一種檢測(cè)三葉青葉中多種化學(xué)成分的RRLC?Q?TOF?MS方法與流程

本發(fā)明涉及藥材質(zhì)量檢測(cè)方法，具體涉及檢測(cè)三葉青葉中多種化學(xué)成分的RRLC-Q-TOF-MS方法。

背景技術(shù)：

三葉青是我國(guó)特有的珍稀藥用植物，為葡萄科崖爬藤屬植物三葉崖爬藤(Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg)，以塊根或者全草入藥，具有清熱解毒、祛風(fēng)化痰、活血止痛的功效，其主要活性成分為有機(jī)酸類(lèi)、黃酮類(lèi)及揮發(fā)油類(lèi)成分等。

已有報(bào)道針對(duì)三葉青的塊根進(jìn)行了質(zhì)量評(píng)價(jià)，但對(duì)于三葉青另外重要的藥用部位——葉的質(zhì)量評(píng)價(jià)研究較少，三葉青葉也廣泛用于多種國(guó)藥準(zhǔn)字中成藥和保健食品，如結(jié)石康膠囊、排石利膽膠囊、三葉青茶等。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)三葉青葉中多種化學(xué)成分的RRLC-Q-TOF-MS方法，包括以下步驟

a、對(duì)照品溶液的制備：

分別取新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異葒草苷、葒草苷、牡荊素鼠李糖苷、異牡荊苷、牡荊苷、葒草素鼠李糖苷對(duì)照品，加入甲醇，制備得到對(duì)照品溶液；

b、對(duì)照品溶液的檢測(cè)：

將對(duì)照品溶液注入快速液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)；

色譜條件如下：

色譜柱：C₁₈色譜柱；

流動(dòng)相：流動(dòng)相A：乙腈-0.1％甲酸，流動(dòng)相B為水；

梯度洗脫條件為：0～0.5min，5％A→5％A；0.5～1.5min，5％A→9％A；1.5～16min，9％A；16～17.5min，9％A→10％A；17.5～19min，10％A→30％A；19～22min，30％→70％A；

質(zhì)譜條件如下：

離子源：電噴霧離子源；

檢測(cè)方式：正離子模式；

c、供試品溶液的制備：

取待測(cè)三葉青葉樣品，加甲醇超聲或回流提取，過(guò)濾得供試品溶液；

d、供試品溶液的檢測(cè)：

取供試品溶液，注入快速液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，以步驟b相同的條件進(jìn)行檢測(cè)，即可同時(shí)定性或定量檢測(cè)出三葉青葉中的新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異葒草苷、葒草苷、牡荊素鼠李糖苷、異牡荊苷、牡荊苷和葒草素鼠李糖苷。

進(jìn)一步地，所述色譜柱的規(guī)格為2.1mm×100mm，1.6μm。

進(jìn)一步地，所述色譜柱為Waters CORTECS C₁₈色譜柱。

進(jìn)一步地，所述色譜條件中，流動(dòng)相的流速為0.25～0.4mL/min。

進(jìn)一步地，所述色譜條件中，柱溫為30～45℃。

進(jìn)一步地，所述色譜條件中，進(jìn)樣量為1～5μL。

進(jìn)一步地，所述質(zhì)譜條件中：毛細(xì)管電壓：3500V；噴霧器壓力：0.2Mpa；干燥氣體氮?dú)饬魉伲?.0L·min^-1，干燥氣體氮?dú)鉁囟龋?80℃，離子漏斗funnel 1：200.0Vpp,funnel2：200.0Vpp，六級(jí)桿射頻：100.0Vpp，四級(jí)桿離子能量:3.0eV，碰撞射頻：150.0Vpp，離子傳輸時(shí)間：80μs，前脈沖存儲(chǔ)時(shí)間：5μs，碰撞氣體：氬氣，碰撞能量：20～30eV。

進(jìn)一步地，所述所述步驟c的提取是超聲提取，超聲提取的溫度為50～80℃；超聲的時(shí)間15～45分鐘，優(yōu)選30分鐘。

進(jìn)一步地，所述步驟c中，所述甲醇為80％甲醇，其與待測(cè)三葉青葉樣品的體積重量比為250mL：1g。

進(jìn)一步地，所述三葉青葉為葡萄科崖爬藤屬植物三葉崖爬藤Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg的干燥葉。

本發(fā)明的方法，可以通過(guò)RRLC-Q-TOF-MS法快速定性鑒定或定量檢測(cè)三葉青葉中主要黃酮成分，為三葉青葉的開(kāi)發(fā)利用和質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。

以下通過(guò)實(shí)施例形式的具體實(shí)施方式，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。

附圖說(shuō)明

圖1為三葉青的RRLC-Q-TOF-MS總離子流圖。

圖2為各化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)。

圖3為不同色譜柱篩選的色譜圖，Waters ACQUITY UPLC BEH C18 1.7μm2.1x100mm(1)，Waters ACQUITY UPLC HSS T3C18 1.8μm 2.1x100mm(2)，Waters CORTECS C18 1.6μm 2.1x100mm(3)，Phenomenex Kinetex C18 1.7μm(4)。

圖4為不同流動(dòng)相篩選的色譜圖，乙腈-0.1％甲酸水(5)，甲醇-0.1％甲酸水(6)，乙腈-0.5％醋酸水(7)，甲醇-0.5％醋酸水(8)。

圖5為提取方法篩選的結(jié)果。

圖6為提取溶劑篩選的結(jié)果。

圖7為提取時(shí)間篩選的結(jié)果。

圖8為料液比篩選的結(jié)果。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

1儀器與試藥

1290型超高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司)；MicrOTOF飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(德國(guó)Bruker公司)；CPA225D型十萬(wàn)分之一分析天平(德國(guó)Sartorius公司)；KQ-500E臺(tái)式超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；DFY-500型500克搖擺式高速中藥粉碎機(jī)(溫嶺市林大機(jī)械有限公司)；甲醇、乙腈為色譜純(德國(guó)MERCK公司)；Milli-Q超純水(美國(guó)Millipore公司)；其余試劑均為分析純。

對(duì)照品牡荊苷(批號(hào)：111687-200602)購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；其他對(duì)照品新綠原酸(批號(hào)：SH906332)、隱綠原酸(批號(hào)：SH905997)、綠原酸(批號(hào)：SH327979)購(gòu)自北京賽百草科技有限公司；牡荊素鼠李糖苷、葒草苷、異葒草苷、異牡荊苷、葒草素鼠李糖苷對(duì)照品由參照文獻(xiàn)(林婧,紀(jì)明妹,黃澤豪,等.三葉青的化學(xué)成分及其體外抗腫瘤活性研究[J].中國(guó)藥學(xué)雜志,2015,50(8):658)的方法制備。三葉青葉樣品采自福建省10個(gè)不同地方，分別為順昌、閩侯、南安、光澤、霞浦、福安、泰寧、寧化、建陽(yáng)和仙游，經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物實(shí)驗(yàn)室范世明高級(jí)實(shí)驗(yàn)師及生藥教研室黃澤豪副教授鑒定為葡萄科植物三葉青Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg的干燥葉。樣本存放于福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院藥用植物標(biāo)本室。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件

Waters CORTECS C₁₈色譜柱(2.1mm×100mm,1.6μm)，流動(dòng)相乙腈(A)-(0.1％甲酸)水(B)，梯度洗脫(0～0.5min，5％A→5％A；0.5～1.5min，5％A→9％A，1.5～16min，9％A；16～17.5min，9％A→10％A；17.5～19min，10％A→30％A；19～22min，30％→70％A)，流速0.25mL·min^-1，柱溫45℃，進(jìn)樣量2μL。

2.2質(zhì)譜條件

飛行時(shí)間質(zhì)譜采用電噴霧正、負(fù)離子模式：毛細(xì)管電壓:4.5kV(-)和3.5kV(+)，毛細(xì)管電壓:4.5kV，噴霧器壓力：0.2Mpa，干燥氣體(N₂)流速：4.0L·min^-1，干燥氣體溫度：180℃，離子漏斗funnel 1：200.0Vpp,funnel 2：200.0Vpp，六級(jí)桿射頻(hexapole Rf)：100.0Vpp，四級(jí)桿離子能量:3.0eV，碰撞射頻(collision Rf)：150.0Vpp，離子傳輸時(shí)間：80μs，前脈沖存儲(chǔ)時(shí)間：5μs，碰撞氣體：氬氣，碰撞能量：20～30eV。質(zhì)譜測(cè)定數(shù)據(jù)采用全掃描模式采集，數(shù)據(jù)采集范圍m/z 50～1 000。

2.3對(duì)照品溶液的制備

取新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異葒草苷、葒草苷、牡荊素鼠李糖苷、異牡荊苷、牡荊苷、葒草素鼠李糖苷對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加入甲醇分別制備濃度為約0.2mg·mL^-1的單一對(duì)照品儲(chǔ)備液，稀釋到10μg·mL^-1供QTOF-MS定性比較用。

2.4供試品制備

取三葉青干燥葉粉碎，過(guò)60目篩，取100mg，精密稱(chēng)定，置具塞三角瓶中，精密加入80％甲醇25mL，密塞，稱(chēng)定重量，超聲處理(功率250W，頻率80kHz)30min，放冷，再稱(chēng)定重量，用80％甲醇補(bǔ)足減失重，搖勻，0.22μm濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.5三葉青葉中主要化學(xué)成分的鑒定

三葉青樣品在“2.1”色譜條件及“2.2”質(zhì)譜條件下分析得三葉青的RRLC-Q-TOF-MS總離子流圖，見(jiàn)圖1。

其化合物的鑒定方法：首先，根據(jù)總離子流色譜峰上所得到的精確化合物分子量信息，通過(guò)Compass DataAnalysis SmartFormula Manually軟件在5ppm的質(zhì)量偏差范圍內(nèi)計(jì)算其精確分子式，對(duì)各化合物進(jìn)行初步鑒定。其次，選擇合適分子離子峰進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離(CID)，通過(guò)二級(jí)質(zhì)譜的裂解，獲得化合物相應(yīng)的碎片離子，根據(jù)離子的裂解情況并結(jié)合質(zhì)譜相關(guān)文獻(xiàn)比對(duì)推測(cè)，共鑒定三葉青葉中11種成分，其中1，2和3，4與5，6與7，8與9，10與11均互為同分異構(gòu)體(見(jiàn)圖2)，不僅一級(jí)質(zhì)譜相似(分子式相同)，二級(jí)質(zhì)譜裂解碎片也較相似，為此為了進(jìn)一步確認(rèn)鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性，通過(guò)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行進(jìn)一步的比對(duì)確認(rèn)，最終通過(guò)與標(biāo)品的色譜保留時(shí)間、一級(jí)質(zhì)譜和二級(jí)質(zhì)譜的比對(duì)確認(rèn)了三葉青主要的黃酮成分均為C-苷骨架型黃酮：8個(gè)黃酮由四對(duì)同分異構(gòu)體構(gòu)成，在負(fù)離子模式下的響應(yīng)優(yōu)于正離子模式，其中，6個(gè)黃酮成分異葒草苷(4)、葒草苷(5)、葒草素鼠李糖苷(7)、異牡荊苷(9)、牡荊苷(8)、牡荊素鼠李糖苷(10)經(jīng)標(biāo)品比對(duì)確認(rèn)，而化合物6與葒草素鼠李糖苷質(zhì)譜一級(jí)質(zhì)譜和二級(jí)質(zhì)譜均相似，因此推斷為異葒草素鼠李糖苷，同樣化合物11與牡荊素鼠李糖苷的一級(jí)質(zhì)譜和二級(jí)質(zhì)譜均相似，因此推斷為異牡荊素鼠李糖苷，另外1，2和3經(jīng)標(biāo)品比對(duì)鑒定為新綠原酸、綠原酸和隱綠原酸，鑒定結(jié)果見(jiàn)表1。

表1三葉青各化學(xué)成分的鑒定分析結(jié)果

并且，從圖1可以看出，正離子模式的效果優(yōu)于負(fù)離子模式。

實(shí)施例2本發(fā)明的工藝篩選

1、色譜條件的篩選

(1)色譜柱的篩選

比較了不同色譜柱，Waters ACQUITY UPLC BEH C18 1.7μm 2.1x100mm(1),Waters ACQUITY UPLC HSS T3C18 1.8μm 2.1x100mm(2),Waters CORTECS C18 1.6μm2.1x100mm(3),Phenomenex Kinetex C18 1.7μm(4)。其他色譜條件如下：

流動(dòng)相：乙腈(A)-0.1％甲酸(B)梯度洗脫，0-0.5min，5A ％-5％A；0.5-1.5min,5％A-9％A；1.5-8.5min,9％A-12％A；8.5-10min,12％A-20％A；10-13min 20％A-70％A。

結(jié)果如圖3所示，Waters CORTECS C18 1.6μm 2.1x100mm峰容量多，分離度較好，優(yōu)選Waters CORTECS C18 1.6μm 2.1x100mm色譜柱。

(2)流動(dòng)相的篩選

比較了4種流動(dòng)相系統(tǒng)：乙腈-0.1％甲酸水(5)，甲醇-0.1％甲酸水(6)，乙腈-0.5％醋酸水(7)，甲醇-0.5％醋酸水(8)。相對(duì)應(yīng)的梯度洗脫程序如下：

0～0.5min，5％A→5％A；0.5～1.5min，5％A→9％A，1.5～16min，9％A；16～17.5min，9％A→10％A；17.5～19min，10％A→30％A；19～22min，30％→70％A(5)。

0～0.5min，7％A→7％A；0.5～1.5min，7％A→11％A，1.5～16min，11％A；16～17.5min，11％A→12％A；17.5～19min，12％A→35％A；19～22min，35％→80％A(6)。

0～0.5min，5％A→5％A；0.5～1.5min，5％A→9％A，1.5～16min，9％A；16～17.5min，9％A→10％A；17.5～19min，10％A→30％A；19～22min，30％→70％A(7)。

0～0.5min，7％A→7％A；0.5～1.5min，7％A→11％A，1.5～16min，11％A；16～17.5min，11％A→12％A；17.5～19min，12％A→35％A；19～22min，35％→80％A(8)。

結(jié)果如圖4所示，使用乙腈-0.1％甲酸峰容量最佳，色譜分離度較好，優(yōu)于其他體系。

2、供試品制備方法的篩選

(1)提取方法的篩選

考察了超聲、回流、索氏、溫浸提取四種提取方法對(duì)11種酚類(lèi)成分的影響，結(jié)果表明超聲和回流提取效果較佳，由于超聲提取制備樣品方便，因此選擇超聲提取。結(jié)果如下表2和圖5所示。

表2

(2)提取溶劑的篩選

考察不同提取溶劑(40％，60％，80％，100％甲醇)對(duì)三葉青提取率的影響，表明80％甲醇最佳。結(jié)果如下表3和圖6所示。

表3

(3)超聲提取時(shí)間的篩選

考察不同超聲提取時(shí)間(15，30，45，60min)，結(jié)果表明30、45min最佳，綜合來(lái)看，優(yōu)選30min。結(jié)果如下表4和圖7所示。

表4

(4)提取料液比的篩選

考察了不同提取料液比(1:50，1:100，1:250，1:500)，結(jié)果表明1:250，1:500較佳，因此選擇1:250作為提取料液比。結(jié)果如下表5和圖8所示。

表5

綜上所述，本發(fā)明的方法，可以通過(guò)RRLC-Q-TOF-MS法快速定性鑒定或定量檢測(cè)三葉青葉中主要黃酮成分，為三葉青葉的開(kāi)發(fā)利用和質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。