利用近紅外二區熒光量子點探針檢測鋅離子的方法與流程
本發明涉及功能納米材料技術領域，具體地說，涉及一種利用近紅外二區熒光量子點探針檢測鋅離子的方法。
背景技術：
半導體量子點是指在三維尺度上都小于激發波爾半徑的一類納米材料。由于量子局限效應，量子電具有優異的光學特性。相較于傳統有機染料，量子點還具有抗光漂白性強、生物相容性好、光穩定性優異等特點，并被廣泛應用在傳感，生物診斷，細胞成像，離子檢測等方面。而具有近紅外二區熒光特性的量子點，由于較小的自身熒光及微弱的自散射，在生物組織中具有更高的空間分辨率，在生物相關檢測等領域具有巨大的應用潛力。
鋅是一種重要的人體必需的微量元素，廣泛分布于人體的細胞和體液中。鋅離子參與了很多生物學過程，例如DNA合成、基因表達、微管的多聚化、基體免疫、酶催化等諸多方面，其重要性得到了廣泛的認同。人體內鋅離子紊亂會導致諸多疾病，比如老年癡呆癥，帕金森綜合癥，中風以及腎結石等。因此鋅離子的檢測，受到了人們越來越多的關注。
不同于其它過渡金屬離子(如二價鐵離子、錳離子、銅離子)，由于最外層電子分布為3d104s0，鋅不顯現任何波譜或磁信號，因此常用的紫外光譜、圓二色譜、核磁共振、電子順磁共振和穆斯保爾光譜儀等均不適用于鋅離子的測定，而常用的分析方法中，熒光法用于測定鋅離子具有選擇性好、靈敏度高、簡便、快捷等優點。目前為止，關于鋅離子檢測的量子點熒光探針的熒光范圍均處在1000nm以下，在生物檢測應用領域受限于其自身的波長范圍，開發具有近紅外二區的熒光量子點對于鋅的生物檢測具有重要意義。
技術實現要素：
本發明的目的是提供一種利用近紅外二區熒光量子點探針檢測鋅離子的方法。
為了實現本發明目的，本發明提供的利用近紅外二區熒光量子點探針檢測鋅離子的方法，配制硫化銀熒光量子點探針緩沖體系，根據加入鋅離子標準溶液前后探針熒光強度的變化值與鋅離子的濃度建立線性方程，再于相同條件下將所述硫化銀熒光量子點探針緩沖體系注射到生物體內，或者向所述硫化銀熒光量子點探針緩沖體系中加入待測樣品溶液，檢測反應前后探針熒光強度的變化值，代入上述線性方程，即可根據熒光強度的變化計算得出生物體內或待測樣品溶液中鋅離子的含量。
所述方法包括以下步驟：
S1、配制硫化銀熒光量子點探針緩沖體系：將Ag無機鹽和十二烷硫醇，在氨水存在的堿性條件下，利用水熱合成法制成油溶性的硫化銀量子點，然后用巰基乙酸(或巰基丙酸)對所述油溶性的硫化銀量子點進行表面官能團改性，獲得水溶性的硫化銀量子點，經過過濾、透析、冷凍干燥后得到硫化銀量子點粉末；取一定量的硫化銀量子點粉末，加入到4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液(或三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩沖液)中得到硫化銀熒光量子點探針緩沖體系；
S2、繪制鋅離子濃度與相對熒光強度的標準曲線：配制不同濃度的鋅離子溶液，加入到所述硫化銀熒光量子點探針緩沖體系中，測得不同鋅離子濃度下量子點發射的近紅外二區熒光的強度，以相對熒光增強強度為縱坐標，以鋅離子濃度為橫坐標繪制標準曲線，并建立線性方程；
S3、檢測樣品溶液中鋅離子的濃度：于相同條件下，向硫化銀熒光量子點探針緩沖體系中加入待測樣品溶液，測得加入待測樣品溶液前后近紅外二區熒光量子點的相對熒光增強強度，代入步驟S2的線性方程中，計算得出待測樣品溶液中鋅離子的濃度。
步驟S1具體為：
S11、將Ag無機鹽溶于水，攪拌條件下滴加濃氨水得到混合液；
S12、向S11的混合液中加入十二烷硫醇，在100-200℃條件下反應；
S13、將S12的反應產物靜置或離心，收集沉淀，向沉淀中加入適量水后與巰基乙酸混合，超聲后將生成液經過過濾、透析、冷凍干燥后得到硫化銀量子點粉末；
S14、取一定量的硫化銀量子點粉末，加入到4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液中得到硫化銀熒光量子點探針緩沖體系。
步驟S11將Ag無機鹽溶于水，所得溶液中Ag離子的摩爾濃度為0.01-100mol/L；然后在攪拌條件下逐滴加入濃氨水直至生成的棕色沉淀完全消失，得到混合液。
步驟S12中所述混合液與十二烷硫醇的體積比為1：0.01-100，于100-200℃反應1-10h。
步驟S13向沉淀中按料液比0.1-10g：10mL加入水，然后向此混合物中加入巰基乙酸，所述混合物與巰基乙酸的體積比為1：0.01-100。
步驟S13中超聲功率為50-300W(優選150W)，超聲時間1-10h。
步驟S13中采用針式過濾器進行過濾，過濾器的孔徑為100-500nm。
步驟S13透析在透析袋MWCO中進行，截留分子量為100-2000Da(優選500Da)，透析液為水。
步驟S14將1-1000mg硫化銀量子點粉末加入到1-100mL所述4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液中得到硫化銀熒光量子點探針緩沖體系。
步驟S2中繪制標準曲線時，利用4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液配制濃度分別為0、4×10-6、8×10-6、12×10-6、16×10-6、20×10-6、24×10-6、28×10-6、32×10-6、36×10-6、40×10-6M的氯化鋅溶液。
本發明所述4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液的濃度為1mM，以水配制。
本發明中，所述硫化銀熒光量子點探針對鋅離子的檢測限小于1μM。
利用本發明方法制備的硫化銀量子點納米材料，該納米材料具有近紅外二區熒光特性(近紅外二區波長范圍為1.0-1.7μm)，納米粒徑為5nm左右。發射峰峰值為1000-1300nm，無明顯吸收峰。該區域的光線擁有更強的組織穿透性和更高的空間分辨率，在活體檢測領用具有較高的應用價值。本發明制備的熒光探針對鋅的識別基于光致電子轉移機制，鋅離子對探針的熒光強度具有顯著的增強效應。
本發明還提供一種基于近紅外二區熒光量子點探針檢測鋅離子的硫化銀熒光量子點探針緩沖體系：將Ag無機鹽和十二烷硫醇，在氨水存在的堿性條件下，利用水熱合成法制成油溶性的硫化銀量子點，然后用巰基乙酸(或巰基丙酸)對所述油溶性的硫化銀量子點進行表面官能團改性，獲得水溶性的硫化銀量子點，經過過濾、透析、冷凍干燥后得到硫化銀量子點粉末；取一定量的硫化銀量子點粉末，加入到4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液(或三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩沖液)中得到硫化銀熒光量子點探針緩沖體系。
本發明進一步提供一種基于近紅外二區熒光量子點探針檢測鋅離子的試劑盒，所述試劑盒中含有上述硫化銀熒光量子點探針緩沖體系。
本發明具有以下優點：
(一)本發明的硫化銀熒光量子點探針具有近紅外二區的熒光特性，具有較小的自身熒光和微弱組織散射的特點。檢測方法基于光致電子轉移，鋅離子對探針的熒光強度具有顯著增強效應，而其他離子則為猝滅或相對不變，因而具有很高的選擇性。該探針的檢測限小于1μM，靈敏度較高。
(二)本發明的硫化銀熒光量子點探針表面富有親水基團，具有很好的水溶性及生物相容性。
(三)本發明方法簡便、易于操作、重現性好，在生物檢測領域具有較好的應用前景。。
附圖說明
圖1為本發明實施例1制備的硫化銀熒光量子點探針的電鏡圖。
圖2為本發明實施例1制備的硫化銀熒光量子點探針的實物圖(右上方)及吸光光譜圖。
圖3為本發明實施例1中利用熒光探針檢測鋅離子的機理，在此過程中發生了光致電子轉移。
圖4為本發明實施例2中利用熒光探針檢測鋅離子時，不同鋅離子濃度對熒光強度的影響。
圖5為本發明實施例2中鋅離子濃度與相對熒光增強強度之間的線性關系。
圖6為本發明實施例3中向熒光探針中分別加入鋅離子及干擾離子后，其熒光強度的變化結果比較。
具體實施方式
以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段，所用原料均為市售商品。
以下實施例中使用的4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液，其濃度為1mM，以水配制。
實施例1利用近紅外二區熒光量子點探針檢測鋅離子的方法
(1)將5mmol AgNO3溶解于20ml去離子水中形成無色透明的溶液，隨后向其中逐滴加入濃氨水直至生成的棕色沉淀完全消失。轉移至反應釜中后，加入3ml十二烷硫醇，并置于200℃的烘箱中反應2h。收集反應物并加入2ml巰基乙酸，超聲處理1h后，將產物通過孔徑為220nm的過濾器進行過濾，然后利用MWCO截留分子量為500DA的透析袋隔夜透析，冷凍干燥后得到硫化銀量子點粉末。將100mg粉末溶解在50ml pH＝7.3的4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液中配制成具有近紅外二區熒光特性的量子點探針。其在透射電子顯微鏡下觀察的結果見圖1，平均粒子直徑為3.85±0.04nm。測試其吸光光譜，如圖2所示，可以看出其在200-1000nm的光譜范圍內并沒有明顯的吸收峰。
(2)向11個石英比色皿中分別加入2mL步驟(1)制得的具有近紅外二區熒光特性的量子點探針緩沖體系。利用4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液配制濃度分別為0、4×10-6、8×10-6、12×10-6、16×10-6、20×10-6、24×10-6、28×10-6、32×10-6、36×10-6、40×10-6M的氯化鋅溶液，并用移液槍分別將2mL不同濃度的氯化鋅溶液加入上述裝有熒光量子點的比色皿中，放入紅外熒光測試系統檢測其熒光強度。選擇激發波波長490nm，檢測發射波波長為1120nm。繪制相對熒光增強強度隨鋅離子濃度的變化曲線，并對其進行擬合，得到擬合曲線公式：y＝0.016x+0.023。在檢測過程中發生了光致電子轉移過程，如圖3所示。鋅離子通過氫鍵連接到硫化銀量子點探針上，改變了原有結構的電子狀態，使得造成熒光猝滅的電子轉移過程不再發生，探針的熒光強度得到了顯著的增強。
(3)向2個石英比色皿中分別加入2mL步驟(1)制得的具有近紅外二區熒光特性的量子點探針緩沖體系。利用移液槍將2mL未知濃度的氯化鋅溶液和4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液分別加入上述裝有熒光量子點的比色皿中，放入紅外熒光測試系統檢測其熒光強度。選擇激發波波長490nm，檢測發射波波長為1120nm。計算待測氯化鋅溶液的相對熒光增強強度，根據步驟(2)中所得到的線性關系曲線，計算鋅離子的濃度為5.7×10-6M。
實施例2利用近紅外二區熒光量子點探針檢測鋅離子的方法
(1)將5mmol AgNO3溶解于20ml去離子水中形成無色透明的溶液，隨后向其中逐滴加入濃氨水直至生成的棕色沉淀完全消失。轉移至反應釜中后，加入3ml十二烷硫醇，并置于200℃的烘箱中反應2h。收集反應物并加入2ml巰基乙酸，超聲處理1h后，將產物通過孔徑為220nm的過濾器進行過濾，然后利用MWCO截留分子量為500DA的透析袋隔夜透析，冷凍干燥后得到硫化銀量子點粉末。將100mg粉末溶解在50ml pH＝7.3的4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液中配制成具有近紅外二區熒光特性的量子點探針。
(2)向8個石英比色皿中分別加入2mL步驟(1)制得的具有近紅外二區熒光特性的量子點探針緩沖體系。利用4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液配制濃度分別為0、10×10-5、20×10-5、40×10-5、80×10-5、120×10-5、160×10-5、200×10-5M的氯化鋅溶液，并用移液槍分別將2mL不同濃度的氯化鋅溶液加入上述裝有熒光量子點的比色皿中，放入紅外熒光測試系統檢測其熒光強度，每個樣品測試5遍。選擇激發波波長490nm，檢測發射波波長為1120nm。其熒光光譜如圖4所示，隨著鋅離子濃度的增加，近紅外二區熒光強度增強。
(3)計算每個樣品相對熒光增強強度的平均值和方差，繪制相對熒光增強強度隨鋅離子濃度的變化曲線，如圖5所示。相對熒光增強強度與鋅離子濃度具有良好的線性關系，R2＝0.99。基于3σ/slope所計算出的熒光探針對鋅離子的檢測限小于1μM。
實施例3利用近紅外二區熒光量子點探針檢測不同金屬離子
(1)將5mmol AgNO3溶解于20ml去離子水中形成無色透明的溶液，隨后向其中逐滴加入濃氨水直至生成的棕色沉淀完全消失。轉移至反應釜中后，加入3ml十二烷硫醇，并置于200℃的烘箱中反應2h。收集反應物并加入2ml巰基乙酸，超聲處理1h后，將產物通過孔徑為220nm的過濾器進行過濾，然后利用MWCO截留分子量為500DA的透析袋隔夜透析，冷凍干燥后得到硫化銀量子點粉末。將100mg粉末溶解在50ml pH＝7.3的4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液中配制成具有近紅外二區熒光特性的量子點探針。
(2)向11個石英比色皿中分別加入2mL步驟(1)制得的具有近紅外二區熒光特性的量子點探針緩沖體系。利用4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液配制濃度均為200×10-5M的KCl、NaCl、MgCl2、NiCl2、CuCl2、FeCl3、FeCl2、CaCl2、AgCl、ZnCl2溶液以及4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液參照組，并用移液槍分別將2mL含有不同金屬離子的溶液加入上述裝有熒光量子點的比色皿中，放入紅外熒光測試系統檢測其熒光強度。選擇激發波波長490nm，檢測發射波波長為1120nm。
(3)繪制不同金屬離子溶液熒光強度的柱形圖，如圖6所示，可以看出，除了鋅離子對探針的熒光強度有顯著增強效果外，其他金屬離子對探針的熒光產生抑制作用或無明顯影響。說明本發明的硫化銀熒光量子點探針具有很高的離子選擇性。
雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發明要求保護的范圍。
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