一種用于阿膠及其復(fù)方制劑真?zhèn)舞b定的組合物、試劑盒及其檢測方法與流程

本發(fā)明涉及一種鑒定阿膠及其復(fù)方制劑真?zhèn)蔚慕M合物、試劑盒及其檢測方法。本發(fā)明屬于醫(yī)藥檢測技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

阿膠作為一種傳統(tǒng)名貴中藥，已有數(shù)千年的食用歷史，具有補(bǔ)血滋陰，潤燥，止血的功效。中國藥典規(guī)定，阿膠為馬科動物驢Equus asinus L.的干燥皮或鮮皮經(jīng)煎煮、濃縮制成的固體膠。純正的阿膠必需來自百分百的驢皮，方能保證產(chǎn)品的功效。從原料生物分類學(xué)上看，驢屬于奇蹄目馬科驢屬，包括非洲野驢、藏野驢、中亞野驢、家驢等品種。其中中國飼養(yǎng)的家驢包括關(guān)中驢、德州驢、廣靈驢、佳米驢、泌陽驢、淮陽驢、慶陽驢、華北驢、新疆驢、西南驢等眾多地方品種。由于驢的畜牧價值不斷下降，而其經(jīng)濟(jì)價值卻未見提高，驢的數(shù)量在世界范圍內(nèi)急劇下降，驢皮的供應(yīng)也逐年緊張，價格不斷上漲。市場上出現(xiàn)了很多不法分子，在生產(chǎn)阿膠時，部分甚至全部用各種其他動物皮包括馬皮、騾皮、牛皮、豬皮等來取代驢皮進(jìn)行熬制，有的甚至直接摻入工業(yè)明膠。阿膠的復(fù)方制劑中往往以阿膠為主要功效成分，如果在生產(chǎn)阿膠的復(fù)方制劑中加入的是低廉的偽品阿膠，其藥效可想而知。總之，這些偽品的存在不但損害了消費(fèi)者利益，而且嚴(yán)重干擾了市場正常秩序，影響了正規(guī)產(chǎn)品的信譽(yù)。

阿膠經(jīng)長時間高溫蒸煮濃縮而成，主要成分非常相近且不同廠家的生產(chǎn)工藝存有差異，采用紅外、近紅外、X-衍射、HPLC等方法對阿膠進(jìn)行真?zhèn)舞b別常存在判斷不準(zhǔn)確、缺乏足夠說服力等。目前已報(bào)道的鑒別阿膠真?zhèn)伪容^權(quán)威的方法主要是DNA分子鑒定方法和檢測特征性肽段的液質(zhì)聯(lián)用方法。已報(bào)道的這兩種方法都無法對阿膠中驢皮源成分進(jìn)行比較準(zhǔn)確的定量檢測，而是通過檢測阿膠中是否含有驢的成分，并排除其他動物源成分來判斷阿膠真?zhèn)危坏⒛z的摻假可能會五花八門，因此需要排除的動物源成分會是多種多樣，利用排除法來鑒別阿膠真?zhèn)未嬖谥匾毕荩錅?zhǔn)確性和可靠性會大打折扣，這種情況非常不利于對市場阿膠產(chǎn)品的監(jiān)管。利用驢皮源成分含量來判斷阿膠真?zhèn)?，可從根本上限制阿膠的造假行為。已報(bào)道的文獻(xiàn)中，對驢皮源性成分檢測，基本都沒有排除馬皮源性成分，因此雖宣稱為驢皮源成分，實(shí)則為驢與馬共有。

因此，目前迫切需要提出一種能夠快速、準(zhǔn)確檢測阿膠及其復(fù)方制劑中阿膠含量的方法，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對阿膠產(chǎn)品的真?zhèn)舞b別。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個目的在于，提供一種能夠快速、準(zhǔn)確鑒定阿膠及其復(fù)方制劑真?zhèn)蔚慕M合物。

本發(fā)明的另一個目的在于，提供一種能夠快速、準(zhǔn)確鑒定阿膠及其復(fù)方制劑真?zhèn)蔚脑噭┖小?/p>

本發(fā)明的再一個目的在于，提供一種能夠快速、準(zhǔn)確鑒定阿膠及其復(fù)方制劑真?zhèn)蔚姆椒ā?/p>

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案：

本發(fā)明的一種用于阿膠及其復(fù)方制劑真?zhèn)舞b定的組合物，所述組合物由多肽I、多肽II、多肽III以及對照品檢測基質(zhì)組成，其中：所述多肽I的氨基酸序列為Ala-Gly-Glu-Thr-Gly-Ala-Ser-Gly-Pro-Hyp-Gly-Phe-Ala-Gly-Glu-Lys(SEQ ID NO.1)，多肽II的氨基酸序列為Gly-Ala-Ser-Gly-Pro-Ala-Gly-Val-Arg(SEQ ID NO.2)，多肽III的氨基酸序列為Gly-Ser-Glu-Gly-Pro-Gln-Gly-Val-Arg(SEQ ID NO.3)，對照品檢測基質(zhì)為魚皮膠。

含有所述組合物的檢測試劑盒也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

進(jìn)一步的，本發(fā)明還提出了一種阿膠及其復(fù)方制劑真?zhèn)舞b定的方法，包括如下步驟：

1)對照品溶液的制備：

稱取對照品檢測基質(zhì)于量瓶中，加入NH₄HCO₃溶液，超聲使樣品完全溶解，加入稱量好的多肽I、多肽II和多肽III，完全溶解，搖勻,微孔濾膜過濾，續(xù)濾液中加胰蛋白酶溶液，酶解；

2)待檢測樣品溶液的制備：

取待測樣品，重量記為N₁，加水溶解后，加入三氯乙酸溶液，超聲，離心后去除上清液，沉淀用丙酮洗滌、干燥后稱重，重量記為N₂；稱取一定量沉淀干燥物于量瓶中，加入NH₄HCO₃溶液稀釋至刻度，搖勻，微孔濾膜過濾，續(xù)濾液中加入胰蛋白酶溶液，酶解；

3)液質(zhì)聯(lián)用儀檢測

分別取對照品溶液、待檢測樣品溶液放入液質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行檢測；選擇m/z725.3→962.5、818.4，m/z386.4→499.3、643.3，m/z444.0→331.2、613.3作為檢測離子對進(jìn)行MRM掃描，其中選擇m/z725.3→962.5、m/z386.4→499.3、m/z444.0→331.2分別作為多肽I、多肽II和多肽III的定量離子對進(jìn)行定量檢測；

4)樣品中驢皮源成分含量的計(jì)算

以對照品溶液的各多肽的含量為縱坐標(biāo)、峰面積為橫坐標(biāo)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，各多肽的線性相關(guān)系數(shù)R≥0.998，由此計(jì)算出混合膠中多肽I、多肽II和多肽III的含量，待檢測阿膠樣品中多肽I的含量記為M₁、多肽II的含量記為M₂、多肽III的含量記為M₃，然后，按下式計(jì)算出各樣品中驢皮源成分的含量：

阿膠中驢皮源成分的含量(％)＝(M₁/1448.5–M₂/770.8)×1772/M₃×N₂/N₁。

在本發(fā)明所述的真?zhèn)舞b定方法中，優(yōu)選的，步驟1)所述的對照品溶液的制備包括以下步驟：

1)基質(zhì)溶液的制備：

稱取0.50g對照品檢測基質(zhì)于250ml量瓶中，加少量1％(w/w)pH8.0的NH₄HCO₃溶液，超聲使樣品完全溶解，用1％(w/w)pH8.0的NH₄HCO₃溶液稀釋至刻度，搖勻；

2)對照品母液的制備：

稱取0.05g對照品檢測基質(zhì)于25ml量瓶中，加少量1％(w/w)pH8.0的NH₄HCO₃溶液，超聲使樣品完全溶解，分別加入28.3mg的多肽I、15.1mg的多肽II和17.3mg的多肽III，用1％(w/w)pH8.0的NH₄HCO₃溶液稀釋至刻度，搖勻；

3)對照品溶液的制備：

采用分步稀釋的方法，以基質(zhì)溶液為溶劑，將對照品母液稀釋500～10000倍，微孔濾膜過濾，精密量取續(xù)濾液100μl，加2mg/ml的胰蛋白酶溶液10μl，37℃恒溫酶解12h。

在本發(fā)明所述的真?zhèn)舞b定方法中，優(yōu)選的，步驟2)所述的待檢測樣品溶液的制備包括以下步驟：取0.5-5g待測復(fù)方阿膠制劑樣品，重量記為N₁，加入水至總體積為4-5ml，混合后，加入30％(w/w)的三氯乙酸溶液5ml，超聲15min，4℃靜置30min，離心后去除清液，沉淀用丙酮洗滌、干燥后稱重，重量記為N₂；稱取0.05g的沉淀干燥物于25ml量瓶中，加入少量1％(w/w)的NH₄HCO₃溶液(pH8.0)溶解后，用1％(w/w)的NH₄HCO₃溶液(pH8.0)稀釋至刻度，搖勻，微孔濾膜過濾，精密量取續(xù)濾液100μl加2mg/ml的胰蛋白酶溶液10μl，37℃恒溫酶解12h。

在本發(fā)明所述的真?zhèn)舞b定方法中，優(yōu)選的，步驟5)中液質(zhì)聯(lián)用儀檢測的液相條件為：C₁₈反相色譜柱，流動相A為0.1％(v/v)甲酸的水溶液，流動相B為0.1％(v/v)甲酸的乙腈溶液，流速0.3ml/min；梯度洗脫：0→40min，流動相A 100％→50％，流動相B 0％→50％，質(zhì)譜條件：電噴霧正離子模式(ESI⁺)進(jìn)行多反應(yīng)監(jiān)測。

再進(jìn)一步的，本發(fā)明還提出了所述的組合物或所述的試劑盒在檢測阿膠及其復(fù)方制劑中的阿膠含量中的應(yīng)用。

直接對阿膠中驢皮源成分進(jìn)行準(zhǔn)確的含量檢測，首先要找出能標(biāo)志驢皮源成分且在不同生產(chǎn)工藝的純品阿膠中含量相對穩(wěn)定的物質(zhì)，尤其要去除與驢親緣關(guān)系較近的馬、騾等的偽品成分；其次阿膠中的成分非常復(fù)雜，檢測時信號不穩(wěn)定，因此該物質(zhì)要滿足在檢測時具有較高的信號響應(yīng)、較低的噪音及其他物質(zhì)干擾，還應(yīng)考慮檢測信號的穩(wěn)定性；第三需要設(shè)立合適的對照品等。對此，本發(fā)明通過選取驢皮源性特征性多肽，并采用多肽I的檢測值減去多肽II的檢測值，并利用多肽III的檢測值來修正檢測偏差，從而實(shí)現(xiàn)對阿膠及其復(fù)方制劑中驢皮源成分的含量檢測。實(shí)驗(yàn)證明，采用本發(fā)明的方法，能夠準(zhǔn)確地檢測阿膠及其復(fù)方制劑中驢皮源成分的含量，且操作簡單，在阿膠產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)控領(lǐng)域?qū)⒕哂袕V泛的應(yīng)用前景。

附圖說明

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述，其中：

圖1是對照品溶液MRM掃描模式下選擇離子對m/z725.3→962.5、m/z386.4→499.3、m/z444.0→331.2監(jiān)測的質(zhì)譜圖。

圖2是各種純品膠MRM掃描模式下選擇離子對m/z725.3→962.5、m/z386.4→499.3、m/z444.0→331.2監(jiān)測的質(zhì)譜圖。

具體實(shí)施方式

以下將參照附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)例進(jìn)行詳細(xì)描述。優(yōu)選實(shí)例中沒有注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或制造廠商所建議的條件進(jìn)行。

實(shí)施例1

1材料和試劑

材料：各種純品膠，包括阿膠、馬皮膠、黃明膠、豬皮膠、羊皮膠，魚皮膠(對照品檢測基質(zhì))分別用驢皮、馬皮、牛皮、豬皮、羊皮、魚皮煎煮獲得。

多肽I、多肽II、多肽III交由生物公司合成。

試劑：碳酸氫銨(分析純)、胰蛋白酶(序列純)

2檢測方法

1)基質(zhì)溶液的制備：

稱取0.50g對照品檢測基質(zhì)于250ml量瓶中，加少量1％(w/w)NH₄HCO₃溶液(pH8.0)，超聲使樣品完全溶解，用1％(w/w)NH₄HCO₃溶液(pH8.0)稀釋至刻度，搖勻。

2)對照品母液的制備：

稱取0.05g對照品檢測基質(zhì)于25ml量瓶中，加少量1％(w/w)NH₄HCO₃溶液(pH8.0)，超聲使樣品完全溶解，分別加入28.3mg的多肽I、15.1mg的多肽II和17.3mg的多肽III，用1％(w/w)NH₄HCO₃溶液(pH8.0)稀釋至刻度，搖勻。

3)對照品溶液的制備：

采用分步稀釋的方法，以基質(zhì)溶液為溶劑，將對照品母液稀釋1000倍，微孔濾膜過濾，精密量取續(xù)濾液100μl，加2mg/ml的胰蛋白酶溶液10μl，37℃恒溫酶解12h。

4)待檢測樣品溶液的制備：

取0.5g待測純品膠樣品(重量記為N₁)，加入水至總體積為5ml，溶解后，加入30％(w/w)的三氯乙酸溶液5ml，超聲15min，4℃靜置30min，離心后去除上清液，沉淀用丙酮洗滌、干燥后稱重(重量記為N₂)，稱取0.05g的沉淀干燥物于25ml量瓶中，加入少量1％的NH₄HCO₃溶液(pH8.0)溶解后，用1％(w/w)的NH₄HCO₃溶液(pH8.0)稀釋至刻度，搖勻，微孔濾膜過濾，精密量取續(xù)濾液100μl，加2mg/ml的胰蛋白酶溶液10μl，37℃恒溫酶解12h。

5)液質(zhì)聯(lián)用儀檢測

分別取對照品溶液、待檢測樣品溶液各5μl放入液質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行檢測。液相條件：C₁₈反相色譜柱(2.1mm×100mm，1.8μm)，流動相A為0.1％(v/v)甲酸的水溶液，流動相B為0.1％(v/v)甲酸的乙腈溶液，流速0.3ml/min；梯度洗脫：0→40min，流動相A 100％→50％，流動相B 0％→50％。質(zhì)譜條件：電噴霧正離子模式(ESI⁺)進(jìn)行多反應(yīng)監(jiān)測，選擇m/z725.3→962.5、818.4，m/z386.4→499.3、643.3，m/z444.0→331.2、613.3作為檢測離子對進(jìn)行MRM掃描，其中選擇m/z725.3→962.5、m/z386.4→499.3、m/z444.0→331.2分別作為多肽I、多肽II和多肽III的定量離子對進(jìn)行定量檢測。

6)樣品中驢皮源成分含量的計(jì)算

圖1是對照品溶液MRM掃描模式下選擇離子對m/z725.3→962.5、m/z386.4→499.3、m/z444.0→331.2監(jiān)測的質(zhì)譜圖。圖2是各種純品膠MRM掃描模式下選擇離子對m/z725.3→962.5、m/z386.4→499.3、m/z444.0→331.2監(jiān)測的質(zhì)譜圖。

以對照品溶液的多肽的含量為縱坐標(biāo)、峰面積為橫坐標(biāo)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，多肽的線性相關(guān)系數(shù)R≥0.998，由此計(jì)算出混合膠中多肽I、多肽II和多肽III的含量，待檢測阿膠樣品中多肽I的含量記為M₁、多肽II的含量記為M₂、多肽III的含量記為M₃，然后，按下式計(jì)算出各樣品中驢皮源成分的含量：

阿膠中驢皮源成分的含量(％)＝(M₁/1448.5–M₂/770.8)×1772/M₃×N₂/N₁＝(0.4633％/1448.5–0％/770.8)×1772/0.4392％×0.4035/0.5012×100％＝103.9％≈100％

馬皮膠中驢皮源成分的含量(％)＝(M₁/1448.5–M₂/770.8)×1772/M₃×N₂/N₁＝(0.4712％/1448.5–0.2508％/770.8)×1772/0.4408％×0.4012/0.5008×100％≈0％

黃明膠中驢皮源成分的含量(％)＝(M₁/1448.5–M₂/770.8)×1772/M₃×N₂/N₁＝(0％/1448.5–0％/770.8)×1772/0.4233％×0.4028/0.5021×100％＝0％

豬皮膠中驢皮源成分的含量(％)＝(M₁/1448.5–M₂/770.8)×1772/M₃×N₂/N₁＝(0％/1448.5–0％/770.8)×1772/0.4567％×0.4068/0.5022×100％＝0％

羊皮膠中驢皮源成分的含量(％)＝(M₁/1448.5–M₂/770.8)×1772/M₃×N₂/N₁＝(0％/1448.5–0％/770.8)×1772/0.4322％×0.4038/0.5012×100％＝0％

上述計(jì)算結(jié)果表明：阿膠中驢皮源成分的含量100％，馬皮膠、黃明膠、豬皮膠和羊皮膠中驢皮源成分的含量為0％。這與實(shí)際情況相符，表明該方法能從驢皮源成分含量的角度準(zhǔn)確區(qū)分阿膠與偽品膠。

實(shí)施例2

1材料和試劑

材料：

混合膠樣品由實(shí)施例1中的純品膠樣品分別加入不同質(zhì)量的阿膠制成，包括含15％阿膠的黃明膠、含30％阿膠的黃明膠、含60％阿膠的黃明膠。

阿膠復(fù)方制劑樣品：用復(fù)方阿膠漿生產(chǎn)工序中的植物藥材提取濃縮溶液，分別加入上述混合膠，按照每9g植物藥材提取濃縮溶液加入1.0g混合膠樣品制成3個復(fù)方膠類中藥制劑，分別命名為制劑1、制劑2、制劑3，驢皮源成分含量分別為1.5％、3.0％、6.0％。

多肽I、多肽II、多肽III，魚皮膠(對照品檢測基質(zhì))按照實(shí)施例1方法制備。

試劑：碳酸氫銨(分析純)、胰蛋白酶(序列純)。

2檢測方法

1)基質(zhì)溶液的制備：

稱取0.50g對照品檢測基質(zhì)于250ml量瓶中，加少量1％(w/w)NH₄HCO₃溶液(pH8.0)，超聲使樣品完全溶解，用1％(w/w)NH₄HCO₃溶液(pH8.0)稀釋至刻度，搖勻。

2)對照品母液的制備：

稱取28.3mg的多肽I、15.1mg的多肽II和17.3mg的多肽III于25ml量瓶中，用上述配制的基質(zhì)溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻。

3)對照品溶液的制備：

采用分步稀釋的方法，以基質(zhì)溶液為溶劑，分別將對照品母液稀釋500倍、1000倍、2000倍、4000倍、8000倍、10000倍，微孔濾膜過濾，精密量取續(xù)濾液100μl加2mg/ml的胰蛋白酶溶液10μl，37℃恒溫酶解12h。

4)待檢測樣品溶液的制備：

取5.0g(重量記為N₁)待測阿膠復(fù)方制劑樣品，加入水至總體積為5ml，混合后，加入30％的三氯乙酸溶液5ml，超聲15min，4℃靜置30min，離心后去除清液，沉淀用丙酮洗滌、干燥后稱重(重量記為N₂)，稱取0.05g的沉淀干燥物于25ml量瓶中，加入少量1％(w/w)的NH₄HCO₃溶液(pH8.0)溶解后，用1％(w/w)的NH₄HCO₃溶液(pH8.0)稀釋至刻度，搖勻，微孔濾膜過濾，精密量取續(xù)濾液100μl加2mg/ml的胰蛋白酶溶液10μl，37℃恒溫酶解12h。

5)液質(zhì)聯(lián)用儀檢測

分別取對照品溶液、阿膠復(fù)方制劑樣品溶液各5μl放入液質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行檢測。液相條件：C₁₈反相色譜柱(2.1mm×100mm，1.8μm)，流動相A為0.1％甲酸的水溶液，流動相B為0.1％甲酸的乙腈溶液，流速0.3ml/min；梯度洗脫：0→40min，流動相A 100％→50％，流動相B 0％→50％。質(zhì)譜條件：電噴霧正離子模式(ESI⁺)進(jìn)行多反應(yīng)監(jiān)測，選擇m/z725.3→962.5、818.4，m/z386.4→499.3、643.3，m/z444.0→331.2、613.3作為檢測離子對進(jìn)行MRM掃描，其中選擇m/z725.3→962.5、m/z386.4→499.3、m/z444.0→331.2分別作為多肽I、多肽II和多肽III的定量離子對進(jìn)行定量檢測。

6)樣品中驢皮源成分含量的計(jì)算

以對照品溶液的各多肽的含量為縱坐標(biāo)、峰面積為橫坐標(biāo)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，各多肽的線性相關(guān)系數(shù)R≥0.998，由此計(jì)算出混合膠中多肽I、多肽II和多肽III的含量，待檢測阿膠樣品中多肽I的含量記為M₁、多肽II的含量記為M₂、多肽III的含量記為M₃，然后，按下式計(jì)算出各樣品中驢皮源成分的含量：

制劑1中驢皮源成分的含量(％)＝(M₁/1448.5–M₂/770.8)×1772/M₃×N₂/N₁(0.0670％/1448.5–0％/770.8)×1772/0.4392％×0.4102/5.02×100％＝1.52％

制劑2中驢皮源成分的含量(％)＝(M₁/1448.5–M₂/770.8)×1772/M₃×N₂/N₁(0.1327/1448.5–0％/770.8)×1772/0.4412％×0.4166/5.05×100％＝3.04％

制劑3中驢皮源成分的含量(％)＝(M₁/1448.5–M₂/770.8)×1772/M₃×N₂/N₁(0.2601/1448.5–0％/770.8)×1772/0.4322×0.4187/5.05×100％＝6.10％

上述計(jì)算結(jié)果表明：檢測含量與實(shí)際情況相符，表明該方法能準(zhǔn)確檢測復(fù)方制劑中阿膠成分的含量，從而實(shí)現(xiàn)判別阿膠及其復(fù)方制劑真?zhèn)蔚哪康摹?/p>

綜上所述，利用本發(fā)明公開的三個多肽以及對照品檢測基質(zhì)，采用液質(zhì)聯(lián)用儀，能準(zhǔn)確檢測阿膠及其復(fù)方制劑中阿膠的含量。

需要說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過參照本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)對本發(fā)明進(jìn)行了描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員對本發(fā)明作的各種改動或修改而不背離本發(fā)明的精神與范圍，這些等價形式同樣落在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

序列表

<110> 東阿阿膠股份有限公司

<120> 一種用于阿膠及其復(fù)方制劑真?zhèn)舞b定的組合物、試劑盒及其檢測方法

<130> KLPI161263

<160> 3

<170>PatentIn 3.5

<210> 1

<211> 16

<212> PRT

<213> 多肽I

<400> 1

Ala Gly Glu Thr Gly Ala Ser Gly Pro Hyp Gly Phe Ala Gly Glu Lys

<210> 2

<211> 9

<212> PRT

<213> 多肽II

<400> 2

Gly Ala Ser Gly Pro Ala Gly Val Arg

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> 多肽III

<400> 3

Gly Ser Glu Gly Pro Gln Gly Val Arg