本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及運(yùn)用高效液相色譜串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜快速測(cè)定盾葉薯蕷中薯蕷皂苷含量的方法。
背景技術(shù)：
盾葉薯蕷俗稱(chēng)黃姜、火頭根，為薯蕷科（Dioscoreaceae）薯蕷屬（Dioscorea）植物盾葉薯蕷Dioscorea zingiberensis C. H. Wright的根狀莖橫生，近圓柱形。以根狀莖入藥，甘、苦、平。解毒消腫，用于癰癤早期未破潰，皮膚急性化膿性感染，軟組織損傷，蜂螫蟲(chóng)咬。盾葉薯蕷根莖富含皂苷類(lèi)成分，因其組分復(fù)雜，且分離過(guò)程難度較大，難以定量，目前只能以總皂苷經(jīng)酸水解，得到薯蕷皂苷元的含量為測(cè)定指標(biāo)來(lái)控制盾葉薯蕷的質(zhì)量。近代藥理學(xué)研究表明，盾葉薯蕷總皂苷中，薯蕷皂苷（Dioscin）有抗腫瘤、抗血栓形成、抗過(guò)敏、抗病毒和抗休克作用。因此，盾葉薯蕷中薯蕷皂苷的含量影響其質(zhì)量和作用效果。目前，薯蕷皂苷的含量測(cè)定多為HPLC法，提取方法復(fù)雜，費(fèi)時(shí)，且其僅在近200nm處有較弱的紫外吸收，易產(chǎn)生干擾。對(duì)盾葉薯蕷中薯蕷皂苷定性及快速定量方法尚未見(jiàn)報(bào)道。
本發(fā)明采用MRM方法，解決了甾體皂苷類(lèi)化合物沒(méi)有共軛結(jié)構(gòu)，吸收波長(zhǎng)處于紫外末端吸收，以往HPLC檢測(cè)基線不穩(wěn)，靈敏度較低，不易測(cè)定的問(wèn)題。同時(shí)，盾葉薯蕷根莖中化學(xué)成分復(fù)雜，且皂苷化學(xué)結(jié)構(gòu)比較相近，極性較大，HPLC法測(cè)定需采用長(zhǎng)時(shí)間的梯度洗脫程序。本方法對(duì)待測(cè)成分的分離要求不高，因此大大縮減了洗脫時(shí)間，簡(jiǎn)化了操作步驟，為盾葉薯蕷的成分分析、質(zhì)量評(píng)價(jià)提供指導(dǎo)意義和科學(xué)基礎(chǔ)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明建立了HPLC-QqQ-MS法，以甘草次酸為對(duì)照，采用多級(jí)反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）法，測(cè)定盾葉薯蕷中薯蕷皂苷的含量。它是采用SHIMADZU GL Inertsil ODS-3 C18（150 mm×4.6 m，5μm）色譜柱，流動(dòng)相：乙腈：水（70：30），等度洗脫：8min；進(jìn)樣量：10μL；柱溫：40℃；流速0.5mL/min；掃描方式為多級(jí)反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式，離子源為ESI(Turbo Spray)源，負(fù)離子化方式檢測(cè)，離子源電壓為5.5kV；加熱毛細(xì)管溫度為400℃；CAD為5；簾氣為10；Gas1為45；Gas2為45；去簇電壓為-114V。用于定量分析的離子反應(yīng)為m/z 867.5→721.3（薯蕷皂苷）、m/z 469.3→425.3（外標(biāo)甘草次酸）。結(jié)果：采用液質(zhì)聯(lián)用法測(cè)得, 薯蕷皂苷質(zhì)量濃度在44～220μg·mL-1內(nèi)，線性關(guān)系良好，R2=0.9991，平均加樣回收率為107.1%。結(jié)論: 所建立方法快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，可用于盾葉薯蕷提取物質(zhì)量控制。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明公開(kāi)了如下的技術(shù)內(nèi)容：
一種測(cè)定盾葉薯蕷中薯蕷皂苷含量的方法，其特征在于采用高效液相色譜串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜法，快速測(cè)定盾葉薯蕷中薯蕷皂苷的含量，按如下步驟進(jìn)行：
（1）對(duì)照品、內(nèi)標(biāo)溶液制備：稱(chēng)取薯蕷皂苷對(duì)照品及甘草次酸對(duì)照品各5.0mg分別置于5mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，配制成濃度為1mg/mL的儲(chǔ)備液，4℃保存?zhèn)溆茫?/p>
（2）供試品溶液制備： 取盾葉薯蕷干燥根莖粉末1g精密稱(chēng)定。加入甲醇25mL, 超聲波處理30min后離心。上清液過(guò)微孔濾膜, 濾液即HPLC-QqQ-MS法測(cè)定用的供試溶液；
（3）測(cè)定：
分別精密吸取步驟（1）得到的對(duì)照品溶液各10μL，步驟（2）提取的供試品溶液10μL，注入HPLC-MS/MS用儀，測(cè)定。多級(jí)反應(yīng)檢測(cè)模式進(jìn)行掃描，鎖定薯蕷皂苷結(jié)構(gòu)，用外標(biāo)兩點(diǎn)法對(duì)數(shù)方程計(jì)算薯蕷皂苷含量。色譜及質(zhì)譜條件 色譜柱：SHIMADZU GL Inertsil ODS-3 C18柱。流動(dòng)相：乙腈：水（70：30），等度洗脫：8min。進(jìn)樣量：10μL；柱溫：40℃；流速0.5mL/min。掃描方式為多級(jí)反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式，離子源為ESI（Turbo Spray）源，負(fù)離子化方式檢測(cè)，離子源電壓為5.5kV；加熱毛細(xì)管溫度為400℃；CAD為5；簾氣為10；Gas1為45；Gas2為45；去簇電壓為-114V。
本發(fā)明中，更加詳細(xì)的制備方法及測(cè)定方法如下：
1.儀器與試藥
1.1儀器LC-20AD液相色譜系統(tǒng)，配備SIL-20AC自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)和CTO-20A柱溫箱（日本島津公司）；API 4000 三重四級(jí)桿檢測(cè)器，操作軟件為Analyst 1.5.1（美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)有限公司）；AL104-1C萬(wàn)分之一電子天平(瑞士Mettler Tolido公司)；AB 135-S十萬(wàn)分之一電子天平（瑞士Mettler Tolido公司）；KQ－100DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超市儀器有限公司）； Direct-Q3純水機(jī) (美國(guó)Millipore)。
1.2試藥 對(duì)照品薯蕷皂苷（批號(hào)：130519） 購(gòu)于四川省維克奇生物科技有限公司 純度>98% 對(duì)照品甘草次酸（批號(hào)：Z110723）購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司 純度>98%
乙腈、甲醇為（色譜純，TEDIA）超純水經(jīng)Milli-Q系統(tǒng)純化制備。
2.方法與結(jié)果
2.1色譜及質(zhì)譜條件 色譜柱：SHIMADZU GL Inertsil ODS-3 C18柱（日本島津公司產(chǎn)品，規(guī)格：150 mm×4.6 mm，柱內(nèi)徑：5μm）。流動(dòng)相：乙腈：水（70：30），等度洗脫：8min。進(jìn)樣量：10μL；柱溫：40℃；流速0.5mL/min。掃描方式為多級(jí)反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式，離子源為ESI(Turbo Spray)源，負(fù)離子化方式檢測(cè)，離子源電壓為5.5kV；加熱毛細(xì)管溫度為400℃；CAD為5；簾氣為10；Gas1為45；Gas2為45；去簇電壓為-114V。待測(cè)成分和外標(biāo)離子對(duì)質(zhì)量數(shù)及碰撞能量?jī)?yōu)化結(jié)果見(jiàn)表1。
表1薯蕷皂苷及外標(biāo)的MRM參數(shù)
2.2溶液的制備
2.2.1對(duì)照品溶液的制備：差量法精密稱(chēng)取薯蕷皂苷對(duì)照品及甘草次酸對(duì)照品各5.0mg分別置于5mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，配制成濃度為1mg/mL的儲(chǔ)備液，4℃保存?zhèn)溆茫?/p>
2.2.2供試品溶液的制備：取盾葉薯蕷干燥根莖粉末1g精密稱(chēng)定。加入甲醇25mL, 42kHz超聲波處理30min, 5000r·min-1離心5min。上清液過(guò)0.45μm微孔濾膜濾過(guò), 濾液即為HPLC-MS/MS法測(cè)定用的供試溶液；
2.3方法學(xué)考察
2.3.1線性范圍考察 精密吸取薯蕷皂苷對(duì)照品溶液，置10mL容量瓶中，用甲醇稀釋至各濃度（分別為44.0, 88.0, 110.0, 176.0, 220.0μg·mL-1)。精密吸取各個(gè)濃度10μL, 依次進(jìn)樣,以進(jìn)樣濃度(μg·mL-1)為橫坐標(biāo), 待測(cè)品色譜峰面積與外標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo), 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線, 薯蕷皂苷回歸方程見(jiàn)表2。
表2 薯蕷皂苷的線性考察
結(jié)果表明，薯蕷皂苷回歸方程線性關(guān)系良好，線性范圍為44～220μg·mL-1。
2.3.2定量限和檢測(cè)限的測(cè)定 取2.2.1項(xiàng)下薯蕷皂苷對(duì)照品溶液1 mL，逐級(jí)稀釋?zhuān)⒁来芜M(jìn)樣10 μL，以S/N=3求得各個(gè)組分的檢測(cè)限，以S/N=10求得各個(gè)組分的定量限，結(jié)果見(jiàn)見(jiàn)表2。
2.3.3 精密度試驗(yàn) 取2.2.2項(xiàng)下樣品，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積平均值，計(jì)算精密度RSD值。
2.3.4 重復(fù)性 稱(chēng)取盾葉薯蕷藥材粉末6份，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定峰面積，計(jì)算含量平均值及RSD值。
2.3.5穩(wěn)定性 取2.2.2項(xiàng)下制得的供試品溶液，置4℃冰箱存放。分別于0，6，12，18，24 h進(jìn)樣分析，測(cè)定峰面積，計(jì)算穩(wěn)定性RSD值。
2.3.6加樣回收率考察 精密稱(chēng)取盾葉薯蕷藥材粉末6份，加入對(duì)照品薯蕷皂苷7.5mg，按2.2.2項(xiàng)下方法制備溶液，進(jìn)樣分析，計(jì)算回收率為107.1%，RSD為1.3%。
4. 樣品測(cè)定 按1.2項(xiàng)下對(duì)樣品進(jìn)行含量測(cè)定，MRM質(zhì)譜圖見(jiàn)圖1。按外標(biāo)法計(jì)算薯蕷皂苷的含量，結(jié)果見(jiàn)表3。
表3 薯蕷皂苷含量測(cè)定
3. 討論
3.1皂苷類(lèi)成分極性偏大，因此本實(shí)驗(yàn)考察了甲醇－水、乙腈－水、甲醇－酸水和乙腈－酸水不同的溶劑系統(tǒng)，以及60%，70%，80%，90%四種比例等度洗脫及梯度洗脫。結(jié)果表明80%乙腈－水系統(tǒng)的分離效果較好，使得峰形良好，且出峰時(shí)間適中，相對(duì)于梯度洗脫更穩(wěn)定、簡(jiǎn)便。因此本實(shí)驗(yàn)選擇梯80%乙腈－水系統(tǒng)度洗脫方式。
3.2本實(shí)驗(yàn)采用MRM方法，解決了甾體皂苷類(lèi)化合物沒(méi)有共軛結(jié)構(gòu)，吸收波長(zhǎng)處于紫外末端吸收，以往HPLC檢測(cè)基線不穩(wěn)，靈敏度較低，不易測(cè)定的問(wèn)題。同時(shí)，盾葉薯蕷根莖中化學(xué)成分復(fù)雜，且皂苷化學(xué)結(jié)構(gòu)比較相近，極性較大，HPLC法測(cè)定需采用長(zhǎng)時(shí)間的梯度洗脫程序。本方法對(duì)待測(cè)成分的分離要求不高，因此大大縮減了洗脫時(shí)間，簡(jiǎn)化了操作步驟，為盾葉薯蕷的成分分析、質(zhì)量評(píng)價(jià)提供指導(dǎo)意義和科學(xué)基礎(chǔ)。
本發(fā)明公開(kāi)的測(cè)定盾葉薯蕷中薯蕷皂苷含量方法的優(yōu)點(diǎn)在于：
（1）經(jīng)摸索建立了薯蕷皂苷的高效液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜（HPLC-QqQ-MS）測(cè)定法。研究表明，選用此方法，解決了甾體皂苷類(lèi)化合物沒(méi)有共軛結(jié)構(gòu)，吸收波長(zhǎng)處于紫外末端吸收，以往HPLC檢測(cè)基線不穩(wěn)，靈敏度較低，不易測(cè)定的問(wèn)題。
（2）經(jīng)方法學(xué)考察證明，本方法操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，可用于盾葉薯蕷的成分分析及質(zhì)量評(píng)價(jià)。