檢測雌三醇的酶聯免疫試劑盒及其應用的制作方法

本發明涉及酶聯免疫檢測技術，具體涉及一種用于檢測雌三醇的酶聯免疫試劑盒，可定性、定量檢測動物源性食品、水質中雌三醇藥物的殘留量。

背景技術：

雌三醇(estriol，E3)是雌二醇和雌酮的代謝產物，非妊娠期其值很低，主要由肝臟合成；妊娠期主要由胎兒胎盤合成，合成后通過母體血循環，在肝臟代謝，和硫酸或葡萄糖醛酸結合形成結合型E3，從尿排出。E3在調節胎兒宮內發育的過程中起重要作用，并能影響妊娠子宮對催產素的敏感性。

動物源性食品、水質是人類重要食品之一，富含蛋白質、維生素、鈣質及其它人類所需的營養素，具有很高的營養價值。目前，飼養動物過程中存在濫用抗生素、激素的現象，導致動物源性食品、水質中含有一定量的雌三醇激素。雌三醇在雌性激素中占有很大比例，動物源性食品、水質中雌性激素含量增加，容易使人發生激素相關性疾病，如乳腺、卵巢、前列腺腫瘤、內分泌相關的腫瘤、出生缺陷和生育缺陷等，還會對嬰兒和青少年的生長發育造成嚴重影響。國內外測定動物源性食品中的雌性激素采用氣相色譜-質譜(GC-MS)、紅外光譜法、酶免疫分析法、放射免疫法、熒光免疫分析法、高效液相色譜法等方法。

本發明應用酶聯免疫法，測定動物源性食品、水質中雌三醇藥物的殘留量，具有檢測限低、特異性強、操作簡便、檢測速度快、檢測成本低，非常容易推廣等優點。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供一種能夠檢測動物源性食品、水質中雌三醇藥物殘留量的酶聯免疫試劑盒，并提供一種高效、準確、簡便、適于大批量樣品篩選的定性、定量檢測方法。

本發明試劑盒，它包括：包被有包被原的酶標板、雌三醇標準品溶液、酶標二抗、底物顯色液、終止液、洗滌液、復溶液，所述包被原為雌三醇偶聯抗原，所述酶標二抗為酶標記的雌三醇二抗。

所述雌三醇偶聯抗原是由雌三醇半抗原與載體蛋白偶聯得到，所述雌三醇半抗原是經化學反應得到，所述載體蛋白可為鼠血清蛋白、甲狀腺蛋白、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、人血清蛋白、卵清蛋白、血藍蛋白或纖維蛋白原。

所述雌三醇特異性抗體是以雌三醇偶聯抗原作為免疫原制備獲得，所述雌三醇特異性抗體可為雌三醇單克隆抗體或雌三醇多克隆抗體，其中優選雌三醇單克隆抗體。

所述酶標二抗的標記酶為辣根過氧化物酶或細菌提取堿性磷酸酯酶，其中優選辣根過氧化物酶；酶標二抗是由酶和雌三醇二抗偶聯得到的。

為了更方便現場監控和大量樣本篩查，所述試劑盒還包括雌三醇標準品溶液、底物顯色液、終止液、洗滌液、復溶液。

所述雌三醇標準品溶液5瓶，濃度分別為0μg/L、0.05μg/L、0.15μg/L、0.45μg/L、1.35μg/L。

當標記酶為辣根過氧化物酶時，所述底物顯色液由底物液A液和底物液B液組成，A為過氧化氫或過氧化脲，B液為鄰苯二胺或四甲基聯苯胺，所述終止液為1～2mol/L的硫酸或液鹽酸緩沖液；當標記酶為細菌提取堿性磷酸酯酶時，所述底物顯色液為對硝基磷酸鹽緩沖液，所述終止液為1～2mol/L氫氧化鈉溶液。

所述洗滌液優選為pH值為7.4，含有0.5％～1.0％吐溫-20、0.01‰～0.03‰疊氮化鈉防腐劑、0.1～0.3mol/L的磷酸鹽緩沖液，所述百分比為重量體積百分比。

所述復溶液優選為pH值為7.0、0.02mol/L的磷酸鹽緩沖液，所述百分比為重量體積百分比。

其中在酶標板制備過程中所用到的包被緩沖液為pH值為9.6，0.05mol/L的碳酸鹽緩沖液，封閉液為pH值為7.1～7.5，含有1％～3％酪蛋白、0.1～0.3mol/L的磷酸鹽緩沖液，所述百分比為重量體積百分比。

本發明中酶標板的制備過程為：用包被緩沖液將包被原稀釋成20μg/mL，每孔加入100μl，25℃避光孵育2h或4℃過夜，傾去孔中液體，用洗滌液洗滌2次，每次30s，拍干，然后在每孔中加入150～200μl封閉液，25℃避光孵育1～2h，傾去孔內液體拍干，干燥后用鋁膜真空密封保存。

本發明的檢測原理為：

本試劑盒采用直接競爭ELISA方法，在酶標板微孔條上預包被偶聯抗原，樣本中殘留的雌三醇和酶標板微孔條上預包被的偶聯抗原競爭抗雌三醇的酶標二抗，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與其所含殘留物雌三醇的含量成負相關，與標準曲線比較，再乘以其對應的稀釋倍數，即可得出樣本中雌三醇的殘留量。

本發明還提供了一種應用上述酶聯免疫試劑盒檢測雌三醇的方法，它包括步驟：

(1)樣品前處理；

(2)用試劑盒進行檢測；

(3)分析檢測結果。

本發明檢測雌三醇的酶聯免疫試劑盒主要采用ELISA方法定性或定量檢測樣品中雌三醇的含量；對樣品的前處理要求低，樣品前處理過程簡單，能同時快速檢測大批量樣品；主要試劑以工作液的形式提供，檢驗方法方便易行，具有特異性高、靈敏度高、精確度高、準確度高等特點。本發明的酶聯免疫試劑盒，結構簡單、使用方便、價格便宜、攜帶便利、檢測方法高效、準確、簡便、適于大批量樣品篩選的定性、定量。

附圖說明

圖1：雌三醇半抗原結構合成路線圖

圖2：試劑盒標準曲線圖

具體實施方式

下面結合具體的實施例來進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明，而不用來限制本發明的范圍。

實施例1試劑盒組分的制備

1、雌三醇半抗原的制備

取雌三醇1g，加三氟乙酸20ml溶解，加烏洛托品1.46g，加熱，回流反應3h，冷卻到室溫，加1mol/L稀鹽酸30ml，攪拌2h。停止反應，加水，氫氧化鈉調節PH值到7，加乙酸乙酯，萃取，水洗，無水硫酸鈉干燥蒸干，上硅膠柱，石油醚/乙酸乙酯(3/1,v/v),得到半抗原產物0.84g，收率75.57％。

2、抗原的制備

免疫原制備——雌三醇半抗原與牛血清白蛋白(BSA)偶聯得到免疫原。

取12mg醛基雌三醇半抗原，溶解于0.3mL DMF中，得到A液。稱取BSA 50mg，充分溶解于4mL CB(PH 9.5)中，將反應液A逐滴緩慢滴加到蛋白溶液中，并于室溫下攪拌24h。用0.02mol/L PBS 4℃透析3d，每天換液3次，得到免疫抗原，分裝，于-20℃保存備用。

包被原制備——雌三醇半抗原與卵清蛋白(OVA)偶聯得到免疫原。

取5.3mg醛基雌三醇半抗原，溶解于0.2mL乙醇，得到A液。稱取OVA50mg，使之充分溶解在4mL CB(PH 9.5)中，將A液逐滴緩慢滴加到蛋白溶液中，并于室溫下攪拌4h；用0.01mol/L PBS 4℃透析3d，每天換3次透析液，得到包被抗原，分裝，于-20℃保存備用。3、雌三醇單克隆抗體的制備

動物免疫：將上述步驟得到的免疫原注入到Balb/c小鼠體內，免疫劑量為150μg/只，使其產生抗血清。

細胞融合和克隆化：小鼠血清測定結果較高后，取其脾細胞，按8:1(數量配比)比例與SP2/0骨髓瘤細胞融合，采用間接競爭ELISA測定細胞上清液，篩選陽性孔。利用有限稀釋法對陽性孔進行克隆化，直到得到分泌雌三醇單克隆抗體的雜交瘤細胞株。

細胞凍存和復蘇：將單克隆雜交瘤細胞株用凍存液制成1×10⁶個/mL的細胞懸液，在液氮中長期保存。復蘇時取出凍存管，立即放入37℃水浴中速融，離心去除凍存液后，移入培養瓶內培養。

單克隆抗體的生產與純化：將Balb/c小鼠腹腔注入滅菌石蠟油0.5mL/只，7天后腹腔注射穩定的單克隆雜交瘤細胞株5×10⁵個/只，7天后采集腹水。用辛酸-飽和硫酸銨法進行腹水純化，-20℃保存。

4、酶標二抗的制備

將雌三醇二抗與辣根過氧化物酶(HRP)進行偶聯得到。

5、酶標板的制備

用包被緩沖液將包被原稀釋成20μg/mL，每孔加入100μl，25℃避光孵育2h，傾去孔中液體，用洗滌液洗滌2次，每次30s，拍干，然后在每孔中加入200μl封閉液，25℃避光孵育2h，傾去孔內液體拍干，干燥后用鋁膜真空密封保存。

實施例2檢測雌三醇的酶聯免疫試劑盒的組建

組建檢測雌三醇的酶聯免疫試劑盒，使其包含下述組分：

(1)包被雌三醇偶聯抗原的酶標板；

(2)雌三醇標準品溶液5瓶，濃度分別為0μg/L、0.05μg/L、0.15μg/L、0.45μg/L、1.35μg/L；

(3)用辣根過氧化物酶標記的雌三醇二抗；

(4)底物顯色液由A液和B液組成，A液為過氧化脲，B液為四甲基聯苯胺；

(5)終止液為2mol/L硫酸；

(6)洗滌液為pH值為7.4，含有0.5％～1.0％吐溫-20、0.01‰～0.03‰疊氮化鈉防腐劑、0.1～0.3mol/L的磷酸鹽緩沖液，所述百分比為重量體積百分比；

(7)復溶液為pH值為7.0、0.02mol/L的磷酸鹽緩沖液，所述百分比為重量體積百分比。

實施例3動物源性食品、水質中雌三醇的檢測

1、樣品前處理

動物組織(雞肉、豬肉、魚肉、蝦肉)樣本前處理方法：用均質器均質組織樣本；稱取1.0±0.05g均質后的樣本至50ml聚苯乙烯離心管中，加入5ml乙酸乙酯，用振蕩器振蕩1min，3000g室溫(20-25℃/68-77℉)離心5min；移取1ml上層有機相至10ml潔凈干燥玻璃管中，于50-60℃(122-140℉)水浴氮氣流下吹干加入1ml正己烷，1ml復溶工作液，用渦旋儀渦動1min，混勻，3000g室溫(20-25℃/68-77℉)離心3min；除去上層有機相，取下層水相50μl用于分析。

牛奶樣本：移取1ml牛奶樣本至50ml聚苯乙烯離心管中，加入5ml乙酸乙酯，用振蕩器振蕩1min，3000g室溫(20-25℃/68-77℉)離心5min；移取1ml上層有機相至10ml潔凈干燥玻璃管中，于50-60℃(122-140℉)水浴氮氣流下吹干加入1ml正己烷，1ml復溶工作液，用渦旋儀渦動1min，混勻，3000g室溫(20-25℃/68-77℉)離心3min；除去上層有機相，取下層水相50μl用于分析。

水質樣本：加入復溶工作液進行處理，取50μl用于分析。

2、用試劑盒檢測

加入標準品/樣本50μl到對應的微孔中，將抗體工作液和酶標二抗濃縮液按10:1體積比混合(例如1ml抗體工作液加入100μl酶標二抗濃縮液)，加抗體工作液和酶標二抗濃縮液的混合液50μl/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃(77℉)避光環境中反應30min；小心揭開蓋板膜，將孔內液體甩干，加入洗滌工作液250μl/孔，充分洗滌4-5次，每次間隔10s，潑掉板孔內洗滌液，用吸水紙拍干(拍干后未被清除的氣泡可用未使用過的槍頭戳破)；加入底物液A液50μl/孔，再加入底物液B液50μl/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃(77℉)避光環境中反應15min；加入終止液50μl/孔，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀于450nm處(建議用雙波長450/630nm檢測，請在5min內讀完數據)，測定每孔OD值。

3、檢測結果分析

標準品或樣本的百分吸光率等于標準品或樣本的吸光度值的平均值(雙孔)除以第一個標準品(0標準)的吸光度值的平均值，再乘以100％，得到標準品或樣本的百分吸光度值。以標準品百分吸光率為縱坐標，以雌三醇標準品濃度(μg/L)的對數為橫坐標，繪制標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中雌三醇的實際濃度。

實施例4雌三醇技術參數的確定試驗

1、試劑盒靈敏度和檢測限

按照常規方法測定試劑盒靈敏度，標準曲線的范圍為0～1.35μg/L，IC₅₀(50％抑制濃度)浮動范圍為0.16～0.3μg/L；對20份樣品進行檢測，從標準曲線上查出對應于各百分吸光度值的濃度，以20份樣本濃度的平均值加上3倍標準差表示檢測限，結果顯示，該方法對動物源性食品、水質的檢測限均為0.25μg/kg。

2、樣本精密度和準確度試驗

以回收率作為準確度評價指標，重復測定某一濃度樣品的檢測結果相對標準偏差(RSD％)作為精密度評價指標。計算公式為：回收率(％)＝實際測定值/理論值×100％，其中理論值為樣品的添加濃度；相對標準偏差RSD％＝SD/X×100％，其中SD為標準偏差，X為測定數據的平均值。

按0.25μg/kg、0.5μg/kg兩個濃度的雌三醇分別對雞肉、豬肉、魚肉、蝦肉、牛奶、水質樣品進行添加回收測定，每個樣品做4個平行，用三批不同試劑進行測定，計算樣品的平均回收率及精密度結果見下表。

表1精密度及準確度試驗

以0.25μg/kg、0.5μg/kg兩個濃度的雌三醇分別對雞肉、豬肉、魚肉、蝦肉、牛奶、水質進行添加，雞肉、豬肉、魚肉、蝦肉的平均回收率在81.1％～113.5％之間，牛奶、水質的平均回收率在73.8％～105.4％之間；批內相對標準偏差均小于10％，批間相對標準偏差均小于14％。3、試劑盒穩定性試驗

試劑盒保存條件為2～8℃，經過12個月的測定，試劑盒的最大吸光度值(零標準)、50％抑制濃度、雌三醇添加實際測定值均在正常范圍之內。考慮在運輸和使用過程中，會有非正常保存條件出現，將試劑盒在37℃保存條件下放置7天，進行加速老化實驗，結果表明該試劑盒各項指標完全符合要求。考慮到試劑盒冷凍情況發生，將試劑盒放入-20℃冰箱冷凍7天，測定結果也表明試劑盒各項指標完全正常。從以上結果可得出試劑盒可以在2～8℃至少保存12個月以上。