一種用于檢測AsiaI型口蹄疫的膠體金試紙及其制備方法與流程

本發明涉及血清學檢測技術領域，具體涉及一種用于檢測Asia I型口蹄疫的膠體金試紙及其制備方法。

背景技術：

口蹄疫(Foot-and-mouth disease，FMD)是由FMD病毒(FMDV)引起的一種急性、熱性、高度接觸性的傳染病。該病毒主要分為A型、O型、C型、SAT1型、SAT2型、SAT3型和Asia I型7種血清型，各血清型之間不能產生交叉免疫保護。此外，FMDV還包括許多亞型和突變株，目前已發現80多種亞型，同一血清型內的不同亞型或分離株的抗原性也有不同程度的差異，血清學交叉反應的程度也各不相同，這種特性給FMD的診斷和防制造成一定的困難。

技術實現要素：

針對現有技術中存在的缺陷，本發明的目的在于提供一種用于檢測Asia I型口蹄疫的膠體金試紙及其制備方法，能夠實時快速診斷Asia I型口蹄疫，且準確度較高。

為達到以上目的，本發明采取的技術方案是：

一種用于檢測Asia I型口蹄疫的膠體金試紙，包括底板，底板的頂部設置有檢測層，檢測層上設置有檢測線和對照線，檢測層的頂部靠近對照線的一側設置有吸收層，靠近檢測線的一側設置有免疫金標墊，免疫金標墊的頂部設置有樣品墊；

免疫金標墊上涂覆有膠體金顆粒，該膠體金顆粒上結合有proteinG，檢測線上涂覆/浸潤有Asia I型口蹄疫病毒樣顆粒相對應的純化蛋白，對照線上涂覆/浸潤有兔IgG；

所述免疫金標墊上膠體金與proteinG的比例為2×10⁴:1～2。

在上述技術方案的基礎上，所述免疫金標墊上膠體金與proteinG的比例為2×10⁴:1.3。

在上述技術方案的基礎上，所述免疫金標墊的吸附比例為10～50μL/cm。

在上述技術方案的基礎上，所述檢測線上涂覆/浸潤有濃度為0.5～1mg/mL的Asia I型口蹄疫病毒樣顆粒。

在上述技術方案的基礎上，所述對照線上涂覆/浸潤有濃度為0.8～1.5mg/mL的免疫兔血清IgG。

一種用于檢測Asia I型口蹄疫的試紙的制備方法，包括以下步驟：

A、制備LgG，制備并純化膠體金，將膠體金與proteinG按質量比為2×10⁴:1～1.5反應，得到免疫膠體金，將濃度為1～1.2g/ml的免疫膠體金按吸附比為10～50μL/cm吸附在玻璃膜上，得到免疫金標墊；

B、使用硝酸纖維膜作為檢測層基材，在檢測線上噴涂濃度為0.5～1mg/mL的Asia I型口蹄疫病毒樣顆粒，在對照線上噴涂濃度為0.8～1.5mg/mL的免疫兔血清IgG；

在檢測層的中部距檢測線0.3～1cm處，噴涂對照線，噴膜量為5～15μl/1cm進行噴膜，噴膜后干燥得到檢測層；

C、在底板1的頂部設置檢測層，并將檢測層；壓平，將吸收層一部分固定在底板上，一部分固定在檢測層；上靠近對照線的部分，將免疫金標墊的一側固定在底板上，另一側固定在檢測層；靠近檢測線的一側，樣品墊的一側固定在底板上，樣品墊的一側固定在底板上，另一側固定在免疫金標墊上。

在上述技術方案的基礎上，免疫金標墊的制備方法為：使用濃度為0.1M的K₂CO₃調整膠體金的pH值為5.9，按質量比為2×10⁴::1～1.5將相應的proteinG溶液加入膠體金中放置30min后，在轉速為10000r/min、溫度為4℃的條件下離心30min，將沉淀溶于重懸液中混合均勻，用玻璃膜吸附后晾干。

在上述技術方案的基礎上，所述檢測線上Asia I型口蹄疫病毒樣顆粒的濃度為0.8mg/mL，所述對這線上免疫兔血清IgG的濃度為1mg/mL。

與現有技術相比，本發明的優點在于：

(1)本發明的一種用于檢測Asia I型口蹄疫的膠體金試紙，檢測層上設置有檢測線和對照線，檢測層靠近檢測線的一側設置有免疫金標墊，免疫金標墊的頂部設置有樣品墊。免疫金標墊包括膠體金顆粒，該膠體金顆粒上結合有proteinG標記物，檢測線涂覆/浸潤有Asia I型口蹄疫病毒樣顆粒，對照線上涂覆/浸潤有兔IgG，免疫金標墊上膠體金與proteinG的比例為2×10⁴:1～2，檢測線上涂覆/浸潤有濃度為0.5～1mg/mL的Asia I型口蹄疫病毒樣顆粒。

在使用時，直接將血液樣品稀釋后在現場進行檢測，如果血液樣品中含有Asia I型口蹄疫抗體，血液樣品中的抗體與免疫金標墊中proteinG修飾的膠體金結合形成復合物，與檢測線上Asia I型口蹄疫病毒樣顆粒結合形成紫紅色線條，繼續前行，未與抗原結合的抗體攜帶重組蛋白proteinG與對照線中的IgG抗體形成紫紅色線條。

將檢測結果與常規的CFT、VNT凝集試驗、免疫擴散和ELISA進行比較，結果基本一致，且本發明的血液未經過純化，說明本發明的準確度較高，且檢測條件不高，穩定性較好，具有操作簡單、檢測快速、結果清楚，易于判斷和保存，且無需大型儀器設備，成本較低，能夠用于臨床快速實時檢測，快速檢測流行病，便于快速采取相應措施，避免疾病大規模爆發。

附圖說明

圖1為本發明實施例中用于檢測Asia I型口蹄疫的膠體金試紙的結構示意圖。

圖中：1-底板，2-樣品墊，3-免疫金標墊，4-檢測層，5-吸收層，6-檢測線，7-對照線。

具體實施方式

以下結合附圖及實施例對本發明作進一步詳細說明。

參見圖1所示，本發明實施例提供一種用于檢測Asia I型口蹄疫的膠體金試紙，包括采用PVC制成的底板1，底板1的頂部設置有檢測層4，檢測線6上設置有檢測線6和對照線7，檢測層4的頂部靠近對照線7的一側設置有吸收層5，靠近檢測線6的一側設置有免疫金標墊3，免疫金標墊3的頂部設置有樣品墊2。

免疫金標墊3包括膠體金顆粒，該膠體金顆粒上結合有proteinG標記物，檢測線6涂覆/浸潤有Asia I型口蹄疫病毒樣顆粒，對照線7上涂覆/浸潤有兔IgG，本實施例中，免疫金標墊3上膠體金與proteinG的比例為2×10⁴:1～2，免疫金標墊3上膠體金與proteinG的最佳比例為2×10⁴:1.3，免疫金標墊3的吸附比例為10～50μL/cm。

檢測線6上涂覆/浸潤有濃度為0.5～1mg/mL的Asia I型口蹄疫病毒樣顆粒，對照線7上涂覆/浸潤有濃度為0.8～1.5mg/mL的免疫兔血清IgG。

本發明還提供一種用于檢測Asia I型口蹄疫的膠體金試紙的制備方法，包括以下步驟：

S1、制備IgG：用proteinG采用多點注射法免疫陰性家兔2只，每隔2周加強免疫1次，共進行3次，最后一次免疫10天后采血備用，放入4℃冰箱過夜沉淀，將沉淀的全血在轉速為4000r/min的條件下離心10min，取上清即為血清。將20ml血清中加入20ml生理鹽水中，再加入10ml飽和(NH₄)₂SO₄溶液，混合均勻后靜置30min，然后在轉速為3000r/min的條件下離心20min，棄去沉淀除去纖維蛋白，取上清液。

b、在上清液中加入30ml(NH₄)₂SO₄飽和溶液，混合均勻后靜置30min，在轉速為3000r/min的條件下離心20min，棄上清液，取沉淀物，向沉淀物中加20ml生理鹽水，10ml(NH₄)₂SO₄飽和溶液，混合均勻后靜置30min，3000r/min離心20min，棄上清。

重復b步驟2～3次后，向純化后的沉淀中加入10ml生理鹽水并透析，先放入純水中透析過夜除鹽，然后放入生理鹽水中在4℃下透析24h，透析期間每2～3h換液一次。

檢測透析是否完全：檢測試劑為濃度為1％的BaCl₂(用于檢測SO₄^2-)或以納氏試劑(用于檢測NH₄⁺)：取3～4ml透析液，加入檢測試劑1～2滴，出現磚紅色即認為有NH₄⁺存在)，出現白色沉淀即有SO₄^2-存在，透析至無沉淀出現后，離心去沉淀(去除雜蛋白)，上清液即為純化后的兔IgG。

S2、制備膠體金：取1g氯金酸溶于100ml三蒸水中制成濃度為1％的氯金酸溶液，向99ml水中加入1ml 1％的氯金酸水溶液，加熱至沸騰，邊攪拌邊逐滴加入1ml濃度為1％的檸檬酸鈉三鈉水溶液，待顏色變紅后繼續煮沸5min，冷卻后加入蒸餾水至100ml，即為膠體金放置于溫度為4℃的條件下保存。

S3、判斷proteinG的最小蛋白用量：取一個1.5ml離心管，加入1ml膠體金，用0.1M的K₂CO₃調節PH值至8；取96孔板，每孔加入100μL的膠體金，取10μL濃度為5mg/ml的proteinG加入990μL的蒸餾水中，取1～20μLproteinG溶液分別加入每孔混勻，室溫靜置15min；每孔加入濃度為10％的Nacl溶液20μL混合均勻，在室溫下放置10min，觀察膠體金顏色變化，記錄顏色仍保持紅色的最小蛋白用量，重復3次，取平均值，本實施例中，最小蛋白用量為10μL，即每100μL濃度為1g/100ml的膠體金至少需要10μL濃度為0.05mg/ml的proteinG，膠體金與proteinG的質量比為2×10⁴:1，最佳膠體金與proteinG的比例為2×10⁴:1.3，在實際使用時，可以根據需要調整膠體金和proteinG的比例，可以為2×10⁴:1～1.5。

S4、制備proteinG修飾的膠體金和免疫金標墊3：將相應比例的proteinG溶液加入膠體金中放置30min，再加入1％BSA(牛血清白蛋白)放置30min，在轉速為10000r/min、溫度為4℃的條件下離心30min，取沉淀溶于重懸液中溶解，均勻的鋪在玻璃纖維膜上，吸附比為5～15μL/cm，最佳吸附比為10μL/cm，得到免疫金標墊3。

S5、制備檢測層4

使用硝酸纖維膜作為檢測層4基材，在檢測層4上標記檢測線6和對照線7，檢測線6與對照線7之間的距離為0.3～1cm(最優為0.5cm)，且對照線7位于纖維素膜的中段，在檢測線6上噴涂濃度為0.5～1mg/mL(最優為0.8mg/mL)的Asia I型口蹄疫病毒樣顆粒；在對照線7上噴涂兔IgG，噴涂量為10μl/1cm。

S6、制備樣品墊2：以玻璃纖維膜作為樣品墊2的基材，將20mM的PB(磷酸鹽緩存溶液)、1％的吐溫20、1％的BSA和2.5％的蔗糖溶于100ml三蒸水中并過濾得到樣品液，把玻璃纖維膜浸泡于該樣品液中，完全浸潤后取出并晾干。

S7、在底板1的頂部設置檢測層4，并將檢測層4壓平，將吸收層5(吸水紙)一部分固定在底板1上，一部分固定在檢測層4上靠近對照線7的部分，將免疫金標墊3的一側固定在底板1上，另一側固定在檢測層4靠近檢測線6的一側，樣品墊2的一側固定在底板1上，樣品墊2的一側固定在底板1上，另一側固定在免疫金標墊3上。

本發明膠體金試紙在使用時，先將樣品稀釋，然后將膠體金試紙的樣品墊2端插入樣品中，樣品墊2上設置有液面線，樣品的液面不能沒過液面線，當吸收層5完全被液體浸潤后，取出試紙條，平放后5～15分鐘內觀察結果。

如果血液樣品中含有Asia I型口蹄疫抗體，血液樣品中的抗體與免疫金標墊3中proteinG修飾的膠體金結合形成復合物，與檢測線6上Asia I型口蹄疫病毒樣顆粒結合形成紫紅色線條，繼續前行，未與抗原結合的抗體攜帶重組蛋白proteinG與對照線7中的IgG抗體形成紫紅色線條。

如果對照線7不出現紫紅條帶則說明該試紙條失效，如果檢測血液樣品中不含有Asia I型口蹄疫相關抗體，則檢測線6處不會出現紫紅色條帶，而對照線7處必定仍出現紫紅色條帶。

本發明不局限于上述實施方式，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也視為本發明的保護范圍之內。本說明書中未作詳細描述的內容屬于本領域專業技術人員公知的現有技術。