本發明涉及體外診斷免疫檢測領域,具體地,本發明提供了一種谷氨酸脫羧酶抗體化學發光免疫檢測試劑盒及其制備方法。
背景技術:
谷氨酸脫羧酶(gad)是合成γ氨基丁酸(gaba)的限速酶,在胰島β細胞中與胰島素同處存在,同時分泌,具有自分泌和旁分泌信號調節β細胞合成及分泌胰島素的功能。谷氨酸脫羧酶抗體(gada)陽性患者中,一方面由于體內存在gada,gada與gad結合后影響了gaba的合成速度,干擾了胰島素合成及分泌的調節,使胰島β細跑的胰島素合成受到影響,導致體內循環中的胰島素不足,從而引起胰島素依賴的糖尿病。另一方面,機體產生的gada激發了t淋巴細胞而引起β細胞的破壞。
絕大多數1型糖尿病是由免疫介導的胰島β細胞破壞造成的。這種選擇性破壞與細胞免疫和體液免疫有關。除巨噬細胞、淋巴細胞浸潤外,胰島細胞抗體(ica)、谷氨酸脫羧酶抗體(gada)、胰島素自身抗體(iaa)可以預報1型糖尿病的發病。在諸多自身抗體中,gada出現早、持續時間長。在1型糖尿病診斷后3-5年,ica抗體滴度和檢出率顯著下降,10年后僅20%的病人陽性。相反,gada下降幅度小,1型糖尿病診斷10年后54%的病人仍能檢出gada。同時,與ica相比,gada測定簡單,費用低,易于標準化。因此采用靈敏度高的gada檢測,可以盡可能多的從高危人群中診斷出1型糖尿病患者。
成人晚發自身免疫性糖尿病(lada)發病初期,臨床特點與2型糖尿病很相似,但短短的數年內就依賴于胰島素治療,實質上為1型糖尿病,表現為低體重指數,ica及其他一些自身抗體陽性。gada作為lada診斷的免疫學指標,要優于ica。gada檢查有利于早期發現lada病人,加強隨診,早期予以胰島素治療,可以保護殘存的胰島β細胞功能,減少近期和遠期并發癥。
2型糖尿病是由胰島素抵抗和(或)相對缺乏造成的,并非免疫介導的胰島炎所致。故2型糖尿病患者gada陽性率低于1型糖尿病患者,在2型糖尿病中,最初即應用胰島素的病人及gada陰性的病人,其胰島素β細胞功能衰減幅度要低的多,高滴度的gada預示著更快的胰島β細胞功能衰竭。因此,糖尿病發病時gada的狀態是預測其臨床過程的理想指標,它可以將lada與2型糖尿病區分開來。綜上gada的檢測在糖尿病的預測,診斷及正確分型方面均具有重要價值。
臨床檢測谷氨酸脫羧酶抗體的常見方法有間接免疫熒光法、酶聯免疫吸附法,但這些方法都存在著一些不足之處。
一、間接免疫熒光法
該法的基本原理是用特異性的抗體與載玻片中的抗原結合后形成抗原抗體復合物,繼用熒光抗體與抗原抗體復合物結合,形成抗原抗體熒光復合物。在熒光顯微鏡下,根據復合物的發光情況來確定所檢測的抗體。該方法評價:由于結合在抗原抗體復合物上的熒光抗體增多,發出的熒光亮度強,因而其敏感性強。但是其不足也是明顯的:
(1)操作相對復雜,需要價格較昂貴的熒光顯微鏡,在很多基層醫院難以推廣,也不太適用于標本量較多的實驗室;
(2)熒光測定中的本底較高,只能進行定性檢測,熒光免疫技術用于定量測定有一定困難;
(3)結果判定需要有經驗的專業人員,分析結果的客觀性不足;
二、酶聯免疫吸附法
酶聯免疫吸附法(elisa)被廣泛應用,但該方法也存在著下述的不足之處:
(1)使用12×8型、6×8型、8×12型或整板型96孔專用微孔板作為抗原包被用具和反應容器,在使用時只能分成12批次、6批次、8批次或整板一次使用,無法進行獨立的、單人份的檢測;
(2)定量測定所用的試劑種類較多,每一種檢測試劑都要用試劑瓶來盛裝,并且每使用一種試劑時都需要更換吸液嘴來分別加注到微孔板的微孔中,不但試劑瓶種類多,加注試劑的操作也極為繁瑣;
(3)缺少對檢測信息的相應標注,只能通過查看試劑盒外包裝盒的標識才能了解或知悉檢測試劑的生產批號及有效期信息,而且所知悉的信息在檢測過程中不受控,具有很大的隨意性;
(4)檢測試劑在檢測過程中處于開放的空間,容易引起各種試劑之間的交叉污染而影響檢測結果的準確性;
(5)檢測過程多采用手工操作,試劑或樣本的加量不很精確,操作過程極為繁瑣和復雜,容易發生操作差錯,檢測結果的準確度和精密度較差。
技術實現要素:
目前谷氨酸脫羧酶抗體檢測技術存在以下缺點:檢測成本高、檢測靈敏度低、檢測線性范圍窄、重現性低、不能定量、操作復雜等。
本發明正是為了克服以上所述缺點,公開了一種檢測成本低、靈敏度高、檢測線性范圍廣、重現性高、可以定量、操作簡單的谷氨酸脫羧酶抗體試劑盒及其制備方法。本發明首先制備化學發光免疫分析試劑盒,主要包括:谷氨酸脫羧酶包被的磁微粒、谷氨酸脫羧酶包被的吖啶酯以及谷氨酸脫羧酶抗體定標品;然后利用全自動化學發光免疫分析儀對定標品進行檢測,繪制標準曲線,內置于電腦軟件,測試實際樣本,根據樣本發光值計算樣本濃度;最后對谷氨酸脫羧酶抗體全自動化學發光免疫分析系統進行性能(靈敏度、線性、精密度、干擾性)的評價。
本發明與目前技術相比,具有以下優點:
1、本發明選擇吖啶酯作為標記材料,并應用于化學發光免疫分析系統,該發光體系為直接化學發光,與傳統的酶促化學發光相比,該反應不需要酶的參與,更加節約成本;
2、本發明選用的吖啶酯化學發光免疫分析系統檢測靈敏度高,能夠達到0.11iu/ml,相比其它的谷氨酸脫羧酶抗體檢測方法靈敏度至少提高了10倍;
3、本發明選用的吖啶酯化學發光免疫分析系統線性范圍寬,能達到10-1500iu/ml,其它的谷氨酸脫羧酶抗體化學發檢測方法的檢線性范圍為20-1000iu/ml;
4、本發明選用的吖啶酯化學發光免疫分析系統重復性高,批內及批間差均在5%以內,這是其它化學發光免疫分析系統難以達到的;
5、本發明的化學發光免疫分析系統已實現樣本的定量,通過內置標準曲線到測試軟件,只需測試樣本就可直接得到樣本的濃度值;
6、本發明的化學發光免疫分析系統已實現全自動化,試劑及樣本的添加全有儀器完成,操作更加簡便,減少了人為的誤差。
附圖說明
圖1為實施例3得到的谷氨酸脫羧酶抗體標準曲線圖。
具體實施方式
實施例1:谷氨酸脫羧酶抗體化學發光免疫檢測試劑盒制備方法
(1)谷氨酸脫羧酶包被的納米磁珠制備:
取50mg羧基化的磁微粒(粒徑為0.05-1um)懸浮液,磁分離去上清,用0.02m,ph為5.5mes緩沖液重懸,加入0.5-2ml新配置的10mg/ml的edc水溶液,活化磁珠表面羧基,加入3-5mg谷氨酸脫羧,室溫下混懸2-10h,磁分離,去除上清,用含2%bsa的0.1mph為8.0的tris緩沖液重懸到1mg/ml,得到谷氨酸脫羧酶抗體單克隆抗體包被的磁微粒,每瓶5ml分裝保存于4℃備用。
(2)谷氨酸脫羧酶標記的吖啶酯的制備:
取50ul2.5mg/ml的谷氨酸脫羧酶,加入150ul0.1-0.2mph9.0-9.5的碳酸鹽緩沖液,混勻,然后加入1-2ul5mg/ml的吖啶酯混勻,室溫下避光反應,1-2h后取出,用2ml的zeba離心脫鹽柱脫鹽處理,脫鹽過程中首先分別用純凈水及tbs緩沖液進行處理,最后加入得到的谷氨酸脫羧酶記的吖啶酯溶液,收集離心管中的液體至保存管得到谷氨酸脫羧酶標記的吖啶酯,每瓶5ml分裝保存于4℃備用。
(3)谷氨酸脫羧酶抗體定標品的制備:
用標準品緩沖液(40mmtris-hcl,0.5%bsa,1%nacl,ph8.0)將谷氨酸脫羧酶抗體配置成濃度為5iu/ml、20iu/ml、100iu/ml、400iu/ml、800iu/ml、2000iu/ml,每瓶0.5ml分裝凍干,4℃保存備用。
(4)化學發光預激發液的配制:
量取1.0升純化水,依次加入80ul質量分數為20%的雙氧水(h2o2)、1.0克疊氮化鈉、1.5克吐溫20,搖勻后避光存放。
(5)化學發光激發液的配制:
量取1.0升純化水,依次加入0.6克氫氧化鈉、0.5克pc300、0.5g疊氮化鈉、1.5克tritonx-405,搖勻后避光存放。
實施例2:谷氨酸脫羧酶抗體化學發光免疫檢測方法:
本發明以全自動化學發光免疫分析儀為檢測工具,本發明的方法學模式為雙抗原夾心法,即儀器依次加入25ul的樣品、50ul的谷氨酸脫羧酶包被的磁微粒以及50ul的谷氨酸脫羧酶抗體包被的吖啶酯,反應10min后,進行磁分離,儀器將反應混合物送入暗室,依次加入50ul化學發光預激發液、50ul化學發光激發液進行發光反應,最后記錄發光強度,從標準曲線計算出被測樣品的谷氨酸脫羧酶抗體含量。
實施例3:谷氨酸脫羧酶抗體化學發光免疫檢測試劑盒性能評價
檢測曲線見附圖1。
分析靈敏度的檢測:
參照clsiep17-a文件推薦實驗方案,計算谷氨酸脫羧酶抗體化學發光免疫檢測試劑盒的分析靈敏度,求得的分析靈敏度為0.11iu/ml。
線性的檢測:
對濃度為5iu/ml、20iu/ml、100iu/ml、400iu/ml、800iu/ml、2000iu/ml標準品做線性分析,計算線性相關系數,r=0.9996,另外,該試劑盒對谷氨酸脫羧酶抗體樣品檢測的線性范圍為5-2000iu/ml。
精密度測定:
取濃度為20iu/ml和400iu/ml兩個谷氨酸脫羧酶抗體樣品,每個樣本每個濃度各做3個平行,用三批試劑盒進行檢測,計算試劑盒批內及批間差,結果表明該試劑盒批內及批間差均小于5%。
干擾性實驗:
取混合血清分別添加干擾物包括:膽紅素、血紅蛋白、抗壞血酸、甘油酯,添加比例按照1:20進行,分別測定混合血清及添加了各種干擾物后混合血清的測值,計算二者之間的偏差,以±10%為可接受范圍。結果表明,干擾性均達到nccls的文件標準,可用于臨床實驗室谷氨酸脫羧酶抗體準確評估。
實施例4:谷氨酸脫羧酶抗體化學發光免疫檢測試劑盒的分析靈敏度對比實驗分別用化學發光檢測方法和傳統的酶聯免疫吸附法對濃度為0iu/ml的樣本稀釋液進行檢測,重復測定20次,得出20次測量結果的rlu值(相對發光值),計算其平均值(m)和標準差(sd),得出m+2sd,將該發光值代入校準曲線計算得到相應的濃度值。采用化學發光檢測方法得到的濃度值為0.11iu/ml,相對于傳統的酶聯免疫吸附法分析靈敏度0.73iu/ml,提高了約7倍。