本發明涉及口蹄疫疫苗檢測技術領域，具體涉及一種油佐劑疫苗的快速定性定量檢測方法。
背景技術：
現有的疫苗質量標準中規定效力檢驗必須采用本動物進行檢驗，由于國家實行100％的強化免疫政策，很難選出易感的檢驗用動物，而且動物攻毒對實驗設施要求高(BSL3級實驗室)、耗時長(一個月以上)、資金花費大。如果采用血清中和試驗選擇易感動物，在技術上難以排除具有細胞免疫的非易感動物，在檢驗實際中經常發生檢驗數據不規律的問題，影響檢驗的準確性。因此口蹄疫疫苗尤其是用于牛的疫苗的質量檢測一直困擾著獸藥監測部門和相關生產企業。因此需要盡快研制體外檢驗技術，代替現有的本動物試驗。
當前國家對疫苗的檢驗正逐步過渡到對疫苗內抗原的檢測，而當前較為普遍的方法為疫苗破乳后對抗原進行檢測，通過將疫苗進行破乳處理，使抗原轉移至水相中，繼而對其進行后續的檢測分析。眾所周知，疫苗是由抗原與佐劑以一定比例、按特定程序乳化而成的，然而佐劑卻為疫苗破乳檢測帶來了巨大障礙。
由于疫苗乳化過程中所使用的油佐劑中成分復雜，含有表面活性劑，免疫增強劑等物質存在，破乳后的水相中往往會含有上述雜質和破乳劑，行業內并沒有能夠去除上述雜質和破乳劑的方法，而雜質及破乳劑等還會大大影響其后的檢測過程，造成信號掩蓋或干擾，壓低了抗原信號的強度，甚至無法有效檢測到其中的抗原，由于其中雜質的隨機分配性，造成其檢測方法的重復性不佳，同時增加了儀器維護成本。在疫苗行業內，如何對油佐劑疫苗進行破乳并對疫苗內成分進行檢測和鑒定是業內公認的技術難點，由于油佐劑疫苗成分復雜，其中又含有大量的表面活性劑及免疫增強劑等物質，會對所有檢測方法造成干擾，甚至無法檢測，不能反映出疫苗內抗原的真實狀態。
雖然業內已有破乳方法，但其效率和效果均不佳，傳統的破乳方法破乳后會有種種問題，例如破乳不完全、水相和油相分界不清晰、水相中檢測不到抗原等問題一直困擾著業界。如何去尋找一種高效的破乳方法成了業內亟待解決的問題。
ZIPTIP方法為一種簡易的質譜前除鹽的方法，在分析檢測中用于鹽類物質的去除。現有技術中尚未有將該方法用于抗原純化的報道。
技術實現要素：
針對現有技術中的缺陷，本發明提供了一種油佐劑疫苗的快速定性定量檢測方法。
本發明的目的是通過以下技術方案實現的：
本發明提供了一種油佐劑疫苗的快速定性定量檢測方法，包括以下步驟：
將油佐劑疫苗破乳后，所得水相抗原樣品進行ZIPTIP純化，純化后的樣品進行定性定量檢測；
所述破乳的方法為：將油佐劑疫苗與正丁醇混合，然后加入競爭劑，振蕩混勻后，離心，即得水相抗原樣品。
優選地，所述競爭劑包括氨基酸及其衍生物中的至少一種。
優選地，所述競爭劑為賴氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、組氨酸和脯氨酸中的一種。
優選地，所述競爭劑的加入量為：每1ml油佐劑疫苗中加入1-40mg競爭劑，更優選1-20mg競爭劑。所述競爭劑的濃度過高，會導致競爭劑飽和析出，影響超濾過程；濃度過低，會導致競爭效果不佳，無法釋放足夠檢測的抗原。
優選地，所述油佐劑疫苗與正丁醇的體積比為9：1～5：5。
更優選地，所述油佐劑疫苗與正丁醇的體積比為1:1。油佐劑疫苗與正丁醇的體積相同，可更好的保證疫苗完全破乳。
優選地，所述ZIPTIP純化的具體步驟如下：
A1.使用50％ACN吸排活化ZIPTIP；
A2.吸取樣品吸排數次；
A3.使用0.05％TFA水吸排清洗ZIPTIP；
A4.使用含0.05％TFA的ACN洗脫樣品，即可。
優選地，所述純化后的樣品進行凍干或濃縮。
優選地，采用電泳后染色的方法進行抗原樣品的定量定性檢測。
采用本發明的破乳方法，由于抗原回收率高，得到的抗原樣品無需進一步純化，即可直接用于抗原的定量定性檢測。
現有技術相比，本發明具有如下的有益效果：
1)本發明通過加入競爭劑與表面活性劑競爭抗原結合位點，從而將油佐劑疫苗中的抗原釋放至水相中，與不加競爭劑相比，大大提高了水相中的抗原回收率。
2)本方法采用ZIPTIP純化方法，可有效去除抗原樣品中的雜質，通過特異性吸附抗原，除去復雜樣品中的表面活性劑等雜質，同時其洗脫后得到的樣品可以直接用于高精度儀器的分析檢測。
附圖說明
通過閱讀參照以下附圖對非限制性實施例所作的詳細描述，本發明的其它特征、目的和優點將會變得更明顯：
圖1為對比例1的方法破乳后水相中抗原濃度HPLC檢測圖譜。
具體實施方式
下面結合具體實施例對本發明進行詳細說明。以下實施例將有助于本領域的技術人員進一步理解本發明，但不以任何形式限制本發明。應當指出的是，對本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進。這些都屬于本發明的保護范圍。
實施例1
本實施例提供了一種油佐劑疫苗的快速定性定量檢測方法，采用以下步驟：
1)樣品破乳將按照如下方法破乳處理：
取10ml待檢疫苗(市售的豬口蹄疫合成肽疫苗，濃度為75ug/ml)與正丁醇以體積比1:1混合，加入50mg組氨酸，震蕩混勻，在4℃條件下，以3000r/min離心15分鐘，離心后用10ml注射器小心抽取下層水相，即得水相抗原樣品。
2)樣品的ZIPTIP純化
2.1將步驟1)制得的水相抗原樣品凍干或濃縮，使用ZIPTIP進行純化，其步驟如下：
1.使用50％ACN吸排活化ZIPTIP；
2.吸取樣品吸排數次；
3.使用0.05％TFA水吸排清洗ZIPTIP；
4.使用含0.05％TFA的ACN洗脫樣品。
3)定性定量檢測
將通過步驟2)純化后的樣品體積為破乳后水相的1/10(即0.5ml)，即濃度提高10倍，進行電泳后染色，分析其條帶，與其理論分子量進行對比，抗原條帶出現在理論分子量大小區域，可對其初步定性，由條帶灰度值可知其蛋白量約為10-15ug，上樣量為10ul樣品，其上樣樣品濃度為1-1.5mg/ml，折算其濃縮倍數(除以10)及破乳后體積變化(除以2)原始濃度為50-75ug/ml，與液相色譜測得濃度69.3ug/ml結果相符。
本實施例采用的市售的豬口蹄疫合成肽疫苗與理論抗原濃度標準進行對照，對其HPLC檢測圖譜樣品出峰位置進行積分，其積分信息如表1所示，樣品中抗原含量以積分峰面積的形式體現，其積分峰面積為2738690。對本實施例采用Butanol+His破乳后水相中抗原樣品濃度的HPLC檢測圖譜樣品出峰位置進行積分，其積分信息如表2所示，樣品中抗原含量以積分峰面積形式體現，其積分峰面積為2530549。對比表1和表2的結果可知，將兩者積分信息對比后，其抗原回收率為92.4％，即破乳效率為92.4％。
表1
表2
實施例2
本實施例提供了一種油佐劑疫苗的快速定性定量檢測方法，采用以下步驟：
1)樣品破乳將按照如下方法破乳處理：
取10ml待檢疫苗(市售的豬口蹄疫合成肽疫苗，濃度為75ug/ml)與正丁醇以體積比1:1混合，加入10mg苯丙氨酸，震蕩混勻，在4℃條件下，以3000r/min離心15分鐘，離心后用10ml注射器小心抽取下層水相，即得水相抗原樣品。
采用本實施例的方法對口蹄疫疫苗進行破乳，破乳效率為87.6％。
2)樣品的ZIPTIP純化
2.1將步驟1)制得的水相抗原樣品凍干或濃縮，使用ZIPTIP進行純化，其步驟如下：
1.使用50％ACN吸排活化ZIPTIP；
2.吸取樣品吸排數次；
3.使用0.05％TFA水吸排清洗ZIPTIP；
4.使用含0.05％TFA的ACN洗脫樣品。
3)定性定量檢測
將通過步驟2)純化后的樣品體積為破乳后水相的1/10(即0.5ml)，即濃度提高10倍，進行電泳后染色，分析其條帶，與其理論分子量進行對比，抗原條帶出現在理論分子量大小區域，可對其初步定性，由條帶灰度值可知其蛋白量約為10-15ug，上樣量為10ul樣品，其上樣樣品濃度為1-1.5mg/ml，折算其濃縮倍數(除以10)及破乳后體積變化(除以2)原始濃度為50-75ug/ml，與液相色譜測得濃度65.7ug/ml結果相符。
實施例3
本實施例提供了一種油佐劑疫苗的快速定性定量檢測方法，采用以下步驟：
1)樣品破乳將按照如下方法破乳處理：
取10ml待檢疫苗(市售的豬口蹄疫合成肽疫苗，濃度為75ug/ml)與正丁醇以體積比1:1混合，每管加入200mg脯氨酸，震蕩混勻，在4℃條件下，以3000r/min離心15分鐘，離心后用10ml注射器小心抽取下層水相，即得水相抗原樣品。
采用本實施例的方法對口蹄疫疫苗進行破乳，破乳效率為94.8％。
2)樣品的ZIPTIP純化
2.1將步驟1)制得的水相抗原樣品凍干或濃縮，使用ZIPTIP進行純化，其步驟如下：
1.使用50％ACN吸排活化ZIPTIP；
2.吸取樣品吸排數次；
3.使用0.05％TFA水吸排清洗ZIPTIP；
4.使用含0.05％TFA的ACN洗脫樣品。
3)定性定量檢測
將通過步驟2)純化后的樣品體積為破乳后水相的1/10(即0.5ml)，即濃度提高10倍，進行電泳后染色，分析其條帶，與其理論分子量進行對比，抗原條帶出現在理論分子量大小區域，可對其初步定性，由條帶灰度值可知其蛋白量約為10-15ug，上樣量為10ul樣品，其上樣樣品濃度為1-1.5mg/ml，折算其濃縮倍數(除以10)及破乳后體積變化(除以2)原始濃度為50-75ug/ml，與液相色譜測得濃度71.7ug/ml結果相符。
對比例1
本對比例提供了一種口蹄疫疫苗的破乳方法，與實施例1的方法基本相同，不同之處僅在于：本對比例中不加入競爭劑。
采用本對比例的方法對口蹄疫疫苗進行破乳，該對比例采用正丁醇破乳后水相中抗原濃度HPLC檢測圖譜如圖1所示，從該圖中可看出，在抗原理論保留時間(23-28min)內并未檢出抗原，說明樣品中含有的抗原量極低，即本對比例中的抗原回收率基本為零，其破乳效率基本為零，破乳效率為0％。進行ZIPTIP純化后，進行定性定量檢測，無法獲得目標蛋白條帶。
對比例與實施例的結果說明，合成肽疫苗使用傳統的正丁醇破乳方法并不能使得抗原分布于水相中，水相中能檢測到的抗原量極低，并不能滿足檢測要求，而加入競爭劑后破乳后水相中抗原量達到85％以上，足夠滿足后續純化檢測要求。
本發明具體應用途徑很多，以上所述僅是本發明的優選實施方式。應當指出，以上實施例僅用于說明本發明，而并不用于限制本發明的保護范圍。對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進，這些改進也應視為本發明的保護范圍。