一種基于納米光纖生物傳感器檢測有毒物質的方法與流程

本發明屬于免疫技術及衛生檢測技術領域，具體涉及一種基于納米光纖生物傳感器檢測有毒物質的方法。

背景技術：

近年來，我國養殖業的發展越來越迅速，產生了巨大的經濟效益。眾所周知，飼料是養殖業發展的物質基礎，在養殖生產成本中所占比例較大，確保飼料中的營養物質和具有有毒有害物質的檢測方法是保證養殖業發展的關鍵環節之一。在養殖業繁榮發展的背后，我們發現市場上的動物源性產品存在的安全隱患越來越多，對社會造成了很大的負面影響。出現這種現象的主要原因是養殖業所使用的飼料中有毒有害物質嚴重超標，這種存在于飼料中的有毒有害物質被飼養動物食用后，可能在體內轉化為毒性更大的物質并且被蓄積，通過食物鏈到達人體體內后，對人體的健康造成了極大的危害。通過調查研究發現，飼料中最常見、危害最大的有毒有害物質有三聚氰胺、伏馬毒素B₁、T-2毒素、黃曲霉毒素B₁、赭曲霉毒素A、嘔吐毒素及玉米赤霉烯酮，其中，三聚氰胺在體內可形成較大的網狀結構，造成結石；赭曲霉素A對人體有強烈的腎臟毒性、肝臟毒性、致癌性和致畸性等；T-2毒素能抑制人體重要器官蛋白質和DNA的合成；玉米赤霉烯酮對人體具有生殖發育毒性，免疫毒性和致癌性等；伏馬毒素B₁對肝、腎、肺及神經系統具有較大毒性；黃曲霉毒素B₁對人體的肝臟具有破壞作用，嚴重時可導致肝癌甚至死亡；嘔吐毒素對人體具有致畸性，神經毒素和胚胎毒性等；上述7種有毒物質在糧谷、飼料中的含量很低時就會對人體產生毒性。

量子點是多電子體系，發光效率遠高于單個分子，可以經受多次激發，且標記后對生物大分子的生理活性影響很小，因此為研究生物大分子之間的長期作用提供了可能。量子點可以經受反復多次激發，而不像有機熒光分子那樣容易發生熒光漂白或熒光碎滅。因此結合量子點研究上述物質的檢測方法對于提高動物源性食品質量，改善人類健康，促進養殖業的發展具有重要意義。

本專利采用的是不同粒徑的量子點對糧谷和飼料中的7種有毒有害物質進行檢測，這七種量子點在370nm的激發波長下，會在不同的發射波長下呈現不同顏色的熒光，從而可以避免待檢測物的相互干擾。

技術實現要素：

本發明的目的是提供一種基于納米光纖生物傳感器檢測有毒物質的方法。

一種基于納米光纖生物傳感器檢測有毒物質的方法，它包括：

1）量子點和BSA全抗原的偶聯：BSA全抗原分別與不同規格量子點偶聯，得多個量子點-BSA全抗原偶聯物；

2）基底包被：多微孔板的微孔基底包被不同的抗有毒物質抗體，洗滌，封閉；

3）有毒物質與包被基底偶聯：按國家標準處理樣品，處理后的樣品，加入已包被基底的微孔內，清洗；

4）量子點-BSA全抗原分別加入相對應的微孔中，PBS洗滌后，再加入PBS緩沖液；

5）檢測：在370或450nm激發波長下，用熒光強度檢測儀同時檢測每個微孔中量子點發射峰強度；

所述的BSA全抗原為BSA有毒物質全抗原，所述的有毒物質為三聚氰胺、伏馬毒素B1、T-2毒素、黃曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A、嘔吐毒素和\或玉米赤霉烯酮，所述的抗體為單克隆抗體；

所述的量子點為ZnSe/ZnS（紫色）、CdS/ZnS（藍色）、CdSe/ZnS（青色）、CdSe/ZnS（綠色）、CdSe/ZnS（綠色）、CdSe/ZnS（黃色）、CdSe/ZnS（橙色）和\或CdSe/ZnS（紅色）；

步驟5）所述的激發波長為370 nm；

步驟5）所述的發射峰強度為405nm時的發射峰強度。

本發明又一個目的是為實現一種基于納米光纖生物傳感器檢測有毒物質的方法而專門提供的一種熒光強度檢測儀。

一種熒光強度檢測儀包括：臺架1、多個激發光源2、多微孔板3、熒光檢測裝置4和熒光光譜儀5；所述的多微孔板3上設有微孔31，微孔31為錐形圓柱凹槽，呈圓周排列在八微孔板3上；所述的臺架1包括底板14、載物臺13、可調支架12、光源固定板11；所述的載物臺13、設置在底板14上方，可調支架12固定在載物臺13上，光源固定板11設置載物臺在上方，固定在可調支架12上；激發光源2固定在光源固定板11；所述的熒光檢測裝置4固定在載物臺13上；所述的熒光檢測裝置4包括熒光檢測探頭41、凸透鏡42、錐孔43；熒光檢測裝置4上部設有與微孔31外形相對應的錐孔43，下部設有熒光檢測探頭41；

所述的錐孔43下部、熒光檢測探頭41上部設有凸透鏡42；

所述的激發光源2、微孔板3的微孔31、熒光檢測裝置4均為8個；

所述的微孔31為錐形圓柱凹槽，上底面直徑為6.8mm，下底面直徑為6.21mm，高11.7mm。

本發明提供了一種基于納米光纖生物傳感器檢測有毒物質的方法，包括多種量子點分別與多種BSA全抗原的偶聯、基底包被、有毒物質抗體與包被基底偶聯，在370nm激發波長下采用不同粒徑的量子點對糧谷和飼料中的7種有毒有害物質進行檢測，檢測結果表明方法的靈敏度、準確度較好，特異性較強。本發明還提供了一種熒光強度檢測儀，通過熒光強度檢測儀，可以同時檢測七種有毒物質，操作過程簡便，且各檢測物彼此并不干擾，檢測結果準確度好。

附圖說明

圖1為本發明一種熒光強度檢測儀整體結構立體圖；

圖2為本發明一種熒光強度檢測儀整體結構立體圖；

圖3為本發明一種熒光強度檢測儀原理圖；

圖4為本發明一種熒光強度檢測儀局部結構圖；

圖5為本發明一種熒光強度檢測儀檢測檢測傳感器剖面圖；

圖6為本發明一種熒光強度檢測儀檢測檢測八孔板立體圖；

圖7本發明一種熒光強度檢測儀檢測檢測八孔板剖面圖；

圖8 三聚氰胺的標準曲線；

圖9伏馬毒素B1的標準曲線；

圖10 T-2毒素的標準曲線；

圖11黃曲霉毒素B1的標準曲線；

圖12赭曲霉毒素A的標準曲線；

圖13嘔吐毒素的標準曲線；

圖14玉米赤霉烯酮的標準曲線。

具體實施方式

實施例1 熒光強度檢測儀

請參見圖1-7；一種熒光強度檢測儀，包括：臺架1、激發光源2、八孔板3、熒光檢測裝置4；

其中所述的八孔板3上設有微孔31，微孔31為錐形圓柱凹槽，呈圓周排列在八孔板3上；

所述的臺架1包括底板14、載物臺13、可調支架12、光源固定板11；

所述的載物臺13、設置在底板14上方，可調支架12固定在載物臺13上，光源固定板11設置載物臺在上方，固定在可調支架12上；

所輸的可調支架12可以調節載物臺13與光源固定板11之間的高度；

所述的載物臺13、光源固定板11上均設有與八孔板3位置相對應的通孔；

所述的激發光源2固定在光源固定板11的通孔上；

所述的熒光檢測裝置4固定在載物臺13上的通孔內；

所述的熒光檢測裝置4包括熒光檢測探頭41、凸透鏡42、錐孔43；

熒光檢測裝置4上部設有與微孔31外形相對應的錐孔43，錐孔43下部設有凸透鏡42，凸透鏡42下部設有熒光檢測探頭41；

所述的熒光檢測探頭41設置在凸透鏡42焦點處；

熒光檢測探頭41的輸出光纖與熒光光譜儀5連接，熒光光譜儀5與電腦6連接；

所述的微孔31為錐形圓柱凹槽，上底面直徑為6.8mm，下底面直徑為6.21mm，高11.7mm。

使用時，將待測液體注入八孔板3的微孔31中，液面低于微孔31，調節可調支架12，升高激發光源2，將八孔板3放在熒光檢測裝置4上，使微孔31完全進入錐孔43內，節可調支架12，降低激發光源2，使激發光源2的探頭位于待測液體上表面；打開激發光源2，待測液體發出的熒光經熒光檢測探頭42傳遞至熒光光譜儀5，最后輸送至電腦6。

實施例2 量子點和抗體的偶聯

1）量子點選擇：ZnSe/ZnS（粒徑 4nm，紫色）、CdS/ZnS（粒徑 8nm，藍色）、CdSe/ZnS（粒徑 10nm，青色）、CdSe/ZnS（粒徑 12nm，綠色）、CdSe/ZnS（粒徑 5nm，黃色）CdSe/ZnS（粒徑 6nm，橙色）、CdSe/ZnS（粒徑 7nm，紅色）（蘇州星爍納米科技有限公司提供）

2）量子點的活化：

取1mLPBS緩沖溶液，加入量子點ZnSe/ZnS 100μL，加入EDC20μL，加入NHS20μL，渦旋，放于避光處活化30min；

3）量子點與BSA全抗原的偶聯:

加入20μLBSA全抗原，30℃，10rpm搖床避光偶聯2h；

4）封閉：

加入50μL10%BSA封閉30min；

5）終洗：

15000rpm 離心30min，收集沉淀，向沉淀中加入500μL PBS緩沖溶液后重懸回收，4℃避光備用。

實施例3基底的包被與檢測

1)八孔板處理:

在紫外燈下，用254nm波長的紫外光照射八孔板1h；

2)包被:

三聚氰胺單抗包被于八孔板的微孔中，用0.01 M，pH7.4 PBS 緩沖液將三聚氰胺單抗稀釋為10μg/mL，每孔加入200μL，4°C包被過夜；

3) 純化:

由于量子點-BSA全抗原的粒徑要比游離的量子點大很多，所以截留分子質量為100000的超濾膜可以使游離的量子點通過，而截留下ZnSe/ZnS -三聚氰胺-BSA全抗原的量子點，加入100μL PBS緩沖溶液后重懸回收，4℃避光備用；

4)封閉：

加入200 μL 5%BSA封閉微孔中未被包被的位點，防止非特異性吸附，37°C孵育2h后取出；PBS洗滌除去多余的BSA溶液，洗滌3次，每次3分鐘，甩干，4℃保存。

實施例4 應用熒光強度檢測儀檢測三聚氰胺

1)應用熒光強度檢測儀檢測三聚氰胺的方法

加入100μL待測液到采用實施例3中的方法制備的三聚氰胺單抗基底上，37°C下孵育2h，每孔加入200μL由實施例2提供的方法制備的濃度為200ng/mL的ZnSe/ZnS-三聚氰胺-BSA全抗原偶聯量子點，經PBS洗滌離心3次，去除未與基底結合的量子點-三聚氰胺-BSA全抗原后每個微孔中加入0.01M，pH7.4的PBS緩沖液200μL，在370nm激發波長下用熒光強度檢測儀檢測405nm時的發射峰強度。

2）檢測靈敏度的確定

采用上述檢測方法，分別在基底中加入濃度為0μg/L、0.1μg/L、0.2μg/L、0.3μg/L、0.4μg/L、0.5μg/L、0.6μg/L的三聚氰胺溶液及空白溶液，在370nm激發波長下用熒光強度檢測儀檢測405nm時的發射峰強度。測試結果如圖8所示，檢出限為0.1μg/L。

3）特異性試驗

根據實施例2和實施例3制備好ZnSe/ZnS -三聚氰胺-BSA全抗原和三聚氰胺單抗基底，將三聚氰胺、伏馬毒素B₁、T-2毒素、黃曲霉毒素B₁、赭曲霉毒素A、嘔吐毒素和玉米赤霉烯酮分別配成系列濃度采用上述的檢測方法進行特異性交叉試驗，同時空白對照。計算各競爭物的 IC50。計算公式為：交叉反應率 (％)＝[IC50(三聚氰胺)/IC50(待測藥物 )]×100。

測定及計算結果如表 1 所示，結果表明該方法異性較強，只對三聚氰胺發生反應，而對其他毒性化合物沒有交叉反應。

4）待測液的制備

用粉碎機粉碎待測谷物，粒度小于2mm。稱取5g試樣(精確到0.01 g)加入不同濃度的三聚氰胺水平的標準品，置于具塞塑料離心管中，加人PBS溶液25 mL，超聲振蕩15 min后4000 r/min離心10 min。取上層17. 5 mL PBS溶液于干凈的容器，通過微纖維濾紙過濾，將濾液收集于干凈的容器(提取液A)。向下層固體樣品中加人17. 5 mL甲醇，超聲振蕩15 min后4 000 r/min離心10 min，取上層溶液10 mL，用90 mL PBS溶液稀釋后通過微纖維濾紙過濾，將濾液收集于干凈的容器（提取液B）。

將免疫親和柱連接于10mL玻璃針筒下，準確移取50mL提取液B過免疫親和柱，以每秒1～2滴的流速全部通過親和柱，直至空氣流經親和柱；將20mLPBS溶液以每秒1～2滴的流速通過親和柱，直至空氣流經親和柱；準確移取5mLA以每秒1～2滴的流速全部通過親和柱，直至空氣流經親和柱；將20mL超純水以每秒1～2滴的流速淋洗柱子，直至空氣流經親和柱；棄去全部流出液。將1.5mL甲醇以每秒1滴的流速洗脫親和柱，將洗脫液收集于玻璃試管中，當甲醇大部分過柱后，不要完全過柱，停止加壓，靜止5min，再將1.5mL甲醇以每秒1滴的流速洗脫親和柱，將全部洗脫液收集于同一玻璃試管中，待測。

5）準確度和精密度的檢測

以重復測定某一濃度樣品的檢測結果變異系數（CV%）作為精密度評價指標。以回收率作為準確度評價指標。變異系數 CV% 計算公式為：CV% =SD/ X ×100% ；其中 SD 為標準偏差，X 為測定數據的平均值。回收率計算公式為：回收率（%）= 實際測定值/理論值×100%。其中理論值為模擬樣品的添加濃度。

采用上述待測液的制備方法，對玉米樣品進行三聚氰胺陽性添加，三聚氰胺分別添加0.1μg/kg、0.2μg/kg、0.5μg/kg三個濃度水平的樣品，每個添加水平做4個平行，選取PBSS作為空白對照1，再選取未添加的玉米樣品做空白對照2，利用實施例1中的熒光強度檢測儀，參照實施例4中1）的試驗步驟進行添加回收測定。樣品的平均回收率及精密度結果見表2。

實驗結果表明：平均回收率在90.6～91.5之間。變異系數均小于11%，說明方法精密度和準確度好，檢測效果好。

實施例5應用熒光強度檢測儀檢測伏馬毒素B₁

1)應用熒光強度檢測儀檢測伏馬毒素B1的方法

加入100μL待測液到采用實施例3中的方法制備的伏馬毒素B1單抗基底上，37°C下孵育2h，每孔加入200μL由實施例2提供的方法制備的濃度為200ng/mL的ZnSe/ZnS-伏馬毒素B1-BSA全抗原偶聯量子點，經PBS洗滌離心3次，去除未與基底結合的量子點-伏馬毒素B1-BSA全抗原后，每個微孔中加入0.01M，pH7.4的PBS緩沖液200μL，在370nm激發波長下用熒光強度檢測儀檢測450nm時的發射峰強度。

2）檢測靈敏度的確定

采用上述檢測方法，分別在基底中加入濃度為0μg/L、0.25μg/L、0.3μg/L、0.35μg/L、0.4μg/L、0.45μg/L、0.5μg/L的伏馬毒素B1溶液及空白溶液，在370nm激發波長下用熒光強度檢測儀檢測450nm時的發射峰強度。測試結果如圖9所示，檢出限為0.25μg/L。

3）交叉反應試驗

根據實施例2和實施例3制備好CdS/ZnS-伏馬毒素B₁-BSA全抗原和伏馬毒素B₁單抗基底，將三聚氰胺、伏馬毒素B₁、T-2毒素、黃曲霉毒素B₁、赭曲霉毒素A、嘔吐毒素和玉米赤霉烯酮分別配成系列濃度采用上述的檢測方法進行特異性交叉試驗，同時空白對照。計算各競爭物的 IC50。計算公式為：交叉反應率 (％) ＝ [IC50(伏馬毒素B1)/IC50(待測藥物 )]×100。

測定及計算結果如表3所示，結果表明該方法異性較強，只對伏馬毒素B₁發生反應，而對其他毒性化合物沒有交叉反應。

4）待測液的制備

用粉碎機粉碎待測谷物，粒度小于2mm。稱取5g試樣(精確到0.01 g)加入不同濃度的伏馬毒B₁水平的標準品，置于具塞塑料離心管中，加人PBS溶液25 mL，超聲振蕩15 min后4000 r/min離心10 min。取上層17. 5 mL PBS溶液于干凈的容器，通過微纖維濾紙過濾，將濾液收集于干凈的容器(提取液A)。向下層固體樣品中加人17. 5 mL甲醇，超聲振蕩15 min后4 000 r/min離心10 min，取上層溶液10 mL，用90 mL PBS溶液稀釋后通過微纖維濾紙過濾，將濾液收集于干凈的容器（提取液B）。

將免疫親和柱連接于I0mL玻璃針筒下，準確移取50mL提取液B過免疫親和柱，以每秒1～2滴的流速全部通過親和柱，直至空氣流經親和柱；將20mLPBS溶液以每秒1～2滴的流速通過親和柱，直至空氣流經親和柱；準確移取5mLA以每秒1～2滴的流速全部通過親和柱，直至空氣流經親和柱；將20mL超純水以每秒1～2滴的流速淋洗柱子，直至空氣流經親和柱；棄去全部流出液。將1.5mL甲醇以每秒1滴的流速洗脫親和柱，將洗脫液收集于玻璃試管中，當甲醇大部分過柱后，不要完全過柱，停止加壓，靜止5min，再將1.5mL甲醇以每秒1滴的流速洗脫親和柱，將全部洗脫液收集于同一玻璃試管中，待測。

5）準確度和精密度的檢測

以重復測定某一濃度樣品的檢測結果變異系數（CV%）作為精密度評價指標。以回收率作為準確度評價指標。變異系數 CV% 計算公式為：CV% =SD/ X ×100% ；其中 SD 為標準偏差，X 為測定數據的平均值。回收率計算公式為：回收率（%）= 實際測定值/理論值×100%。其中理論值為模擬樣品的添加濃度。

采用上述待測液的制備方法，對玉米樣品進行伏馬毒素B1陽性添加，伏馬毒素B1分別添加0.25μg/kg、0.35μg/kg、0.45μg/kg三個濃度水平的樣品，每個添加水平做4個平行，選取PBS作為空白對照1，再選取未添加的玉米樣品做空白對照2，利用實施例1中的熒光強度檢測儀，參照實施例5中1）的試驗步驟進行添加回收測定。樣品的平均回收率及精密度結果見表4。

實驗結果表明：平均回收率在87.7～90.5之間。變異系數均小于11%，說明方法精密度和準確度好，檢測效果好。

實施例6應用熒光強度檢測儀檢測T-2毒素

1)應用熒光強度檢測儀檢測T-2毒素的方法

加入100μL待測液到采用實施例3中的方法制備的T-2毒素單抗基底上，37°C下孵育2h，每孔加入加入200μL濃度為200ng/mL的ZnSe/ZnS-T-2毒素-BSA全抗原偶聯量子點，經PBS洗滌離心3次，去除未與基底結合的量子點-T-2毒素-BSA全抗原后每個微孔中加入0.01M，pH7.4的PBS緩沖液200μL，在370nm激發波長下用熒光強度檢測儀檢測500nm時的發射峰強度。

2）檢測靈敏度的確定

采用上述檢測方法，分別在基底中加入濃度為0μg/L、0.25μg/L、0.3μg/L、0.35μg/L、0.4μg/L、0.45μg/L、0.5μg/L的T-2毒素溶液及空白溶液，在370nm激發波長下用熒光強度檢測儀檢測500nm時的發射峰強度。測試結果如圖10所示，檢出限為0.25μg/L。

3）交叉反應試驗

根據實施例2和實施例3制備CdSe/ZnS-T-2毒素-BSA全抗原和-T-2毒素單抗基底，將三聚氰胺、伏馬毒素B₁、T-2毒素、黃曲霉毒素B₁、赭曲霉毒素A、嘔吐毒素和玉米赤霉烯酮分別配成系列濃度采用上述的檢測方法進行特異性交叉試驗，同時空白對照。計算各競爭物的 IC50。計算公式為：交叉反應率 (％) ＝ [IC50(T-2毒素)/IC50( 待測藥物 )]×100。

測定及計算結果如表5所示，結果表明該方法異性較強，只對T-2毒素發生反應，而對其他毒性化合物沒有交叉反應。

4）待測液的制備

用粉碎機粉碎待測谷物，粒度小于2mm。稱取5g試樣(精確到0.01 g)加入不同濃度的三聚氰胺水平的標準品，置于具塞塑料離心管中，加人PBS溶液25 mL，超聲振蕩15 min后4000 r/min離心10 min。取上層17. 5 mL PBS溶液于干凈的容器，通過微纖維濾紙過濾，將濾液收集于干凈的容器(提取液A)。向下層固體樣品中加人17. 5 mL甲醇，超聲振蕩15 min后4 000 r/min離心10 min，取上層溶液10 mL，用90 mL PBS溶液稀釋后通過微纖維濾紙過濾，將濾液收集于干凈的容器（提取液B）。

將免疫親和柱連接于10mL玻璃針筒下，準確移取50mL提取液B過免疫親和柱，以每秒1～2滴的流速全部通過親和柱，直至空氣流經親和柱；將20mLPBS溶液以每秒1～2滴的流速通過親和柱，直至空氣流經親和柱；準確移取5mLA以每秒1～2滴的流速全部通過親和柱，直至空氣流經親和柱；將20mL超純水以每秒1～2滴的流速淋洗柱子，直至空氣流經親和柱；棄去全部流出液。將1.5mL甲醇以每秒1滴的流速洗脫親和柱，將洗脫液收集于玻璃試管中，當甲醇大部分過柱后，不要完全過柱，停止加壓，靜止5min，再將1.5mL甲醇以每秒1滴的流速洗脫親和柱，將全部洗脫液收集于同一玻璃試管中，待測。

5）準確度和精密度的檢測

以重復測定某一濃度樣品的檢測結果變異系數（CV%）作為精密度評價指標。以回收率作為準確度評價指標。變異系數 CV% 計算公式為：CV% =SD/ X ×100% ；其中 SD 為標準偏差，X 為測定數據的平均值。回收率計算公式為：回收率（%）= 實際測定值/理論值×100%。其中理論值為模擬樣品的添加濃度。

采用上述待測液的制備方法，對玉米樣品進行T-2毒素陽性添加，T-2毒素分別添加0.25μg/kg、0.35μg/kg、0.45μg/kg三個濃度水平的樣品，每個添加水平做4個平行，選取PBS作為空白對照1，再選取未添加的玉米樣品做空白對照2，利用實施例1中的熒光強度檢測儀，參照實施例6中1）的試驗步驟進行添加回收測定。樣品的平均回收率及精密度結果見表6。

實驗結果表明：平均回收率在88.2～89.6之間。變異系數均小于11%，說明方法精密度和準確度好，檢測效果好。

實施例7應用熒光強度檢測儀檢測黃曲霉毒素B₁

1)應用熒光強度檢測儀檢測黃曲霉毒素B₁的方法

加入100μL待測液到采用實施例3中的方法制備的黃曲霉毒素B₁單抗基底上，37°C下孵育2h，每孔加入200μL由實施例2提供的方法制備的濃度為200ng/mL的ZnSe/ZnS-黃曲霉毒素B1-BSA全抗原偶聯量子點，經PBS洗滌離心3次，去除未與基底結合的量子點-黃曲霉毒素B1-BSA全抗原后每個微孔中加入0.01M，pH7.4的PBS緩沖液200μL，在370nm激發波長下用熒光強度檢測儀檢測520nm時的發射峰強度。

2）檢測靈敏度的確定

采用上述檢測方法，分別在基底中加入濃度為0μg/L、0.3μg/L、0.35μg/L、0.4μg/L、0.45μg/L、0.5μg/L、0.55μg/L的黃曲霉毒素B₁溶液及空白溶液，在370nm激發波長下用熒光強度檢測儀檢測520nm時的發射峰強度。測試結果如圖11所示，檢出限為0.3μg/L。

3）交叉反應試驗

根據實施例2和實施例3的方法制備好CdSe/ZnS-黃曲霉毒素B₁-BSA全抗原和-黃曲霉毒素B1單抗基底，將三聚氰胺、伏馬毒素B₁、T-2毒素、黃曲霉毒素B₁、赭曲霉毒素A、嘔吐毒素和玉米赤霉烯酮分別配成系列濃度采用上述的檢測方法進行特異性交叉試驗，同時空白對照。計算各競爭物的 IC50。計算公式為：交叉反應率 (％) ＝ [IC50(黃曲霉毒素B1)/IC50( 待測藥物 )]×100。

測定及計算結果如表7所示，結果表明該方法異性較強，只對黃曲霉毒素B₁發生反應，而對其他毒性化合物沒有交叉反應。

4）待測液的制備

用粉碎機粉碎待測谷物，粒度小于2mm。稱取5g試樣(精確到0.01 g)加入不同濃度的三聚氰胺水平的標準品，置于具塞塑料離心管中，加人PBS溶液25 mL，超聲振蕩15 min后4000 r/min離心10 min。取上層17. 5 mL PBS溶液于干凈的容器，通過微纖維濾紙過濾，將濾液收集于干凈的容器(提取液A)。向下層固體樣品中加人17. 5 mL甲醇，超聲振蕩15 min后4 000 r/min離心10 min，取上層溶液10 mL，用90 mL PBS溶液稀釋后通過微纖維濾紙過濾，將濾液收集于干凈的容器（提取液B）。

將免疫親和柱連接于10mL玻璃針筒下，準確移取50mL提取液B過免疫親和柱，以每秒1～2滴的流速全部通過親和柱，直至空氣流經親和柱；將20mLPBS溶液以每秒1～2滴的流速通過親和柱，直至空氣流經親和柱；準確移取5mLA以每秒1～2滴的流速全部通過親和柱，直至空氣流經親和柱；將20mL超純水以每秒1～2滴的流速淋洗柱子，直至空氣流經親和柱；棄去全部流出液。將1.5mL甲醇以每秒1滴的流速洗脫親和柱，將洗脫液收集于玻璃試管中，當甲醇大部分過柱后，不要完全過柱，停止加壓，靜止5min，再將1.5mL甲醇以每秒1滴的流速洗脫親和柱，將全部洗脫液收集于同一玻璃試管中，待測。

5）準確度和精密度的檢測

以重復測定某一濃度樣品的檢測結果變異系數（CV%）作為精密度評價指標。以回收率作為準確度評價指標。變異系數 CV% 計算公式為：CV% =SD/ X ×100% ；其中 SD 為標準偏差，X 為測定數據的平均值。回收率計算公式為：回收率（%）= 實際測定值/理論值×100%。其中理論值為模擬樣品的添加濃度。

采用上述待測液的制備方法，對玉米樣品進行黃曲霉毒素B₁陽性添加，黃曲霉毒素B₁分別添加0.30μg/kg、0.40μg/kg、0.50μg/kg三個濃度水平的樣品，每個添加水平做4個平行，選取PBS作為空白對照1，再選取未添加的玉米樣品做空白對照2，利用實施例1中的熒光強度檢測儀，參照實施例7中1）的試驗步驟進行添加回收測定。樣品的平均回收率及精密度結果見表8。

實驗結果表明：平均回收率在91.2～94.7之間。變異系數均小于9%，說明方法精密度和準確度好，檢測效果好。

實施例8應用熒光強度檢測儀檢測赭曲霉毒素A

1)應用熒光強度檢測儀檢測赭曲霉毒素A的方法

加入100μL待測液到采用實施例3中的方法制備的赭曲霉毒素A單抗基底上，37°C下孵育2h，每孔加入200μL由實施例2提供的方法制備的濃度為200ng/mL的ZnSe/ZnS-赭曲霉毒素A-BSA全抗原偶聯量子點，經PBS洗滌離心3次，去除未與基底結合的量子點-赭曲霉毒素A-BSA全抗原后每個微孔中加入0.01M，pH7.4的PBS緩沖液200μL，在370nm激發波長下用熒光強度檢測儀檢測550nm時的發射峰強度。

2）檢測靈敏度的確定

采用上述檢測方法，分別在基底中加入濃度為0μg/L、0.2μg/L、0.25μg/L、0.3μg/L、0.35μg/L、0.4μg/L、0.45μg/L的赭曲霉毒素A溶液及空白溶液，在370nm激發波長下用熒光強度檢測儀檢測550nm時的發射峰強度。測試結果如圖12所示，檢出限為 0.2μg/L。

3）交叉反應試驗

根據實施例2和實施例3制備好CdSe/ZnS-赭曲霉毒素A-BSA全抗原和-赭曲霉毒素A單抗基底，將三聚氰胺、伏馬毒素B₁、T-2毒素、黃曲霉毒素B₁、赭曲霉毒素A、嘔吐毒素和玉米赤霉烯酮分別配成系列濃度采用上述的檢測方法進行特異性交叉試驗，同時空白對照。計算各競爭物的 IC50。計算公式為：交叉反應率 (％) ＝ [IC50(赭曲霉毒素A)/IC50( 待測藥物 )]×100。

測定及計算結果如表9所示，結果表明該方法異性較強，只對赭曲霉毒素A發生反應，而對其他毒性化合物沒有交叉反應。

4）待測液的制備

用粉碎機粉碎待測谷物，粒度小于2mm。稱取5g試樣(精確到0.01 g)加入不同濃度的三聚氰胺水平的標準品，置于具塞塑料離心管中，加人PBS溶液25 mL，超聲振蕩15 min后4000 r/min離心10 min。取上層17. 5 mL PBS溶液于干凈的容器，通過微纖維濾紙過濾，將濾液收集于干凈的容器(提取液A)。向下層固體樣品中加人17. 5 mL甲醇，超聲振蕩15 min后4 000 r/min離心10 min，取上層溶液10 mL，用90 mL PBS溶液稀釋后通過微纖維濾紙過濾，將濾液收集于干凈的容器（提取液B）。

將免疫親和柱連接于10mL玻璃針筒下，準確移取50mL提取液B過免疫親和柱，以每秒1～2滴的流速全部通過親和柱，直至空氣流經親和柱；將20mLPBS溶液以每秒1～2滴的流速通過親和柱，直至空氣流經親和柱；準確移取5mLA以每秒1～2滴的流速全部通過親和柱，直至空氣流經親和柱；將20mL超純水以每秒1～2滴的流速淋洗柱子，直至空氣流經親和柱；棄去全部流出液。將1.5mL甲醇以每秒1滴的流速洗脫親和柱，將洗脫液收集于玻璃試管中，當甲醇大部分過柱后，不要完全過柱，停止加壓，靜止5min，再將1.5mL甲醇以每秒1滴的流速洗脫親和柱，將全部洗脫液收集于同一玻璃試管中，待測。

5）準確度和精密度的檢測

以重復測定某一濃度樣品的檢測結果變異系數（CV%）作為精密度評價指標。以回收率作為準確度評價指標。變異系數 CV% 計算公式為：CV% =SD/ X ×100% ；其中 SD 為標準偏差，X 為測定數據的平均值。回收率計算公式為：回收率（%）= 實際測定值/理論值×100%。其中理論值為模擬樣品的添加濃度。

采用上述待測液的制備方法，對玉米樣品進行赭曲霉毒素A陽性添加，赭曲霉毒素A分別添加0.20μg/kg、0.30μg/kg、0.40μg/kg三個濃度水平的樣品，每個添加水平做4個平行，選取PBSS作為空白對照1，再選取未添加的玉米樣品做空白對照2，利用實施例1中的熒光強度檢測儀，參照實施例8中1）的試驗步驟進行添加回收測定。樣品的平均回收率及精密度結果見表10。

實驗結果表明：平均回收率在83.3～89.3之間。變異系數均小于10%，說明方法精密度和準確度好，檢測效果好。

實施例9 應用熒光強度檢測儀檢測嘔吐毒素

1)應用熒光強度檢測儀檢測嘔吐毒素的方法

加入100μL待測液到采用實施例3中的方法制備的嘔吐毒素單抗基底上，37°C下孵育2h，每孔加入200μL由實施例2提供的方法制備的濃度為200ng/mL的ZnSe/ZnS-嘔吐毒素-BSA全抗原偶聯量子點，經PBS洗滌離心3次，去除未與基底結合的量子點-嘔吐毒素-BSA全抗原后每個微孔中加入0.01M，pH7.4的PBS緩沖液200μL，在370nm激發波長下用熒光強度檢測儀檢測580nm時的發射峰強度。

2）檢測靈敏度的確定

采用上述檢測方法，分別在基底中加入濃度為0μg/L、0.35μg/L、0.4μg/L、0.45μg/L、0.5μg/L、0.55μg/L、0.6μg/L的嘔吐毒素溶液及空白溶液，在370nm激發波長下用熒光強度檢測儀檢測580nm時的發射峰強度。測試結果如圖13所示，檢出限為0.35μg/L。

3）交叉反應試驗

根據實施例2和實施例3制備好CdSe/ZnS-嘔吐毒素-BSA全抗原和嘔吐毒素單抗基底，將三聚氰胺、伏馬毒素B₁、T-2毒素、黃曲霉毒素B₁、赭曲霉毒素A、嘔吐毒素和玉米赤霉烯酮分別配成系列濃度采用上述的檢測方法進行特異性交叉試驗，同時空白對照。計算各競爭物的 IC50。計算公式為：交叉反應率 (％) ＝ [IC50(嘔吐毒素)/IC50( 待測藥物 )]×100。

測定及計算結果如表11所示，結果表明該方法異性較強，只對嘔吐毒素發生反應，而對其他毒性化合物沒有交叉反應。

4）待測液的制備

用粉碎機粉碎待測谷物，粒度小于2mm。稱取5g試樣(精確到0.01 g)加入不同濃度的三聚氰胺水平的標準品，置于具塞塑料離心管中，加人PBS溶液25 mL，超聲振蕩15 min后4000 r/min離心10 min。取上層17. 5 mL PBSS溶液于干凈的容器，通過微纖維濾紙過濾，將濾液收集于干凈的容器(提取液A)。向下層固體樣品中加人17. 5 mL甲醇，超聲振蕩15 min后4 000 r/min離心10 min，取上層溶液10 mL，用90 mL PBS溶液稀釋后通過微纖維濾紙過濾，將濾液收集于干凈的容器（提取液B）。

將免疫親和柱連接于10mL玻璃針筒下，準確移取50mL提取液B過免疫親和柱，以每秒1～2滴的流速全部通過親和柱，直至空氣流經親和柱；將20mLPBS溶液以每秒1～2滴的流速通過親和柱，直至空氣流經親和柱；準確移取5mLA以每秒1～2滴的流速全部通過親和柱，直至空氣流經親和柱；將20mL超純水以每秒1～2滴的流速淋洗柱子，直至空氣流經親和柱；棄去全部流出液。將1.5mL甲醇以每秒1滴的流速洗脫親和柱，將洗脫液收集于玻璃試管中，當甲醇大部分過柱后，不要完全過柱，停止加壓，靜止5min，再將1.5mL甲醇以每秒1滴的流速洗脫親和柱，將全部洗脫液收集于同一玻璃試管中，待測。

5）準確度和精密度的檢測

以重復測定某一濃度樣品的檢測結果變異系數（CV%）作為精密度評價指標。以回收率作為準確度評價指標。變異系數 CV% 計算公式為：CV% =SD/ X ×100% ；其中 SD 為標準偏差，X 為測定數據的平均值。回收率計算公式為：回收率（%）= 實際測定值/理論值×100%。其中理論值為模擬樣品的添加濃度。

采用上述待測液的制備方法，對玉米樣品進行嘔吐毒素陽性添加，嘔吐毒素分別添加0.35μg/kg、0.45μg/kg、0.55μg/kg三個濃度水平的樣品，每個添加水平做4個平行，選取PBS作為空白對照1，再選取未添加的玉米樣品做空白對照2，利用實施例1中的熒光強度檢測儀，參照實施例9中1）的試驗步驟進行添加回收測定。樣品的平均回收率及精密度結果見表12。

實驗結果表明：平均回收率在83.5～91.5之間。變異系數均小于10%，說明方法精密度和準確度好，檢測效果好。

實施例10 應用熒光強度檢測儀檢測玉米赤霉烯酮

1)應用熒光強度檢測儀檢測玉米赤霉烯酮的方法

加入100μL待測液到采用實施例3中的方法制備的玉米赤霉烯酮單抗基底上，37°C下孵育2h，每孔加入200μL由實施例2提供的方法制備的濃度為200ng/mL的ZnSe/ZnS-玉米赤霉烯酮-BSA全抗原偶聯量子點，經PBSST洗滌離心3次去除未與基底結合的量子點-玉米赤霉烯酮-BSA全抗原后，每個微孔中加入0.01M，pH7.4的PBS緩沖液200μL，在370nm激發波長下用熒光強度檢測儀檢測620nm時的發射峰強度。

2）檢測靈敏度的確定

采用上述檢測方法，分別在基底中加入濃度為0μg/L、0.35μg/L、0.4μg/L、0.45μg/L、0.5μg/L、0.55μg/L、0.6μg/L的玉米赤霉烯酮溶液及空白溶液，在370nm激發波長下用熒光強度檢測儀檢測620nm時的發射峰強度。測試結果如圖14所示，檢出限為0.35μg/L。

3）交叉反應試驗

根據實施例2和實施例3制備好CdSe/ZnS-玉米赤霉烯酮-BSA全抗原和玉米赤霉烯酮單抗基底，將三聚氰胺、伏馬毒素B₁、T-2毒素、黃曲霉毒素B₁、赭曲霉毒素A、嘔吐毒素和玉米赤霉烯酮分別配成系列濃度采用上述的檢測方法進行特異性交叉試驗，同時空白對照。計算各競爭物的 IC50。計算公式為：交叉反應率 (％) ＝ [IC50(玉米赤酮)/IC50( 待測藥物 )]×100。測定及計算結果如表13所示，結果表明該方法異性較強，只對玉米赤霉烯酮發生反應，而對其他毒性化合物沒有交叉反應。

4）待測液的制備

用粉碎機粉碎待測谷物，粒度小于2mm。稱取5g試樣(精確到0.01 g)加入不同濃度的三聚氰胺水平的標準品，置于具塞塑料離心管中，加人PBS溶液25 mL，超聲振蕩15 min后4000 r/min離心10 min。取上層17. 5 mL PBS溶液于干凈的容器，通過微纖維濾紙過濾，將濾液收集于干凈的容器(提取液A)。向下層固體樣品中加人17. 5 mL甲醇，超聲振蕩15 min后4 000 r/min離心10 min，取上層溶液10 mL，用90 mL PBS溶液稀釋后通過微纖維濾紙過濾，將濾液收集于干凈的容器（提取液B）。

將免疫親和柱連接于10mL玻璃針筒下，準確移取50mL提取液B過免疫親和柱，以每秒1～2滴的流速全部通過親和柱，直至空氣流經親和柱；將20mLPBS溶液以每秒1～2滴的流速通過親和柱，直至空氣流經親和柱；準確移取5mLA以每秒1～2滴的流速全部通過親和柱，直至空氣流經親和柱；將20mL超純水以每秒1～2滴的流速淋洗柱子，直至空氣流經親和柱；棄去全部流出液。將1.5mL甲醇以每秒1滴的流速洗脫親和柱，將洗脫液收集于玻璃試管中，當甲醇大部分過柱后，不要完全過柱，停止加壓，靜止5min，再將1.5mL甲醇以每秒1滴的流速洗脫親和柱，將全部洗脫液收集于同一玻璃試管中，待測。

5）準確度和精密度的檢測

以重復測定某一濃度樣品的檢測結果變異系數（CV%）作為精密度評價指標。以回收率作為準確度評價指標。變異系數 CV% 計算公式為：CV% =SD/ X ×100% ；其中 SD 為標準偏差，X 為測定數據的平均值。回收率計算公式為：回收率（%）= 實際測定值/理論值×100%。其中理論值為模擬樣品的添加濃度。

采用上述待測液的制備方法，對玉米樣品進行玉米赤霉烯酮陽性添加，玉米赤霉烯酮分別添加0.35μg/kg、0.45μg/kg、0.55μg/kg三個濃度水平的樣品，每個添加水平做4個平行，選取PBSS作為空白對照1，再選取未添加的玉米樣品做空白對照2，利用實施例1中的熒光強度檢測儀，參照實施例10中1）的試驗步驟進行添加回收測定。樣品的平均回收率及精密度結果見表14。

實驗結果表明：平均回收率在90.2～91.4之間。變異系數均小于10%，說明方法精密度和準確度好，檢測效果好。

實施例11玉米中添加七種有毒物質的平均回收率檢測

用粉碎機粉碎待測玉米，粒度小于2mm。稱取5g試樣(精確到0.01 g)一次加入0.1μg/kg的三聚氰胺標準品、0.3μg/kg伏馬毒素B₁標準品、0.3μg/kgT-2毒素標準品、0.4μg/kg黃曲霉毒素B₁標準品、0.4μg/kg赭曲霉毒素A標準品、0.4μg/kg嘔吐毒素標準品、04μg/kg玉米赤霉烯酮標準品，置于具塞塑料離心管中，加人PBS溶液25 mL，超聲振蕩15 min后4000 r/min離心10 min。取上層17. 5 mL PBS溶液于干凈的容器，通過微纖維濾紙過濾，將濾液收集于干凈的容器(提取液A)。向下層固體樣品中加人17. 5 mL甲醇，超聲振蕩15 min后4 000 r/min離心10 min，取上層溶液10 mL，用90 mL PBSS溶液稀釋后通過微纖維濾紙過濾，將濾液收集于干凈的容器（提取液B）。

將免疫親和柱連接于10mL玻璃針筒下，準確移取50mL提取液B過免疫親和柱，以每秒1～2滴的流速全部通過親和柱，直至空氣流經親和柱；將20mLPBS溶液以每秒1～2滴的流速通過親和柱，直至空氣流經親和柱；準確移取5mLA以每秒1～2滴的流速全部通過親和柱，直至空氣流經親和柱；將20mL超純水以每秒1～2滴的流速淋洗柱子，直至空氣流經親和柱；棄去全部流出液。將1.5mL甲醇以每秒1滴的流速洗脫親和柱，將洗脫液收集于玻璃試管中，當甲醇大部分過柱后，不要完全過柱，停止加壓，靜止5min，再將1.5mL甲醇以每秒1滴的流速洗脫親和柱，將全部洗脫液收集于同一玻璃試管中，待測。

采用實施例2和實施例3的方法，制備各有毒物質的多克隆抗體偶聯物、并在八孔板上制備各自單抗基底。選取未添加的玉米樣品做空白對照，利用實施例1中的熒光強度檢測儀，在370nm激發波長下用熒光強度檢測儀檢測相應的發射峰強度。經計算得到平均回收率如表15所示。從表15中可以看出7種有毒物質的平均回收率，均在實施例4～10檢測的平均回收率范圍內，因此，利用實施例1中的熒光強度檢測儀同時檢測7種有毒物質時，各檢測物彼此并不干擾，準確度好。

實施例12玉米中七種有毒物質的檢測

用粉碎機粉碎待測玉米，粒度小于2m。稱取5g試樣，參照實施例11的提取方法提取，將全部洗脫液收集于同一玻璃試管中，待測。

采用實施例2和實施例3的方法，制備各有毒物質的多克隆抗體偶聯物、并在八孔板上制備各自單抗基底。選取PBS緩沖液做空白對照，采用實施例1中的熒光強度檢測儀，在370nm激發波長下用熒光強度檢測儀檢測相應的發射峰強度。測定的玉米中有毒物質的含量如表16所示。