色譜圖圖5不同流動性比例色譜圖圖6不同廠家色譜柱的色譜圖具體實(shí)施方式通過下述實(shí)例將有助于理解本發(fā)明，但不能局限本發(fā)明的內(nèi)容。實(shí)驗(yàn)例一：按照本發(fā)明的厄貝沙坦氫氯噻嗪片測定方法，測定批號為20131104一年的自制厄貝沙坦氫氯噻嗪片的加速樣品樣品，查看在有關(guān)物質(zhì)項中各雜質(zhì)的含量。取該批號樣品10片研細(xì)，稱取150.23mg，置100ml量瓶中，加溶劑30ml，超聲10分鐘，放冷，用溶劑稀釋至刻度，搖勻，慮過；精密量取續(xù)濾液7.5ml，置50ml量瓶中，用溶劑稀釋至刻度，搖勻即得。對照品：對照品溶液(a)：準(zhǔn)確稱取厄貝沙坦對照品15.14mg，精密稱定，置25ml量瓶中，加溶劑5ml超聲2分鐘使溶解，用溶劑稀釋至刻度，搖勻，即得；對照品溶液(b)：取氫氯噻嗪對照品20.21mg，精密稱定，置200ml量瓶中，加溶劑10ml超聲2分鐘使溶解，用溶劑稀釋至刻度，搖勻，即得；對照品溶液(c)：厄貝沙坦雜質(zhì)A對照品貯備液：取厄貝沙坦雜質(zhì)A對照品2.56mg，置25ml量瓶中，加溶劑超聲2分鐘使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得；對照品溶液(d)：精磺胺對照品貯備液：取精磺胺對照品2.52mg，置50ml量瓶中，加溶劑超聲2分鐘使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得；系統(tǒng)適用性對照品溶液：精密量取上述對照品溶液儲備液(a)、(b)、(c)、(d)各4.2ml、2.5ml、0.5ml、3.0ml，置同一100ml量瓶中，加溶劑稀釋至刻度，搖勻，即得；色譜柱選用安捷倫氰基鍵和硅膠柱，流動相：稱取磷酸二氫鉀1.36g，加水溶解并定容至900mL，使溶解，加三乙胺2ml，用稀磷酸調(diào)pH值至3.2，加水稀釋至1000ml作為流動相A。量取甲醇400ml、乙腈600ml的混合溶液作為流動相B；檢測波長：220nm；流速：1.0ml/min；進(jìn)樣體積：10μL；柱溫：25℃；溶劑：量取甲醇300ml、乙腈450ml、酸性水250ml的混合溶劑。按照以下梯度洗脫：時間(min)流動相A(％)流動相B(％)07525107525116040206040217525307525測定方法:取對照溶液20μl注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)檢測靈敏度，使厄貝沙坦峰高約為滿量程的5％；再精密量取供試品溶液與對照溶液各20μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至厄貝沙坦峰保留時間的2倍。按下列公式計算各雜質(zhì)的含量。其他單個雜質(zhì)峰面積不得大于對照溶液的主峰面積的0.2％，各雜質(zhì)峰面積的和不得大于對照溶液主峰面積的1.0％。計算公式按照計算公式得出：精磺胺：0.50％，厄貝沙坦雜質(zhì)A：0.08％，單雜：0.05％，總雜0.65％。實(shí)驗(yàn)例二1.1檢測波長的選擇精密稱取厄貝沙坦、厄貝沙坦A對照品適量用上述溶劑溶解并定容，制備成約20μg/ml的混合對照品溶液；精密稱取氫氯噻嗪對照品適量用溶劑溶解并定容，制備成20μg/ml的溶液的混合對照品溶液，以溶劑為空白，按照紫外分光光度法在200-400nm波長范圍內(nèi)掃描，記錄紫外吸收光譜。由附圖1厄貝沙坦和附圖2氫氯噻嗪顯示可知，在200-300nm波長范圍內(nèi)氫氯噻嗪在220nm(見圖2中附圖標(biāo)記1)、270nm和312nm處有最大吸收；厄貝沙坦及其雜質(zhì)厄貝沙坦A在206nm處(見圖1中附圖標(biāo)記1)有最大吸收，在225nm和242nm處各一肩峰。選用220nm該波長為測定該復(fù)方片有關(guān)物質(zhì)檢查的檢測波長。1.2流動相的選擇1.2.1流動相的水相的選擇考察不同濃度磷酸二氫鉀0.01mol/L-0.2mol/L對主峰的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)影響較小，考慮到高濃度鹽容易析出，容易從流動相中析出，有可能損傷色譜柱和儀器所以選用較低濃度0.01mol/L的磷酸二氫鉀。1.2.2磷酸鹽緩沖液pH的選擇考察pH分別在3.2、4.0、5.0的緩沖液對色譜柱的影響。見表1表1流動相中水相pH值對色譜柱的影響結(jié)果顯示，pH為3.2-5.0的磷酸緩沖鹽，厄貝沙坦氫氯噻嗪的拖尾因子及理論塔板數(shù)均符合要求，當(dāng)pH為3.2時，效果最好。色譜圖中的氫氯噻嗪峰會隨著pH的升高，出峰時間縮短，但梯度條件下，pH值對厄貝沙坦的出峰時間影響并不大，只是厄貝沙坦前有一小峰，考慮兩者的分離度及流動相比例、出峰時間，最終確定使用pH3.2的緩沖鹽溶液作為水相。1.2.3流動相中有機(jī)相的選擇經(jīng)藥典和文獻(xiàn)查詢可知，藥物理化性質(zhì)相差較大，經(jīng)過試驗(yàn)摸索確定當(dāng)有機(jī)相為甲醇與乙腈的體積比為40:60時獲得較好的峰型和分離性能。見下表2表2流動相中有機(jī)相比例對色譜柱的影響1.2.4流動相比例的選擇從兩種藥物的理化性質(zhì)可以看出厄貝沙坦與氫氯噻嗪極性相差比較大，當(dāng)有機(jī)相比例較高時，氫氯噻嗪出峰過早，但如果將水相比例調(diào)高，厄貝沙坦的保留時間會延遲較多，對氫氯噻嗪的保留時間影響較小。從節(jié)約檢測成本的角度出發(fā)，把有機(jī)相(甲醇：乙腈＝10:15)與水相(0.01mol/L磷酸鹽緩沖溶液)體積比為25:75較為合理，并以此作為流動相比例選擇。實(shí)施例2方法學(xué)的建立2.1專屬性專屬性溶液配制按本專利中對照品(2)的配制方法配制，精密量取上述線性溶液各20μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，見圖3。附圖3中標(biāo)記為2的為厄貝沙坦，附圖3中標(biāo)記1的為厄貝沙坦A，附圖中標(biāo)記為3的為精磺胺，附圖中標(biāo)記為4的為氫氯噻嗪。表3專屬性的色譜分離表試驗(yàn)結(jié)果表明，溶劑出峰早，不干擾有關(guān)物質(zhì)檢出；雜質(zhì)混合對照溶液與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液中見附圖3可得，精磺胺(見圖3中附圖標(biāo)記3)與氫氯噻嗪(見圖3中附圖標(biāo)記4)，及厄貝沙坦雜質(zhì)A(見圖3中附圖標(biāo)記1)與厄貝沙坦(見附圖3中附圖標(biāo)記2)，其之間分離度均大于1.5，分離良好；且均在220nm左右有最大吸收?？梢?，本方法用于厄貝沙坦氫氯噻嗪片的有關(guān)物質(zhì)檢查，專屬性良好。2.2線性范圍線性貯備液：精密量取精磺胺貯備液、厄貝沙坦雜質(zhì)A貯備液、厄貝沙坦貯備液和氫氯噻嗪貯備液各5ml，置同一50ml量瓶中，加溶劑稀釋至刻度，搖勻，即得。精密量取線性貯備液0.2、0.3、0.5ml，分置100ml量瓶中，加溶劑稀釋至刻度，搖勻，作為線性溶液①、②、③。精密量取線性貯備液0.1、0.2、0.4、0.5、0.7、1.0ml，分置10ml量瓶中，加溶劑稀釋至刻度，搖勻，作為線性溶液④、⑤、⑥、⑦、⑧、⑨。精密量取上述線性溶液各20μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以峰面積為縱坐標(biāo)，線性溶液濃度為橫坐標(biāo)，用最小二乘法進(jìn)行線性回歸。試驗(yàn)結(jié)果：精磺胺A＝110204.74C+813.20r＝0.9997精磺胺在0.007μg/ml～0.365μg/ml濃度范圍內(nèi)，濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系。厄貝沙坦雜質(zhì)AA＝53428.39C-1570.86r＝0.9999厄貝沙坦雜質(zhì)A在0.070μg/ml～1.396μg/ml濃度范圍內(nèi)，濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系。厄貝沙坦A＝56185.08C-1565.52r＝0.9997厄貝沙坦在0.135μg/ml～4.503μg/ml濃度范圍內(nèi)，濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系。氫氯噻嗪A＝88153.33C+217.56r＝0.9998氫氯噻嗪在0.008μg/ml～0.389μg/ml濃度范圍內(nèi)，濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系。2.3校正因子計算根據(jù)上述線性試驗(yàn)結(jié)果，以雜質(zhì)精磺胺、厄貝沙坦雜質(zhì)A和主成分氫氯噻嗪、厄貝沙坦線性方程的斜率，分別計算精磺胺相對于主成分氫氯噻嗪、厄貝沙坦雜質(zhì)A相對于主成分厄貝沙坦的校正因子f，結(jié)果如下：計算公式：f＝雜質(zhì)線性方程的斜率/主成分線性方程的斜率表4厄貝沙坦氫氯噻嗪片有關(guān)物質(zhì)檢查校正因子計算結(jié)果試驗(yàn)結(jié)果表明，雜質(zhì)精磺胺校正因子為1.3，厄貝沙坦雜質(zhì)A的校正因子為1.0(在0.9～1.1范圍內(nèi))，在有關(guān)物質(zhì)檢查中，精磺胺采用加校正因子的自身對照法，厄貝沙坦雜質(zhì)A采用不加校正因子的自身對照法。2.4回收率試驗(yàn)供試品溶液：按本專利供試品(2)的配制方法制成儲備液。回收率溶液：(1)取供試品貯備液1.5ml，置10ml量瓶中，精密加入雜質(zhì)貯備液1.0ml并用溶劑稀釋至刻度，搖勻，作為100％回收率溶液，同法制備3份。(2)取供試品貯備液1.5ml，置10ml量瓶中，精密加入雜質(zhì)貯備液0.8ml并用溶劑稀釋至刻度，搖勻，作為80％回收率溶液，同法制備3份。(3)取供試品貯備液1.5ml，置10ml量瓶中，精密加入雜質(zhì)貯備液0.5ml并用溶劑稀釋至刻度，搖勻，作為50％回收率溶液，同法制備3份。精密量取上述雜質(zhì)對照品溶液、供試品溶液、回收率溶液各20μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計算雜質(zhì)回收率，結(jié)果見下表：表5厄貝沙坦氫氯噻嗪片有關(guān)物質(zhì)檢查回收率試驗(yàn)結(jié)果試驗(yàn)結(jié)果表明，精磺胺的回收率在98.9～103.7％范圍內(nèi)，厄貝沙坦雜質(zhì)A的回收率在99.2～103.6％范圍內(nèi)；本品有關(guān)物質(zhì)檢查方法準(zhǔn)確度良好。2.5定量限、檢測限取精磺胺、厄貝沙坦雜質(zhì)A、氫氯噻嗪、厄貝沙坦對照品各適量，精密稱定，加溶劑超聲5分鐘使溶解，再用溶劑逐步定量稀釋，當(dāng)其信噪比S/N約為10:1時，相應(yīng)濃度和注入儀器的量即為定量限，并將定量限濃度溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，計算所得峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差；當(dāng)其信噪比S/N約為3:1時，相應(yīng)濃度和注入儀器的量即為檢測限。表6厄貝沙坦氫氯噻嗪片有關(guān)物質(zhì)檢查定量限試驗(yàn)結(jié)果由上述試驗(yàn)結(jié)果可知：本方法雜質(zhì)精磺胺、厄貝沙坦雜質(zhì)A的定量限分別為0.12ng、1.34ng；定量限濃度溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，保留時間的RSD分別為1.0％、0.4％，均小于2.0％；峰面積的RSD分別為4.7％、4.7％，均小于5.0％。表7厄貝沙坦氫氯噻嗪片有關(guān)物質(zhì)檢查檢測限試驗(yàn)結(jié)果由上述結(jié)果可知：主藥氫氯噻嗪、厄貝沙坦和雜質(zhì)精磺胺、厄貝沙坦雜質(zhì)A的檢測限分別為0.04ng、0.06ng、0.31ng和0.42ng2.6耐用性2.6.1、緩沖液pH值按照本專利有關(guān)物質(zhì)分析方法中制備系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液和供試品溶液，分別精密量取20μl，照上述條件進(jìn)行試驗(yàn)，圖譜見附圖4。附圖4中的1為2.9的pH值緩沖液，附圖4中的2為3.0的pH值緩沖液，附圖4中的3為3.2的pH值緩沖液。表8不同pH下對藥物有關(guān)物質(zhì)的檢查結(jié)果結(jié)論：由表8的試驗(yàn)結(jié)果表明，從附圖4中標(biāo)記的1-3緩沖液pH值發(fā)生微小變化時對有關(guān)物質(zhì)檢查結(jié)果無影響，耐用性良好。2.6.2改變流動相比例：譜圖見附圖5，初始條件為1，改變流動性比例分別為2-5見表9附圖5中標(biāo)記1的流動相為磷酸鹽緩沖液(pH3.0±0.1)-甲醇-乙腈(73：10：17)附圖5中標(biāo)記2的流動相為磷酸鹽緩沖液(pH3.0±0.1)-甲醇-乙腈(74：9：17)附圖5中標(biāo)記3的流動相為磷酸鹽緩沖液(pH3.0±0.1)-甲醇-乙腈(72：10：18)附圖5中標(biāo)記4的流動相為磷酸鹽緩沖液(pH3.0±0.1)-甲醇-乙腈(72：11：17)附圖5中標(biāo)記5的流動相為磷酸鹽緩沖液(pH3.0±0.1)-甲醇-乙腈(75：15：10)檢查結(jié)果：見表9表9不同比例的流動相對藥物及其雜質(zhì)的影響由表9的試驗(yàn)結(jié)果表明，從附圖5中標(biāo)記的1-5的流動相的變化趨勢，可以得出，改變流動相比例對有關(guān)物質(zhì)檢查結(jié)果無影響，耐用性良好2.6.3不同廠家色譜柱：選取不同廠家的色譜柱如下：附圖6中標(biāo)記1的為色譜柱1:安捷倫氰基鍵和硅膠柱4.6×250mm，5μmP.N.880952-705S.N.USl0019652附圖6中標(biāo)記2的為色譜柱2:安捷倫氰基鍵和硅膠柱4.6×250mm，5μmP.N.880952-705S.N.USl0019777附圖6中標(biāo)記3的為色譜柱3:沃特斯氰基鍵和硅膠柱4.6×250mm，5μmPartNumber:Ult5cn425SerialNumber:251101594附圖6中色譜柱1-3所標(biāo)記的A均為厄貝沙坦雜質(zhì)A表10不同廠家色譜圖檢查結(jié)果由表10的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知：色譜柱3中厄貝沙坦雜質(zhì)A與厄貝沙坦重合，分離度不符合規(guī)定；附圖6中的色譜柱1和色譜柱的2系統(tǒng)適用性均良好，有關(guān)物質(zhì)檢查結(jié)果一致；因此在有關(guān)物質(zhì)檢查時推薦氰基鍵和硅膠柱4.6×250mm，5μm。當(dāng)前第1頁1 2 3