本發明涉及食品安全檢測免疫分析技術領域，具體而言，涉及一種三唑磷生物條形碼免疫分析測定試劑盒及其應用。
背景技術：
隨著高毒農藥品種將逐步從市場退出，三唑磷已成為替代甲胺磷農藥的主要品種，廣泛用于長江中下游流域水稻二化螟的防治。近年來其使用量迅速增加，在三唑磷農藥在我國正進入市場旺季的同時，國外已經開始限制或禁止三唑磷農藥的使用與銷售。2004年11月28日，國家質檢總局發布緊急預警，稱歐盟于12月31日起正式禁止320種農藥在歐盟銷售。其中涉及中國正在生產、使用以及出口的農藥達60多個品種，其中就包括了三唑磷農藥。其他家和地區對三唑磷的最大殘留限量也提出了越來越嚴格的標準：日本規定稻米中三唑磷的最大殘留限量(MRL)為不得檢出；歐盟除茶葉為0.05mg/kg、棉籽0.1mg/kg外，其余樣品為0.02mg/kg；我國三唑磷的最大殘留限量一般都限定為0.05mg/kg。因此，加強三唑磷檢測方法學研究對于保障我國食品安全和農產品貿易具有重要意義。
免疫分析方法的作用和地位目前已得到國內外學者的廣泛認可，免疫分析方法的研究也是檢測方法研究最熱門的領域之一。在免疫分析方法領域中，我國在酶聯免疫分析方法方面開展了較為深入的研究，包括半抗原合成、抗體制備、標記物偶聯、反應體系中各種理化性質對免疫分析方法的影響及半抗原結構與其所制備得到抗體之間的構效關系等方面。近年來，我國學者在熒光免疫分析、化學發光免疫分析、生物傳感器和生物條形碼免疫分析方法方面也開展了較多的研究工作。
納米金制備簡單，在光學、電學、化學和催化方面有著獨特的性質，納米金還具有良好的生物相容性，在核酸、蛋白質等生物檢測領域表現出潛在的應用價值。目前國內外已報道了多種基于納米金的檢測方法，主要包括基于納米金的比色分析法、納米金標記銀染增強法、生物條形碼技術、基于納米金的突光分析法、基于納米金的電化學分析法等。本研究通過改變生物條形碼免疫分析方法的現有反應模式，建立基于小分子競爭反應模式的生物條形碼免疫分析方法并利用酶標板進行檢測。通過將農藥小分子半抗原與載體蛋白的偶聯物包被于磁性納米粒子表面，并于膠體金納米探針表面結合農藥抗體和起信號放大作用的生物條形碼，利用磁性納米粒子表面的包被抗原與農藥分子競爭結合膠體金納米探針表面的抗體建立競爭型免疫化學反應體系。利用磁分離系統分離免疫結合的抗原抗體復合物，采用熱變性技術促使膠體金納米探針釋放生物條形碼，以經銀染顯色的納米金探針標記技術為基礎，結合生物素親和素系統，首次建立了一種能在酶標儀上快速檢測生物條形碼而間接測定農藥殘留的生物條形碼免疫分析方法，實現對三唑磷農藥的定量檢測。
有鑒于此，特提出本發明。
技術實現要素：
本發明的目的在于提供一種三唑磷生物條形碼免疫分析測定試劑盒，使用該試劑盒可以特異地定量檢測水中或食品中三唑磷含量。該試劑盒通過競爭反應體系進行檢測，克服了目前生物條形碼免疫分析方法采用的“三明治”結構模式基本不能適用于三唑磷的檢測的缺陷。
為了實現本發明的上述目的，特采用以下技術方案：
一種三唑磷生物條形碼免疫分析測定試劑盒，所述試劑盒包括：
三唑磷標準品、三唑磷磁性納米探針、單標膠體金納米探針、三唑磷雙標膠體金納米探針、酶標板、銀染試劑；
所述三唑磷磁性納米探針由磁性納米粒子和三唑磷完全抗原偶聯而成；
所述單標膠體金納米探針由單鏈DNA1包被膠體金顆粒得到；
所述三唑磷雙標膠體金納米探針由抗三唑磷抗體和雙鏈DNA包被膠體金顆粒得到；
所述生物素探針由單鏈DNA2標記生物素得到；
所述酶標板包被有鏈霉親和素；
所述雙鏈DNA由硫醇修飾的單鏈DNA和條形碼單鏈DNA互補配對而成；所述單鏈DNA1和單鏈DNA2與所述條形碼單鏈DNA存在互補配對關系，且配對區域不重疊。
本發明通過改變生物條形碼免疫分析方法的現有反應模式，建立基于小分子競爭反應模式的生物條形碼免疫分析方法。通過將三唑磷與載體蛋白的偶聯物包被于磁性納米粒子表面制備三唑磷磁性納米探針，并于膠體金納米探針表面結合農藥抗體和起信號放大作用的生物條形碼用以制備三唑磷雙標膠體金納米探針，利用磁性納米粒子表面的包被抗原與農藥分子競爭結合膠體金納米探針表面的抗體建立競爭型免疫化學反應體系。利用磁分離系統分離免疫結合的抗原抗體復合物，采用熱變性技術促使膠體金納米探針釋放生物條形碼，并利用偶聯有DNA探針的酶標板和單標膠體金納米探針雜交結合生物條形碼，進而利用金標銀染法測定生物條形碼含量，實現對三唑磷農藥的定量檢測。
酶標板上的DNA2為捕獲DNA，能與條形碼DNA互補配對并將其捕獲在芯片上；單標膠體金納米探針上的DNA1的作用在于進一步放大條形碼DNA信號。
雙標膠體金納米探針是雙鏈DNA包被膠體金顆粒和抗被檢物的抗被檢物抗體，雙鏈DNA中的1條和膠體金顆粒通過Au—S鍵相連，另1條DNA鏈是用來指示被檢物的條形碼DNA。每一個膠體金顆粒上標記有很多條的條形碼DNA，因而起到方法信號的作用，靈敏度較高。
在實際操作中，條形碼DNA的選擇為現有技術，只要特異性和靈敏度夠好即可。
該試劑盒的使用效果具有簡便、快速、靈敏、特異、穩定等優點。并且，根據本發明的檢測系統為開放式操作，簡便快速，特別適合廣大的質檢機構推廣使用，為食品安全檢測提供一種非常有價值的檢測手段。
優選的，如上所述的試劑盒，所述三唑磷完全抗原由三唑磷和載體蛋白偶聯而成。
雞卵白蛋白(Ovalbumin，OVA)也稱雞卵清白蛋白，由386個氨基酸組成，分子量約43Kd。OVA作為惰性蛋白，它能維持膠體金的膠體穩定，起著有分散膠體金顆粒的骨架作用。
惰性蛋白也可選用酪蛋白(Casein)或牛血清白蛋白(BSA)等。
優選的，如上所述的試劑盒，所述載體蛋白為雞卵白蛋白。所述磁性納米粒子的粒徑為18～22nm。
優選的，如上所述的試劑盒，所述磁性納米粒子的粒徑為18～22nm。
磁性納米粒子的粒徑對三唑磷完全抗原的偶聯數量有著很大的影響，從而影響著最終反應的靈敏度。
優選的，如上所述的試劑盒，所述膠體金顆粒的粒徑為13～15nm。
本申請的技術要點是通過形成三唑磷磁性納米探針-三唑磷雙標膠體金納米探針的結合，與三唑磷-三唑磷雙標膠體金納米探針的結合進行競爭，并且前者的結合應該可以均一的分離。靈敏度提高的關鍵在于被檢物的有效回收和作為每個被檢物識別結合位點對應的條形碼DNA鏈的有效釋放。條形碼DNA的量對應被檢物的量(三唑磷磁性納米探針對被檢三唑磷的競爭性結合的抑制率)，因此可以通過定量條形碼DNA間接定量痕量的被檢物。三唑磷磁性納米探針-三唑磷雙標膠體金納米探針的結合實質是磁性納米探針中的三唑磷完全抗原與雙標膠體金納米探針中的抗三唑磷抗體的結合，而二者的結合強度與抗體/抗原的量密切相關，抗體/抗原的量則與膠體金顆粒/磁性納米粒子的粒徑密切相關。
優選的，如上所述的試劑盒，所述三唑磷雙標膠體金納米探針具體由以下方法制備得到：
1)、取膠體金溶液調pH至8.8～9.2后向其中加入抗三唑磷抗體，攪拌混合，靜置25～35min；然后加入硫醇修飾的單鏈DNA鏈，8～12℃靜置36～44h；再調整pH至7.3～7.5，加入NaCl至濃度0.08～0.12mol/L，8000～11000r/min離心8～12min，棄上清，得到含寡核苷酸的膠體金；
2)、用牛血清白蛋白濃度為0.8～1.2％的磷酸鹽緩沖溶液重懸所述含寡核苷酸的膠體金，孵育1～3h；再加入與所述硫醇修飾的單鏈DNA鏈互補的生物條形碼DNA鏈，室溫雜交3～5h，8000～11000r/min離心，棄上清，得到所述三唑磷雙標膠體金納米探針。
進一步優選的，如上所述的試劑盒：
在加入NaCl至既定濃度時，在120～180min內分2～4次等量加入，每次間隔40～60min。
優選的，如上所述的試劑盒，所述抗三唑磷抗體為單克隆抗體。
單克隆抗體由于可以通過細胞株進行生產，各批次之間性質穩定，且特異性強，因而更適合試劑盒產品。
如上所述的三唑磷生物條形碼免疫分析測定試劑盒在三唑磷定性定量分析中的應用。
如上所述的三唑磷生物條形碼免疫分析測定試劑盒測定三唑磷的方法，包括：
a)、將三唑磷標準品、提取與凈化后的待測樣品分別與等體積的三唑磷雙標膠體金探針和三唑磷磁性納米探針混合孵育；
b)、洗滌孵育產物并去雜化得到與各標準品與待測樣品對應的生物條形碼；
c)、將所述生物條形碼與所述偶聯有生物素的單鏈DNA2和單標納米金探針雜交，形成“生物素探針-生物條形碼-單標膠體金探針”的三明治結構，然后經生物素和鏈霉親和素作用將生物條形碼固定在包被鏈霉親和素的酶標板上，加入銀染試劑并用酶標儀測定儀測定各孔灰度值；；
d)、以三唑磷標準品的濃度為橫坐標，各濃度所對應的灰度抑制率為縱坐標，建立標準曲線，并根據標準曲線計算各樣品中的三唑磷濃度。
與現有技術相比，本發明的有益效果為：
(1)本發明可以特異地定量檢測三唑磷含量。具有簡便、快速、靈敏、特異、穩定等優點。并且，根據本發明的檢測系統為開放式操作，簡便快速，特別適合廣大的質檢機構推廣使用，為食品安全檢測提供一種非常有價值的檢測手段。
(2)根據本發明的試劑盒，磁性納米探針中的三唑磷半抗原與檢測樣品中的三唑磷競爭三唑磷雙標膠體金探針上的三唑磷單抗形成直接競爭體系，因此本法采用的競爭反應體系，即確保檢測的靈敏度，也可有效保證檢測結果的良好重現性。另外，這種模式還便于操作和生產。
(3)本發明的試劑盒使用的是銀染方法，通過檢測酶標板上的灰度值，靈敏度大大提高，可為蔬菜水果中三唑磷的檢測提供更為靈敏、快速、可靠的依據。
附圖說明
為了更清楚地說明本發明具體實施方式或現有技術中的技術方案，下面將對具體實施方式或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖是本發明的一些實施方式，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他的附圖。
圖1為本發明實施例中以三唑磷標準品的濃度為橫坐標，各濃度所對應的灰度抑制率為縱坐標，建立的標準曲線。
具體實施方式
下面將結合實施例對本發明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發明，而不應視為限制本發明的范圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規產品。
實施例1
三唑磷生物條形碼免疫分析測定試劑盒的制備方法
S11、單標膠體金探針的制備
1)、金納米顆粒合成方法
向硅化好的燒杯中分別加入98mL去離子水，再分別入2mL 50mM氯金酸原液，使氯金酸的濃度為1mM，在磁力攪拌器上1000rpm/min攪拌、250℃加熱，液體沸騰后繼續煮沸2min；吸取10mL 38.8mM檸檬酸三鈉，迅速一次性加入燒杯中，保持攪拌速度和加熱溫度不變，繼續煮沸6min，可發現溶液顏色由無色逐漸變成紫色，再變成酒紅色，根據加入檸檬酸三鈉還原劑量的不同最終變成不同的顏色，待液體冷卻后用去離子水補回原體積，于4℃密閉保存，合成的金納米顆粒的粒徑控制在13～15nm。
2)、取巰基化DNA1溶液，加入100mmol/L的三(2-羧乙基)膦溶液(TCEP)，在室溫下搖床上放置2小時。還原劑TCEP與DNA1之間的比例接近200:1，高比例的差距加快反應速度，提高還原效果。室溫下，新合成的納米金球在6000rcf轉速下20離心分鐘，將納米金球取出溶于超純水。取一定體積的納米金球10000rcf離心20分鐘，去掉上清液，加入0.5×Tris-硼酸(TBE)緩沖溶液，然后加入所取的巰基化DNA的量，加入氯化鈉溶液至氯化鈉濃度為50mmol/L，常溫下，反應24小時。逐漸添加氯化鈉至濃度為500mmol/L(分3次加入，每次隔1個小時加入一次)，常溫下靜置8小時。10000rcf離心20分鐘，除去上清液，溶于超純水，重復3次，得到巰基化DNA1修飾的納米金球GNP溶液。
S12、三唑磷雙標膠體金探針的制備
取一定體積膠體金溶液，用0.1mol/L K2CO3調節至pH＝9.0；靜置15min，加入一定量的三唑磷單克隆抗體，在攪拌下將膠體金和抗體混合，靜置30min。然后加入硫醇修飾的DNA鏈，10℃靜置40h，再以磷酸緩沖液(PBS)調整至pH＝7.4，提高NaCl濃度，NaCl分3次加入，每隔1個小時加入一次，至終濃度0.1mol/L，10000r/min離心10min，即得到含寡核苷酸的膠體金。用1mL PBS緩沖液重懸含寡核苷酸的膠體金，靜置10～15分鐘，然后再加入5％牛血清白蛋白(BSA)，使BSA終濃度為1％，封閉1h。再加入與硫醇修飾的所述單鏈DNA鏈互補的生物條形碼DNA鏈，室溫雜交4h，10000r/min離心得到雙標膠體金納米探針。
S13、三唑磷磁性納米探針的制備
1)、雞卵白蛋白(OVA)標記三唑磷半抗原的制備
辣根過氧化物酶標記三唑磷半抗原的制備，具體方法如下：
取半抗原0.25mmol，溶于1mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，攪拌下加入60μl正三丁胺和30μl氯甲酸乙酯，室溫攪拌反應1h。取反應液300μl緩慢滴加到6mL溶有120mg OVA的碳酸鹽緩沖液(CBS，0.01mol/L)中，室溫攪拌反應2h后，裝入透析袋，先用蒸餾水透析3次，然后用0.01mol/L的PBS透析3d，每天換透析液3-4次。取出分裝保存于-20℃的冰箱中。
2)、磁性納米粒子合成方法
磁性微球的形成過程：取8.1g FeCl3·6H2O和3.3g FeCl2·4H2O加入150mL去離子水，配成溶液，然后移入三口燒瓶中。在N2保護環境中與劇烈攪拌狀態下向Fe2+和Fe3+的混合溶液中18mL質量分數為25％的濃氨水，溶液中開始生成棕褐色的Fe3O4粒子，調節溶液的pH值在9～11之間，此刻反應溫度為70℃，在反應的過程中要保證一定的攪拌速度，反應的離子方程式為：
Fe2++2Fe3++8OH-＝Fe3O4+4H2O
Fe3O4/油酸的合成：在劇烈攪拌狀態下將5.0g油酸(C18H34O2)加入Fe3O4的液體中，然后在N2保護環境下，溫度為70℃水浴中反應一個小時，使油酸均勻的包覆在粒子表面。反應結束后，得到黑色溶膠狀物質，利用外加磁場將所得的沉淀從反應體系中分離出來，用乙醇洗滌3次除去多余的油酸，再用去離子水洗滌至pH＝7，此時得到油酸均勻包覆的Fe3O4粒子。
單層羧基功能化的Fe3O4粒子合成：采用高錳酸鉀氧化油酸法合成壬二酸(HOOC(CH2)7COOH)形成羧基化磁性納米粒子。加入160mL濃度為10mg/mL的KMnO4溶液在劇烈攪拌狀態，溫度為50℃條件下反應8h，反應結束后利用外加磁場將所得沉淀從反應介質中分離出來，并先后用去離子水洗滌3次，所得產物在40℃下真空干燥，將干燥后的粒子溶于水溶液便得到穩定的羧基化磁性納米粒子。磁性納米粒子的粒徑控制在18～22nm。
3)、磁性微球和OVA-半抗原的連接
a)、微球的活化。用pH＝6.0，15mmol/L的2-(N-嗎啡啉)乙磺酸緩沖液(MES)作為活化緩沖溶液，取1mL磁珠于2.0mL離心管中，加入活化緩沖溶液后，將上清液吸掉；再用活化緩沖液重新洗滌磁珠2遍，再分別加入碳二亞胺與N-羥基琥珀酰亞胺，在漩渦振蕩器上混合均勻，室溫活化30min。
b)、微球與OVA-半抗原偶聯。用pH＝7.4，0.01mol/L的磷酸鹽吐溫(PBST，1％Tween-20)溶液作偶聯緩沖液，用活化緩沖液重新洗滌已經活化的磁珠3遍，再用偶聯緩沖液洗滌磁珠2遍；然后用偶聯緩沖液重懸磁珠，再加入OVA-半抗原，使得磁珠表面活化的羧基與OVA的氨基于37C下反應1h，將OVA-半抗原偶聯于磁珠表面，得到免疫磁珠。
c)、封閉。用偶聯緩沖液洗滌偶聯后磁珠2遍，加入含有2％BSA的偶聯緩沖液封閉磁珠60min。最終得到免疫磁性探針。
S14、三唑磷標準品的制備
用三唑磷純品配制，濃度分別為0ng/mL、0.05ng/mL、0.01ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL，共7瓶；
所述三唑磷純品純度不低于90％。
S15、反應體系工作濃度選定
經優化選定磁性納米探針稀釋倍數為100倍，膠體金納米探針稀釋倍數為10倍。
S16、包被酶標板
鏈霉親和素用碳酸鹽包被液稀釋,每孔包被100μL，加入偶聯有生物素的單鏈捕獲DNA，潮濕環境下4℃過夜。洗滌2次，拍干，4℃備用。
S17、銀染檢測
10μL待測DNA與20μL雜交液混勻,然后加入單標膠體金探針，均勻加入酶標板中，25℃雜交10min，洗液清1min，10μL單標納米金探針溶液與上述混合物混勻，室溫封閉30min。將該雜交產物轉移到各酶標板孔，37℃保溫20min，傾倒干凈。加入新制銀染液100μL(避光操作)，室溫反應10min后置于去離子水以終止反應，酶標儀檢測。
S18、半成品及成品組成
上述步驟所得部分分裝即為半成品，抽出三份經過特異性、精密性、靈敏度及穩定性檢定合格才能組裝為三唑磷生物條形碼免疫分析測定試劑盒，組裝成試劑盒后還需抽檢合格后才能出廠。
綜上，在本發明的研究過程中，本發明的發明人首先對所用的原材料進行了篩選試驗和質量鑒定，包括抗體和三唑磷半抗原的活性，膠體金顆粒的粒徑，磁性納米顆粒的粒徑和磁性等。然后通過對試劑盒的反應模式、反應時間、偶聯效率、銀染時間，等一系列的條件進行了優化，建立了高靈敏度及良好重現性的三唑磷生物條形碼免疫分析測定方法。
實施例2
本發明的試劑盒使用方法
以上實施案例1制備的三唑磷生物條形碼免疫分析測定試劑盒的具體操作如下：
S21、自4℃冰箱中取出試劑盒，室溫平衡10分鐘；
S22、樣品提取與凈化
稱取10.0g(精確至0.01g)樣品；加入10mL乙腈，高速勻漿0.5min，加入4.0g無水MgSO4和1.0g NaCl后高速渦旋1min，在4℃以10000r/min高速離心5min。準確移取2mL乙腈提取液于10mL塑料離心管中，加入50mg N-丙基乙二胺(PSA)和50mg C18固相分散萃取凈化劑，高速渦旋0.5min后，在4℃以10000r/min高速離心5min。取1mL上清液，在30℃下氮吹至干，殘渣用1mL含10％甲醇的PBS緩沖液溶解。
S23、反應孔中加入20μL三唑磷雙標膠體金探針，然后反應孔中分別加各濃度三唑磷標準品(0ng/mL、0.05ng/mL、0.01ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL)和經前處理后得到的樣品各20μL，設一個重復，然后每孔加入三唑磷磁性納米探針20μL，用微量振蕩器充分振蕩混勻，然后置于溫度為37℃，相對濕度為70％的恒溫恒濕培養箱中溫育1h；
S24、用PBST液洗滌三次，去雜化得到生物條形碼；
S25、酶標板加入銀染試劑，室溫反應10min后置于去離子水以終止反應；
S26、用酶標儀測定儀測定各孔灰度值；
S27、以三唑磷標準品的濃度為橫坐標，各濃度所對應的灰度抑制率為縱坐標，建立標準曲線，并根據標準曲線計算各樣品中的三唑磷濃度。
標準曲線圖見圖1。
實驗例1
本發明試劑盒的方法學檢定結果
按照本領域中常見的檢定規程對實施案例1中制備的試劑盒進行鑒定，結果見表1。
表1本發明試劑盒的方法學檢定結果
以上結果表明“三唑磷生物條形碼免疫分析測定試劑盒”的準確性、特異性、精密性、靈敏度和穩定性是完全符合條件的。
實驗例2
三唑磷添加回收率試驗
為了檢驗三唑磷生物條形碼免疫分析測定試劑盒的實際應用性能，將三唑磷標準溶液加入到自來水中來模擬被三唑磷污染的水樣，通過標準添加回收實驗來測定自來水中三唑磷的濃度，添加濃度為10ng/mL、50ng/mL和100ng/mL的三唑磷，檢測結果見表2。
表2樣品中三唑磷的添加回收率
盡管已用具體實施例來說明和描述了本發明，然而應意識到，在不背離本發明的精神和范圍的情況下可以作出許多其它的更改和修改。因此，這意味著在所附權利要求中包括屬于本發明范圍內的所有這些變化和修改。