一種基于血紅蛋白?納米鈀?石墨烯復合材料的電化學生物傳感器件的制備及其應用研究的制作方法
本發明涉及電化學、電分析化學方面的化學修飾電極領域，以及電化學生物傳感器領域。
背景技術：
化學修飾電極的發展在制備方法、修飾劑的組成與類型、電極表面表征及電極過程理論等方面有了很大進步。化學修飾電極突破了傳統電化學方法只限于研究裸電極/電解液界面的范圍，開創了從化學形態上人為控制電極表面結構與功能的研究。隨著材料科學與技術的發展，各種新型材料修飾電極已成為電化學研究的熱點方向，功能化納米材料修飾電極也表現出特殊的功能和應用前景。
目前第三代電化學酶傳感器已得到較快發展，其原理是以無媒介體的氧化還原蛋白質和酶的直接電化學行為為基礎，利用酶與電極之間的直接電子轉移為檢測特征的新型生物傳感器，這種傳感器無需引入媒介體，與氧及其他電子媒介體無關，因此制作過程相對簡單，無外加有毒性物質，是當前最理想的生物傳感器。近年來以氧化還原蛋白質的直接電化學為基礎的第三代無媒介體傳感器因具有簡單便攜、靈敏度高、檢測范圍廣和檢測限低等優點，已被廣泛應用于電化學與電分析化學研究。氧化還原蛋白質的電活性中心大都被深埋在其結構內部，一般很難與基底電極間發生直接的電子傳遞，從而影響其直接電化學行為。由此科研工作者不斷創新設計了各種化學修飾電極來提高電極表面電子轉移速率。
納米材料具有高比表面積、優良的生物相容性以及高表面自由能等獨特性質，在化工催化、生物醫藥、電子信息等方面廣闊應用。石墨烯是繼納米碳管、富勒烯球后的又一重大發現，純凈的石墨烯是一種只有一個原子厚的結晶體，具有超薄、超堅固和超強導電性能等特性，石墨烯具有優異的電學、熱學和力學性能，在高性能納電子器件、復合材料、場發射材料、氣體傳感器及能量存儲等領域獲得廣泛應用。近年來石墨烯納米金屬復合材料已被合成和應用于不同領域。納米鈀是一種具有較高催化活性的貴金屬納米材料，常用于電化學、電池等領域。以石墨烯為載體將納米鈀復載于石墨烯表面構建的復合材料兼有三種材料的特性，表現出良好的協同作用。
技術實現要素：
本發明構建了一種新型第三代電化學酶傳感器克服了前兩代酶傳感器的諸多問題，例如線性范圍窄、受測定體系的限制、使用介體制作電極過程復雜，且介體有可能污染電極等。利用納米鈀-石墨烯（Pd-GR）復合材料為電子轉移催進劑，通過將血紅蛋白（Hb）固定在Pd-GR修飾電極表面，制備出一種新型電化學生物傳感器。
為了實現上述任務，本發明采取如下的技術解決方案：
一種基于納米鈀-石墨烯復合材料修飾電極的電化學生物傳感器件的制備，其特征在于，包括以下步驟：
（1）將石墨粉、1-己基吡啶六氟磷酸鹽（HPPF6）和液體石蠟按一定比例混合后研磨成碳糊，然后將所述的碳糊填入玻璃電極管中壓實，內嵌一根銅絲即可得到碳離子液體電極（CILE），使用前打磨至鏡面；
（2）修飾電極的制備
配制一定濃度的Pd-GR溶液，超聲分散均勻后將一定濃度的血紅蛋白（Hb）加入該溶液中得到血紅蛋白-納米鈀-石墨烯混合溶液（Hb-Pd-GR），震蕩混合均勻后采用滴涂的方式將此混合溶液修飾到CILE表面，室溫晾干后將Nafion滴涂到Hb-Pd-GR/CILE上表面，干燥后可制得相應的電化學生物傳感器件。用同樣的方法可以制備Nafion/CILE、Nafion/Pd-GR/CILE、Nafion/Hb/CILE等不同修飾電極。
所述的碳離子液體電極，其特征在于，離子液體為1-己基吡啶六氟磷酸鹽(HPPF6) 用量為0.8 g，石墨粉的用量為1.6 g，液體石蠟的用量為500 μL。
所述的修飾電極，其特征在于，修飾材料Pd-GR的用量和濃度分別為8.0 μL和1 .0 mg·mL-1；Hb的用量和濃度分別為8 .0 μL和15 mg·mL-1；Nafion的用量和質量分數分別為8.0 μL 和 0.5 %。
所述的修飾電極，利用掃描電子顯微鏡（SEM）表征電極表面修飾材料的微觀形貌結構。
所述的修飾電極，利用紫外可見吸收光譜（UV-vis）研究Hb是否保持生物活性。
所述的修飾電極，利用傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）研究Hb是否發生構象變化。
所述的納米鈀-石墨烯-血紅蛋白復合材料，采用循環伏安法（CV）考察了修飾電極上Hb的直接電化學行為。
所述Hb的直接電化學行為，其特征在于，電解質溶液為pH 3.0的磷酸鹽緩沖溶液，掃速為100 mV·s-1。
一種基于血紅蛋白-納米鈀-石墨烯修飾電極的電化學生物傳感器件的應用，在于利用所構建的生物傳感器對三氯乙酸（TCA）和亞硝酸鈉（NaNO2）進行電催化還原檢測。
根據上述的生物傳感器應用，其特征在于，以pH 3.0的PBS緩沖溶液為測試溶液，采用循環伏安技術測試生物傳感器的實際應用性能，掃速為100 mV·s-1。
附圖說明
圖1：Pd-GR納米復合材料的掃描電子顯微鏡表征。
圖2：（a）Hb水溶液和（b）Hb-Pd-GR混合溶液的紫外可見吸收光譜圖。
圖3：（a）Hb和（b）Hb-Pd-GR的傅里葉變換紅外光譜圖。
圖4：不同修飾電極的循環伏安圖（a）CILE;（b）Nafion/CILE;（c）Nafion/Pd-GR/CILE;（d）Nafion/Hb/CILE;（e）Nafion/Hb-Pd-GR/CILE（pH 3.0 PBS緩沖溶液，掃速為100 mV·s-1 ）。
圖5：修飾電極在不同濃度TCA存在下的循環伏安圖（a到j為3.0，7.0，14.0，20.0，28.0，36.0，44.0，52.0，60.0，68.0 mmol L-1）（插圖：還原峰電流與TCA濃度之間的關系曲線）。
圖6：修飾電極在不同濃度NaNO2存在下的循環伏安圖（a到i為0.04，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.7，0.9，1.1 mmol L-1）（插圖：還原峰電流與TCA濃度之間的關系曲線）。
具體實施方式
以下結合說明書附圖和具體優選的實施例對本發明作進一步描述，但并不因此而限制本發明的保護范圍。
實施例1
Pd-GR納米復合材料的掃描電子顯微鏡表征
圖1所示展示了在放大倍數為10000的Pd-GR納米復合材料的掃描電子顯微鏡表征圖。層狀結構為石墨烯的特征形貌，鈀納米粒子沉積、嵌插、包埋在層狀的石墨烯表面及內部。
實施例2
紫外可見吸收光譜分析
紫外可見吸收光譜法是一種用于檢測蛋白質的二級結構是否變化的常用手段，通過蛋白質Soret 吸收帶的位置是否發生遷移可以提供蛋白質的物理結構信息，如果蛋白質變性或其物理結構發生改變就會使其吸收帶發生遷移或消失。圖2呈現了Hb水溶液和Pd-GR-Hb混合溶液的UV-vis吸收光譜圖，Hb在水溶液中Soret吸收帶在405 nm（曲線a）和Hb-Pd-GR混合溶液中的Soret吸收帶405 nm（曲線b）完全相同，表明Hb在與Pd-GR復合材料混合后仍然保持原有的構像，沒有發生結構變化，這也進一步說明Hb在同Pd-GR復合材料混合的復合膜內依然保持原有的生物活性。
實施例3
紅外光譜分析
傳里葉變換紅外光譜（FT-IR）通過檢測蛋白質的酰胺Ⅰ和酰胺Ⅱ兩個吸收特征帶的變化來判斷其二級結構是否發生變化。蛋白質的肽段結構含有的C=O鍵伸縮振動引起酰胺I（1700-1600 cm-1）變動，N-H鍵彎曲振動和C-N鍵伸縮振動引起的酰胺Ⅱ（1620-1500 cm-1）的變動。如果蛋白質發生改變或變性,可能引起酰胺I和酰胺Ⅱ兩個吸收帶產生明顯位移甚至是消失不見。如圖3所示混有Pd-GR復合材料的Hb酰胺I和酰胺Ⅱ紅外吸收帶位置分別在1639 cm-1和1524 cm-1（b），而天然Hb的吸收帶分別為1647 cm-1和1543 cm-1（a）。從紅外光譜圖譜形的相似性可以認為Hb在與Pd-GR復合材料混合溶液中基本保持其原有構象。而酰胺I和酰胺Ⅱ的輕微位移可以看作是Hb與納米Pd-GR之間存在相互作用力，這種作用力可能是氧鍵作用或是靜電引力，這說明Pd-GR復合材料為Hb提供了有效的且生物相容性良好的微環境。
實施例4
Hb在修飾電極上的直接電化學
Nafion/Hb-Pd-GR/CILE在pH 3.0磷酸鹽緩沖溶液里的循環伏安曲線如圖4所示，在0.2~ - 0.8 V掃描范圍內電極CILE（曲線a）、Nafion/CILE （曲線b）和Nafion/Pd-GR/CILE（曲線c）上沒有出現特征的氧化還原峰，表明Nafion、Pd-GR、CILE均不存在電活性物質。在Nafion/Hb/CILE（曲線d）上出現一對明顯的氧化還原峰，氧化還原峰電位分別為 - 0.147 V和 - 0.214 V，峰電位差（?Ep）為67 mV，這是血紅素輔基Fe（III）/Fe（II）的特征峰。而在Nafion/Hb-Pd-GR/CILE（曲線e）上，氧化還原峰電位分別為 - 0.143 V和 - 0.214 V，?Ep為71 mV。Nafion/Hb-Pd-GR/CILE電極上循環伏安峰較其它類型電極峰型好并且峰電流顯著增加，這是由于納米鈀-石墨烯復合材料具有良好的生物相容性、高導電性和較大的比表面積，從而加速了電子的轉移速率。
實施例5
Hb修飾電極對TCA的電催化
實驗表明TCA的濃度為0.6 mmol·L-1以上在 -0.5 V處出現了新的還原峰，如圖5所示峰電流與TCA濃度在0.6 ~ 13.0 mmol·L-1和13.0 ~ 61.0 mmol·L-1范圍內呈良好的線性關系，線性回歸方程為Iss (μA)=1.067 C (mmol·L-1) + 0.193 (γ= 0.995)，Iss(μA)= 2.63 C (mmol·L-1) - 24.78 (γ= 0.997)。當TCA的濃度超過61.0 mmol·L-1之后，還原峰電流變化較小，表現出Michaelis-Menten動力學機制。根據Lineweaver-Burk方程的電化學形式利用雙倒數作圖法（1/Iss~1/[TCA]）求出催化反應中表觀米式常數KMapp為0.63 mmol·L-1，檢測限為0.35 μmol·L-1。表明納米鈀-石墨烯復合材料有著良好的生物相容性和導電性，這為Hb與底物TCA更好的反應提供了重要的媒介。
實施例6
Hb修飾電極對NaNO2的電催化
實驗表明當NaNO2濃度在0.04 mmol·L-1以上時，修飾電極在-0.6 V處出現了新的還原峰，如圖6所示當NaNO2濃度為0.04 ~ 0.5 mmol·L-1和0.5 ~ 0.75 mmol·L-1范圍內呈良好的線性關系，線性回歸方程為Iss(μA)= 71.02 C (mmol·L-1)+2.038 (γ= 0.995)，Iss(μA)= 27.27 C (mmol·L-1) + 22.19 (γ= 0.993)，根據Lineweaver-Burk方程的電化學形式利用雙倒數作圖法(1/Iss~1/[NaNO2])求出催化反應中表觀米式常數KMapp為2.75 μmol·L-1，檢測限為0.2 μmol·L-1。表明納米鈀-石墨烯復合材料有著良好的生物相容性和導電性，這為Hb與底物NaNO2更好的反應提供了重要的媒介。
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