一種用于檢測膠類中藥及其復方制劑中狗骨源成分含量的組合物、試劑盒及其檢測方法與流程

本發明涉及一種用于檢測膠類中藥及其復方制劑中狗骨源成分含量的組合物、試劑盒及其檢測方法。本發明屬于醫藥檢測技術領域。

背景技術：

狗骨為為犬科動物狗的骨骼，具有健脾和絡、活血生肌的功效，主治風濕痹痛、腰腿無力、四肢麻木、久痢、瘡瘺。以狗骨為主藥制成的制劑有狗骨膠、狗骨膠藥酒、復方狗骨膠、壯骨伸筋膠囊、駁骨丸等。目前狗骨的鑒別主要為性狀鑒別和顯微鑒別，因專屬性不強，常存在鑒別不準確等情況，對于用狗骨加工后的產品無法鑒別，更無法定量檢測。因為缺乏專屬性鑒別方法和定量方法，部分不法廠家進行造假或摻假，以降低成本獲得非法利潤。

因此，目前迫切需要提出一種能夠快速、準確檢測膠類中藥及其復方制劑中狗骨源成分含量的方法，進而實現對含狗骨源成分的產品的真偽鑒定。本發明從狗骨中主要成分出發，利用所含蛋白的氨基酸序列不同，找出狗骨特征性肽段，利用狗骨的特征肽段實現膠類中藥及其復方制劑中狗骨源性成分含量的檢測。

技術實現要素：

本發明的一個目的在于，提供一種能夠快速、準確鑒定膠類中藥及其復方制劑中狗骨源成分含量的組合物。

本發明的另一個目的在于，提供一種能夠快速、準確鑒定膠類中藥及其復方制劑中狗骨源成分含量的試劑盒。

本發明的再一個目的在于，提供一種能夠快速、準確鑒定膠類中藥及其復方制劑中狗骨源成分含量的方法。

為了實現上述目的，本發明采用了如下技術方案：

一種用于檢測膠類中藥及其復方制劑中狗骨源成分含量的組合物，所述組合物由多肽及對照品檢測基質組成，所述多肽的氨基酸序列為Gln-Gly-Pro-Ser-Gly-Thr-Ser-Gly-Glu-Arg(SEQIDNO.1所示)，對照品檢測基質為魚骨膠。

含有所述組合物的檢測試劑盒也在本發明的保護范圍之內。

本發明進一步提供了一種用于檢測膠類中藥及其復方制劑中狗骨源成分含量的方法，具體包括如下步驟：

(1)對照品溶液的制備

1)基質溶液的制備：將稱量好的對照品檢測基質置于量瓶中，加入NH₄HCO₃溶液，超聲使樣品完全溶解，加NH₄HCO₃溶液稀釋至刻度；

2)對照品母液的制備：將稱量好的對照品檢測基質置于量瓶中，加入NH₄HCO₃溶液，超聲使樣品完全溶解，將稱量好的的多肽放入該量瓶中，用NH₄HCO₃溶液溶解并稀釋至刻度；

3)對照品溶液制備：以步驟1)制得的基質溶液為溶劑，將步驟2)制得的對照品母液稀釋，微孔濾膜過濾，續濾液中加胰蛋白酶溶液，酶解；

(2)待檢測樣品溶液的制備

將稱量好的待測膠類中藥置于量瓶中，加NH₄HCO₃溶液，超聲使膠類中藥完全溶解，加NH₄HCO₃溶液稀釋至刻度，搖勻，微孔濾膜過濾，續濾液中加胰蛋白酶溶液，酶解；

(3)液質聯用儀檢測

分別取步驟(1)制得的對照品溶液、步驟(2)制得的待檢測樣品溶液放入液質聯用儀進行檢測，選擇m/z488.5→693.3、549.3作為檢測離子對進行MRM掃描，其中選擇m/z488.5→693.3作為多肽的定量離子對；

(4)樣品中狗骨源成分含量的計算

以對照品溶液的多肽的含量為縱坐標、峰面積為橫坐標進行標準曲線的繪制，線性相關系數R≥0.9992，由此計算出樣品中多肽的含量，然后，按下式計算出各樣品中狗骨源成分的含量：

狗骨源成分的含量(％)＝(待測樣品中多肽含量/待測樣品的重量)÷(6.389×10^-3)×100％。

優選的，步驟(1)及步驟(2)所述的酶解溫度為37℃。

本發明的用于檢測膠類中藥及其復方制劑中的狗骨源成分含量的方法，其中，步驟(3)中液質聯用儀檢測的液相條件為：C₁₈反相色譜柱，流動相A為0.1％(v/v)甲酸的水溶液，流動相B為0.1％(v/v)甲酸的乙腈溶液，流速0.3ml/min；梯度洗脫：5→20min，流動相A 95％→80％，流動相B 5％→20％，質譜條件：電噴霧正離子模式(ESI⁺)進行多反應監測。

優選的，所述的用于檢測膠類中藥及其復方制劑中狗骨源成分含量的組合物，所述膠類中藥為阿膠、黃明膠、龜甲膠、鹿角膠、驢骨膠、牛骨膠、豬骨膠、羊骨膠或其他膠類中藥。

再進一步的，本發明還提出了所述的組合物或所述的試劑盒在檢測膠類中藥及其復方制劑中的狗骨源成分含量中的應用。

直接對膠類中藥中狗骨源成分進行準確的含量檢測，首先要找出能標志狗骨源成分且在不同生產工藝的膠類中藥中含量相對穩定的物質；其次膠類中藥的成分非常復雜，檢測時信號不穩定，因此該物質要滿足在檢測時具有較高的信號響應、較低的噪音及其他物質干擾，還應考慮檢測信號的穩定性；第三需要設立合適的對照品等。

對此，本發明通過選取狗骨源特征性多肽，從而實現對膠類中藥及其復方制劑中狗骨源成分的含量檢測。實驗證明，采用本發明的方法，能夠準確地檢測膠類中藥及其復方制劑中狗骨源成分的含量，且操作簡單，在膠類中藥產品質量監控領域將具有廣泛的應用前景。

附圖說明

為了使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將結合附圖對本發明作進一步的詳細描述，其中：

圖1是對照品溶液MRM掃描模式下選擇離子對m/z488.5→693.3監測的質譜圖；

圖2是各種純品膠類中藥樣品MRM掃描模式下選擇離子對m/z488.5→693.3監測的質譜圖。

具體實施方式

以下將參照附圖，對本發明的優選實例進行詳細描述。優選實例中沒有注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件或制造廠商所建議的條件進行。

實施例1

1、材料和試劑

材料：各種膠類中藥，包括狗骨膠、驢骨膠、牛骨膠、豬骨膠、羊骨膠、魚骨膠(對照品檢測基質)，分別用狗骨、驢骨、牛骨、豬骨、羊骨、魚骨煎煮獲得。

多肽交由生物公司合成。

試劑：碳酸氫銨(分析純)、胰蛋白酶(序列純)。

2、檢測方法

(1)對照品溶液的制備

1)基質溶液的制備

稱取0.50g對照品檢測基質于250ml量瓶中，加少量1％(w/w)NH₄HCO₃溶液(pH8.0)，超聲使樣品完全溶解，用1％(w/w)NH₄HCO₃溶液(pH8.0)稀釋至刻度，搖勻；

2)對照品母液的制備

將稱量好的0.05g對照品檢測基質置于25ml量瓶中，加少量1％(w/w)NH₄HCO₃溶液(pH8.0)，超聲使樣品完全溶解，稱取38.1mg的多肽于該量瓶中，用1％(w/w)NH₄HCO₃溶液(pH8.0)溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻；

3)對照品溶液的制備

采用分步稀釋的方法，以步驟1)制得的基質溶液為溶劑，將步驟2)制得的對照品母液稀釋1000倍，微孔濾膜過濾，精密量取續濾液100μl，加2mg/ml的胰蛋白酶溶液10μl，37℃恒溫酶解12h；

(2)待測樣品溶液的制備

稱取0.05g待測樣品于25ml量瓶中，加入1％(w/w)NH₄HCO₃(pH8.0)溶液，超聲使樣品完全溶解，繼續加1％(w/w)NH₄HCO₃(pH8.0)稀釋至刻度，搖勻，微孔濾膜過濾，精密量取續濾液100μl加2mg/ml的胰蛋白酶溶液10μl，37℃恒溫酶解12h；

(3)液質聯用儀檢測

分別取步驟(1)制得的對照品溶液、步驟(2)制得的待檢測樣品溶液各5μl放入液質聯用儀進行檢測，液相條件：C₁₈反相色譜柱(2.1mm×100mm，1.8μm)，流動相A為0.1％(v/v)甲酸的水溶液，流動相B為0.1％(v/v)甲酸的乙腈溶液，流速0.3ml/min；梯度洗脫：5→20min，流動相A 95％→80％，流動相B 5％→20％。質譜條件：電噴霧正離子模式(ESI⁺)進行多反應監測，選擇m/z488.5→693.3、549.3作為檢測離子對進行MRM掃描，其中選擇m/z488.5→693.3作為多肽的定量離子對；

(4)樣品中狗骨源成分含量的計算

圖1是對照品溶液MRM掃描模式下選擇離子對m/z488.5→693.3監測的質譜圖；圖2是各種動物骨樣品MRM掃描模式下選擇離子對m/z488.5→693.3監測的質譜圖。

以對照品溶液的多肽的含量為縱坐標、峰面積為橫坐標進行標準曲線的繪制，線性相關系數R≥0.9992，由此計算出樣品中多肽的含量，然后，按下式計算出各樣品中狗骨源成分的含量：

狗骨源成分的含量(％)＝(待測樣品中多肽含量/待測樣品的重量)÷(6.389×10^-3)×100％。

其中，各樣品中狗骨源成分的含量：

狗骨膠中狗骨源成分的含量(％)＝(0.3189×10^-3g/0.0502g)÷(6.389×10^-3)×100％＝99.43％≈100％

驢骨膠中狗骨源成分的含量(％)＝(0mg/0.0506g)÷(6.389×10^-3)×100％＝0％

牛骨膠中狗骨源成分的含量(％)＝(0mg/0.0504g)÷(6.389×10^-3)×100％＝0％

豬骨膠中狗骨源成分的含量(％)＝(0mg/0.0512g)÷(6.389×10^-3)×100％＝0％

羊骨膠中狗骨源成分的含量(％)＝(0mg/0.0502g)÷(6.389×10^-3g)×100％＝0％

上述計算結果表明：狗骨膠中狗骨源成分的含量100％，驢骨膠、牛骨膠、豬骨膠、羊骨膠中狗骨源成分的含量為0％。這與實際情況相符，表明該方法能準確檢測膠類中藥中狗骨源成分的含量。

實施例2

1、材料和試劑

材料：各種純品膠類中藥，包括狗骨膠、驢骨膠、牛骨膠、豬骨膠、羊骨膠、魚骨膠(對照品檢測基質)，分別用狗骨、驢骨、牛骨、豬骨、羊骨、魚骨煎煮獲得。

多肽交由生物公司合成。

試劑：碳酸氫銨(分析純)、胰蛋白酶(序列純)。

膠類中藥復方制劑：向上述純品膠類中藥中加入不同質量百分比的狗骨膠制成3個復方膠類中藥制劑，包括含15％狗骨膠的牛骨膠、含30％狗骨膠的牛骨膠、含30％狗骨膠的豬骨膠，分別命名為制劑1、制劑2以及制劑3。

2、檢測方法

(1)對照品溶液的制備

1)基質溶液的制備

稱取0.50g對照品檢測基質于250ml量瓶中，加少量1％(w/w)NH₄HCO₃溶液(pH8.0)，超聲使樣品完全溶解，用1％(w/w)NH₄HCO₃溶液(pH8.0)稀釋至刻度，搖勻；

2)對照品母液的制備

將稱量好的0.05g對照品檢測基質置于25ml量瓶中，加少量1％(w/w)NH₄HCO₃溶液(pH8.0)，超聲使樣品完全溶解，稱取38.1mg的多肽于該量瓶中，用1％(w/w)NH₄HCO₃溶液(pH8.0)溶解并稀釋至刻度，搖勻；

3)對照品溶液的制備

采用分步稀釋的方法，以步驟1)制得的基質溶液為溶劑，將步驟2)制得的對照品母液稀釋500倍、1000倍、2000倍、4000倍、8000倍、10000倍，微孔濾膜過濾，精密量取續濾液100μl，加2mg/ml的胰蛋白酶溶液10μl，37℃恒溫酶解12h；

(2)待測樣品溶液的制備

取0.05g待測膠樣品于25ml量瓶中，加入1％(w/w)NH₄HCO₃(pH8.0)溶液溶解后，繼續加1％(w/w)NH₄HCO₃(pH8.0)稀釋至刻度，搖勻，微孔濾膜過濾，精密量取續濾液100μl加2mg/ml的胰蛋白酶溶液10μl，37℃恒溫酶解12h；

(3)液質聯用儀檢測

分別取步驟(1)制得的對照品溶液、步驟(2)制得的待檢測樣品溶液各5μl放入液質聯用儀進行檢測，液相條件：C₁₈反相色譜柱(2.1mm×100mm，1.8μm)，流動相A為0.1％(v/v)甲酸的水溶液，流動相B為0.1％(v/v)甲酸的乙腈溶液，流速0.3ml/min；梯度洗脫：5→20min，流動相A 95％→80％，流動相B 5％→20％。質譜條件：電噴霧正離子模式(ESI⁺)進行多反應監測，選擇m/z488.5→693.3、549.3作為檢測離子對進行MRM掃描，其中選擇m/z488.5→693.3作為多肽的定量離子對；

(4)樣品中狗骨源成分含量的計算

以對照品溶液的多肽的含量為縱坐標、峰面積為橫坐標進行標準曲線的繪制，線性相關系數R≥0.9992，由此計算出樣品中多肽的含量，然后，按下式計算出各樣品中狗骨源成分的含量：

狗骨源成分的含量(％)＝(待測樣品中多肽含量/待測樣品的重量)÷(6.389×10^-3)×100％。

其中，各樣品中狗骨源成分的含量：

狗骨膠中狗骨源成分的含量(％)＝(0.3208×10^-3g/0.0506g)÷(6.389×10^-3)×100％＝99.23％≈100％

含15％狗骨膠的牛骨膠中狗骨源成分的含量(％)＝(0.0482×10^-3g/0.0502g)÷(6.389×10^-3)×100％＝15.03％

含30％狗骨膠的牛骨膠中狗骨源成分的含量(％)＝(0.0981×10^-3g/0.0508g)÷(6.389×10^-3)×100％＝30.23％

含30％狗骨膠的豬骨膠中狗骨源成分的含量(％)＝(0.0966×10^-3g/0.0506g)÷(6.389×10^-3)×100％＝29.88％

上述計算結果表明：利用本發明的檢測方法得到的制劑1-3中的狗骨源的檢測含量與實際情況相符，表明該方法能準確檢測膠類中藥及其復方制劑中狗骨源成分的含量。

綜上所述，利用本發明公開的多肽以及對照品檢測基質，采用液質聯用儀，能準確檢測膠類中藥及其復方制劑中狗骨源成分的含量。

需要說明的是，以上實施例僅用以說明發明的技術方案而非限制，盡管通過參照本發明的優選實施例已經對本發明進行了描述，但本領域技術人員對本發明作的各種改動或修改而不背離本發明的精神與范圍，這些等價形式同樣落在本發明的范圍內。

序列表

<110> 東阿阿膠股份有限公司

<120>一種用于檢測膠類中藥及其復方制劑中狗骨源成分含量的組合物、試劑盒及其檢測方法

<130> KLPI161253

<160> 1

<170>PatentIn 3.5

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> 多肽

<400> 1

Gln Gly Pro Ser Gly Thr Ser Gly Glu Arg 10