本發(fā)明涉及一種檢測(cè)方法，具體是一種多種霉菌毒素同時(shí)檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
霉菌毒素是由產(chǎn)毒霉菌在適宜的環(huán)境條件下產(chǎn)生的有毒代謝產(chǎn)物，從古至今一直 對(duì)人類、動(dòng)物和植物具有巨大的潛在威脅。1960年，英國(guó)發(fā)生了10萬(wàn)多只火雞中毒死亡事件，研究發(fā)現(xiàn)，飼料中有從巴西進(jìn)口的霉變的花生餅粉，用這種花生餅粉喂養(yǎng)大白鼠能誘發(fā)肝癌，誘發(fā)肝癌的物質(zhì)被證實(shí)為黃曲霉的代謝產(chǎn)物，命名為黃曲霉毒素（Aflatoxins）。隨后引發(fā)了科技界對(duì)霉菌毒素廣泛、系統(tǒng)的研究。霉菌毒素目前已發(fā)現(xiàn)有200多種，對(duì)人類危害大的霉菌毒素有十幾種，一般由青霉屬、曲霉屬以及鐮刀菌屬的霉菌產(chǎn)生，具有毒性強(qiáng)和污染頻率高的特點(diǎn)，其中包括黃曲霉毒素、赭曲霉毒素A、雜色曲霉毒素、展青霉素、玉米赤霉烯酮、串珠鐮刀菌素、T-2毒素、HT-2毒素，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、二乙酸鑣草鐮刀菌烯醇等。
由于霉菌毒素的低濃度高危害性，目前全世界很多國(guó)家都對(duì)霉菌毒素規(guī)定了其在食品中的殘留限量。我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（GB2761-2011）規(guī)定了食品中黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素M1、赭曲霉毒素A、展青霉素、玉米赤霉烯酮、脫氧鐮刀雪腐菌烯醇等6類霉菌毒素的限量，限量范圍從0.5ug/kg到1000ug/kg不等。
目前常用的針對(duì)食品中霉菌毒素殘留量的檢測(cè)技術(shù)主要有酶聯(lián)免疫試劑盒（ELISA）、薄層色譜（TLC）、高效液相色譜法（HPLC）以及超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）等。酶聯(lián)免疫法原理是利用抗體與酶復(fù)合物結(jié)合，然后通過(guò)顯色來(lái)檢測(cè)；薄層色譜法是根據(jù)與適宜的對(duì)照物按同法所得的色譜圖的比移值（Rf）作對(duì)比，進(jìn)行含量測(cè)定的方法，這兩者均為半定量方法，多用于一種或少數(shù)幾種毒素的初步篩查；高效液相色譜法是采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動(dòng)相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分離后，進(jìn)入檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)試樣的分析，此法定量準(zhǔn)確，但對(duì)于同時(shí)檢測(cè)多組分的霉菌毒素，以及對(duì)樣品基質(zhì)凈化不完全時(shí)，目標(biāo)化合物在色譜柱上無(wú)法實(shí)現(xiàn)基線分離，無(wú)法對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行準(zhǔn)確定量。超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜是在色譜分離的基礎(chǔ)上，利用質(zhì)譜的高靈敏性和高選擇性對(duì)化合物進(jìn)行定性和定量檢測(cè)，結(jié)果更加準(zhǔn)確。
隨著儀器檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，前處理凈化技術(shù)也在不斷更新，目前受到廣泛研究的集中在免疫親和（Immunoaffinity）、固相萃取（SolidPhaseExtraction）以及分散固相萃?。≦uEChERS）方法。免疫親和層析技術(shù)是以抗原抗體中的一方作為配基親和吸附另一方的分離系統(tǒng)，用此技術(shù)對(duì)樣品進(jìn)行前處理，專一性強(qiáng)，樣品凈化程度高，但目前研制出的免疫親和抗體種類較少，除少數(shù)幾種化合物（黃曲霉毒素類）無(wú)法對(duì)多組分化合物同時(shí)進(jìn)行凈化，且成本高，目前有免疫親和抗體的毒素有黃曲霉毒素、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮、T-2毒素、HT-2毒素等少數(shù)幾種毒素；固相萃取技術(shù)是基于液-固相色譜理論，采用選擇性吸附、選擇性洗脫的方式對(duì)樣品進(jìn)行富集、分離、凈化，是一種包括液相和固相的物理萃取過(guò)程；也可以將其近似地看作一種簡(jiǎn)單的色譜過(guò)程，此技術(shù)選擇性吸附和凈化程度不如免疫親和技術(shù)，可用于一種或幾種結(jié)構(gòu)相似毒素的同時(shí)凈化，但無(wú)法對(duì)復(fù)雜基質(zhì)中多種毒素進(jìn)行同時(shí)進(jìn)行吸附和凈化，常用于食品中伏馬霉素、黃曲霉毒素B1以及赭曲霉素A檢測(cè)的前處理。分散固相萃取方法（QuEChERS）是由英文快速（Quick）、簡(jiǎn)便（Easy）、低廉（Cheap）、高效（Effective）、耐用（Rugged）以及安全（Safe）的首字母縮寫(xiě)，此技術(shù)由提取，鹽析、凈化、濃縮等及步驟組成，最先由美國(guó)科學(xué)家發(fā)明，用于多農(nóng)藥殘留的檢測(cè)，后擴(kuò)大應(yīng)用于獸藥殘留以及生物毒素檢測(cè)的前處理。該方法的優(yōu)點(diǎn)正如所組成的縮寫(xiě)詞一樣，靈活性強(qiáng)，可以進(jìn)行改進(jìn)后對(duì)不同結(jié)構(gòu)極性的多種毒素進(jìn)行同時(shí)提取和凈化。用現(xiàn)有技術(shù)方法無(wú)法全部檢測(cè)多種霉菌毒素，且目前尚未有同時(shí)檢測(cè)多種霉菌毒素的方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種多種霉菌毒素同時(shí)檢測(cè)方法，以解決上述背景技術(shù)中提出的問(wèn)題。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
一種多種霉菌毒素同時(shí)檢測(cè)方法，該方法包括以下步驟：（1）對(duì)樣品進(jìn)行提取，先后用含酸的不同濃度的乙腈-水溶液對(duì)樣品分三次進(jìn)行振蕩提取、離心，合并三次提取液，得樣品提取液；（2）對(duì)樣品提取液進(jìn)行鹽析、除脂，在所述樣品提取液中加入甲醇和0.2%氨水進(jìn)行鹽析，離心，在所得上清液中加入正己烷，旋渦振蕩，除脂；（3）對(duì)鹽析、除脂后的樣品進(jìn)行凈化、濃縮、復(fù)溶，將鹽析、除脂后的樣品離心，在所得的下層乙腈層加入100%甲醇旋渦振蕩進(jìn)行凈化，離心，對(duì)所得上清液進(jìn)行真空濃縮后，先用甲醇對(duì)殘?jiān)鼜?fù)溶，再用水對(duì)剩余的殘?jiān)鼜?fù)溶，合并兩次復(fù)溶所得的復(fù)溶液，進(jìn)行濾膜過(guò)濾，得樣品分析液；（4）采用質(zhì)譜儀對(duì)樣品分析液進(jìn)行定性定量檢測(cè)。
作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：在所述步驟（3）之前還能夠?qū)?duì)鹽析、除脂后的樣品過(guò)固相萃取柱HLB柱進(jìn)行純化、濃縮。
作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：將對(duì)鹽析、除脂后的樣品按照0.6-1.0mL/min的過(guò)柱速度過(guò)固相萃取柱HLB柱。
作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：所述不同濃度的乙腈-水溶液為體積比為70-90：30-10的乙腈-水溶液、體積比為10-40：90-60的乙腈-水溶液和體積比為20-60：80-60的乙腈-水溶液。
作為本發(fā)明再進(jìn)一步的方案：所述步驟（2）中的鹽析、除脂包括：在所述樣品提取液中加入硫酸鎂、氨水、檸檬酸鈉、檸檬酸氫二鈉進(jìn)行鹽析，離心，在所得上清液中加入正己烷，旋渦振蕩，除脂。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明能同時(shí)檢測(cè)多種霉菌毒素，完善了食品的安全監(jiān)控的手段，避免消費(fèi)者的健康受到損害。
具體實(shí)施方式
下面對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述。
本發(fā)明實(shí)施例中，一種多種霉菌毒素同時(shí)檢測(cè)方法，該方法包括以下步驟：（1）對(duì)樣品進(jìn)行提取，先后用含酸的不同濃度的乙腈-水溶液對(duì)樣品分三次進(jìn)行振蕩提取、離心，合并三次提取液，得樣品提取液；（2）對(duì)樣品提取液進(jìn)行鹽析、除脂，在所述樣品提取液中加入甲醇和0.2%氨水進(jìn)行鹽析，離心，在所得上清液中加入正己烷，旋渦振蕩，除脂；（3）對(duì)鹽析、除脂后的樣品進(jìn)行凈化、濃縮、復(fù)溶，將鹽析、除脂后的樣品離心，在所得的下層乙腈層加入100%甲醇旋渦振蕩進(jìn)行凈化，離心，對(duì)所得上清液進(jìn)行真空濃縮后，先用甲醇對(duì)殘?jiān)鼜?fù)溶，再用水對(duì)剩余的殘?jiān)鼜?fù)溶，合并兩次復(fù)溶所得的復(fù)溶液，進(jìn)行濾膜過(guò)濾，得樣品分析液；（4）采用質(zhì)譜儀對(duì)樣品分析液進(jìn)行定性定量檢測(cè)。在所述步驟（3）之前還能夠?qū)?duì)鹽析、除脂后的樣品過(guò)固相萃取柱HLB柱進(jìn)行純化、濃縮。將對(duì)鹽析、除脂后的樣品按照0.6-1.0mL/min的過(guò)柱速度過(guò)固相萃取柱HLB柱。所述不同濃度的乙腈-水溶液為體積比為70-90：30-10的乙腈-水溶液、體積比為10-40：90-60的乙腈-水溶液和體積比為20-60：80-60的乙腈-水溶液。所述步驟（2）中的鹽析、除脂包括：在所述樣品提取液中加入硫酸鎂、氨水、檸檬酸鈉、檸檬酸氫二鈉進(jìn)行鹽析，離心，在所得上清液中加入正己烷，旋渦振蕩，除脂。
實(shí)施例1
（1）稱量2.5g待測(cè)樣品，先用20ml含0.1%（體積比）甲酸的80%（體積比）的乙腈-水溶液對(duì)樣品進(jìn)行振蕩提取30min、離心，得提取液1，再對(duì)提取后的剩余物用5ml含0.1%（體積比）甲酸的20%（體積比）的乙腈-水溶液進(jìn)行振蕩提取30min、離心，得提取液2，合并所述提取液1和所述提取液2，得樣品提取液；（2）在所述樣品提取液中加入1.0g檸檬酸鈉、4.0g硫酸鎂、1.0g氨水、0.5g檸檬酸氫二鈉進(jìn)行鹽析，離心后轉(zhuǎn)移上清液，向其中加入20mL正己烷，旋渦振蕩1min除去脂肪；（3）將鹽析、除脂后的樣品離心，轉(zhuǎn)移下層乙腈層至離心管中，加入150mg甲醇和50mg 0.2%氨水硫酸鎂后旋渦振蕩進(jìn)行凈化，離心，用5mL乙腈洗滌，離心，合并所述凈化、所述洗滌兩次離心后的上清液，進(jìn)行真空濃縮；先用1.5mL甲醇復(fù)溶殘?jiān)?，再用大于等?mL的水復(fù)溶殘?jiān)喜纱螐?fù)溶所得的復(fù)溶液，用0.22um濾膜進(jìn)行過(guò)濾后得樣品分析液；（4）利用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法檢測(cè)樣品分析液中的多種霉菌毒素。優(yōu)選所述步驟（4）的高效液相色譜條件為：流動(dòng)相A為含0.1%甲酸的甲醇，流動(dòng)相B為含0.1%甲酸的水，流動(dòng)相A和流動(dòng)相B的體積比為：70-20:30-80，梯度洗脫，或者流動(dòng)相A為甲醇，流動(dòng)相B為水，流動(dòng)相A和流動(dòng)相B的體積比為：90-10:10-90，梯度洗脫；色譜柱以十八烷基硅烷建和硅膠為填料。進(jìn)一步優(yōu)選所述步驟（4）的質(zhì)譜條件為：采用電噴霧離子源（ESI），正離子模式（ESI+）和負(fù)離子模式（ESI-）進(jìn)行掃描后，利用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）檢測(cè)。
還能夠?qū)?duì)鹽析、除脂后的樣品過(guò)固相萃取柱HLB柱進(jìn)行純化、濃縮。將對(duì)鹽析、除脂后的樣品按照0.6-1.0mL/min的過(guò)柱速度過(guò)固相萃取柱HLB柱。所述不同濃度的乙腈-水溶液為體積比為70-90：30-10的乙腈-水溶液、體積比為10-40：90-60的乙腈-水溶液和體積比為20-60：80-60的乙腈-水溶液。所述鹽析、除脂包括：在所述樣品提取液中加入硫酸鎂、氨水、檸檬酸鈉、檸檬酸氫二鈉進(jìn)行鹽析，離心，在所得上清液中加入正己烷，旋渦振蕩，除脂。
所述的流動(dòng)相為含0.1%甲酸的甲醇和含0.1%甲酸的水時(shí)，所對(duì)應(yīng)的電離模式為正離子模式；流動(dòng)相為甲醇和水時(shí)，所對(duì)應(yīng)的電離模式為負(fù)離子模式。在正離子模式下，樣品中可檢出的霉菌毒素包括：新茄病鐮刀菌烯醇(NEO)、黃曲霉毒素（AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1、AFM2）、伏馬毒素（FB1、FB2、FB3）、二乙酰蔗草鐮刀菌烯醇(DAS)、雜色曲霉（ST）、HT2毒素（HT2）、膠霉毒素(GLT)、T2毒素（T2）、煙曲霉素(FUM)。
在負(fù)離子模式下，樣品中可檢出的霉菌毒素包括：疣孢漆斑菌原（VER）、赭曲霉素A（OTA）、玉米赤霉烯酮（ZEN）、脫氧鐮刀雪腐菌烯醇（DON）、鐮刀菌烯酮（FUS-X）、去環(huán)氧-脫氧鐮刀雪腐菌烯醇（DOM-1）、微囊藻毒素（PAX）、3-乙酰基脫氧鐮刀雪腐菌烯醇（3-ADON）、15-乙酰基脫氧鐮刀雪腐菌烯醇（15-ADON）。
霉菌毒素采用多反應(yīng)監(jiān)控模式（MRM）對(duì)毒素進(jìn)行定性和定量。根據(jù)歐盟關(guān)于分析方法要求的法令2002/657/EU，采用液相色譜質(zhì)譜方法分析，必須達(dá)到4分的要求，本方法選擇1個(gè)母離子（2分），2個(gè)子離子（1分）對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行定性，滿足了4分的要求。定量方式采用了基質(zhì)曲線定量，每條曲線由5個(gè)點(diǎn)構(gòu)成，線性相關(guān)系數(shù)（r2）大于0.995，滿足了定量的要求。
對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，顯然本發(fā)明不限于上述示范性實(shí)施例的細(xì)節(jié)，而且在不背離本發(fā)明的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。因此，無(wú)論從哪一點(diǎn)來(lái)看，均應(yīng)將實(shí)施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求而不是上述說(shuō)明限定，因此旨在將落在權(quán)利要求的等同要件的含義和范圍內(nèi)的所有變化囊括在本發(fā)明內(nèi)。此外，應(yīng)當(dāng)理解，雖然本說(shuō)明書(shū)按照實(shí)施方式加以描述，但并非每個(gè)實(shí)施方式僅包含一個(gè)獨(dú)立的技術(shù)方案，說(shuō)明書(shū)的這種敘述方式僅僅是為清楚起見(jiàn)，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)將說(shuō)明書(shū)作為一個(gè)整體，各實(shí)施例中的技術(shù)方案也可以經(jīng)適當(dāng)組合，形成本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的其他實(shí)施方式。