本發明涉及體外診斷免疫檢測領域，具體地，本發明提供了一種化學發光免疫檢測抗Jo-1抗體IgG試劑盒及其制備方法。
背景技術：
Jo-1 抗體是組氨酰-tRNA合成酶抗體中的一種，常見于多發性肌炎或皮肌炎（PM/DM）。多發性肌炎和皮肌炎是以四肢近端肌肉受累為主的系統性疾病。臨床研究發現，抗合成酶抗體的滴度和疾病的嚴重程度有密切關系，隨抗體滴度的增高而病情加重，病情緩解期滴度明顯下降。DM可累及成人和兒童，PM多在20歲以后發病，女性多于男性；PM/DM是當前醫療水平潛在的可治性疾病，故正確的認識和治療在臨床中非常重要。
原發性多發性肌炎是一種全身性疾病，通常隱襲起病，在數周、數月、數年內緩慢進展，病人可有晨僵、乏力、食欲不振、體重減輕、發熱、關節疼痛，少數病人有雷諾現象。該病的發病率每年可達到百萬人，男女發病率比例為1∶3，發病年齡多在10～14歲或45～50歲兩個階段。
臨床檢測抗Jo-1抗體 IgG的主要方法為酶聯免疫吸附法，但該方法存在著下述的不足之處：
（1） 使用12×8型、6×8型、8×12型或整板型96孔專用微孔板作為抗原包被用具和反應容器，在使用時只能分成12批次、6批次、8批次或整板一次使用，無法進行獨立的、單人份的檢測；
（2） 定量測定所用的試劑種類較多，每一種檢測試劑都要用試劑瓶來盛裝，并且每使用一種試劑時都需要更換吸液嘴來分別加注到微孔板的微孔中，不但試劑瓶種類多，加注試劑的操作也極為繁瑣；
（3） 缺少對檢測信息的相應標注，只能通過查看試劑盒外包裝盒的標識才能了解或知悉檢測試劑的生產批號及有效期信息，而且所知悉的信息在檢測過程中不受控，具有很大的隨意性；
（4） 檢測試劑在檢測過程中處于開放的空間，容易引起各種試劑之間的交叉污染而影響檢測結果的準確性；
（5） 檢測過程多采用手工操作，試劑或樣本的加量不很精確，操作過程極為繁瑣和復雜，容易發生操作差錯，檢測結果的準確度和精密度較差；
（6） 在檢測項目成套試劑的數量配置及使用上均為項目數×48/96人份，如果需要檢測10個項目，則試劑的配置及使用數須為10×48/96人份，如果只有一份樣本需要檢測10個不同的項目，也需要配置10×48/96人份的試劑，存在著不夠經濟合理的缺點。
技術實現要素：
目前抗Jo-1抗體IgG檢測技術存在以下缺點：檢測成本高、檢測靈敏度低、檢測線性范圍窄、重現性低、不能定量、操作復雜等。
本發明正是為了克服以上所述缺點，公開了一種檢測成本低、靈敏度高、檢測線性范圍廣、重現性高、可以定量、操作簡單的抗Jo-1抗體IgG試劑盒及其制備方法。本發明首先制備化學發光免疫分析試劑盒，主要包括：抗Jo-1抗體IgG單克隆抗體包被的磁顆粒、鼠抗人IgG標記的吖啶酯以及抗Jo-1抗體IgG定標品；然后利用全自動化學發光免疫分析儀對定標品進行檢測，繪制標準曲線，內置于電腦軟件，測試實際樣本，根據樣本發光值計算樣本濃度；最后對抗Jo-1抗體IgG全自動化學發光免疫分析系統進行性能（靈敏度、線性、精密度、干擾性）的評價。
本發明與目前技術相比，具有以下優點：
1、本發明選擇吖啶酯作為標記材料，并應用于化學發光免疫分析系統，該發光體系為直接化學發光，與傳統的酶促化學發光相比，該反應不需要酶的參與，更加節約成本；
2、本發明選用的吖啶酯化學發光免疫分析系統檢測靈敏度高，能夠達到0.2 AU/mL，相比其它的抗Jo-1抗體IgG檢測方法靈敏度至少提高了10倍；
3、本發明選用的吖啶酯化學發光免疫分析系統線性范圍寬，能達到3-190 AU/mL，其它的抗Jo-1抗體IgG化學發檢測方法的檢線性范圍為20-135 AU/mL；
4、本發明選用的吖啶酯化學發光免疫分析系統重復性高，批內及批間差均在5%以內，這是其它化學發光免疫分析系統難以達到的；
5、本發明的化學發光免疫分析系統已實現樣本的定量，通過內置標準曲線到測試軟件，只需測試樣本就可直接得到樣本的濃度值；
6、本發明的化學發光免疫分析系統已實現全自動化，試劑及樣本的添加全有儀器完成，操作更加簡便，減少了人為的誤差。
附圖說明
圖1為實施例3得到的抗Jo-1抗體IgG標準曲線圖。
具體實施方式
實施例1：抗Jo-1抗體IgG化學發光免疫檢測試劑盒制備方法
（1）抗Jo-1抗體IgG單克隆抗體包被的納米磁珠制備：
取50mg羧基化的磁微粒（粒徑為0.05-1um）懸浮液，磁分離去上清，用0.02 M，pH為5.5 MES緩沖液重懸，加入0.5-2mL新配置的10 mg/mL的EDC水溶液，活化磁珠表面羧基，加入3-5 mg 抗Jo-1抗體IgG單克隆抗體，室溫下混懸2-10 h，磁分離，去除上清，用含2% BSA 的0.1 M pH為8.0的Tris緩沖液重懸到1mg/mL，得到抗Jo-1抗體IgG單克隆抗體包被的磁顆粒，每瓶5mL分裝保存于4℃備用。
（2）鼠抗人IgG標記的吖啶酯的制備：
取50 uL 25mg/mL的鼠抗人IgG，加入150 uL 0.1-0.2 M pH 9.0-9.5的碳酸鹽緩沖液，混勻，然后加入1-2 uL 5 mg/mL的吖啶酯混勻，室溫下避光反應，1-2 h后取出，用2 mL的zeba離心脫鹽柱脫鹽處理，脫鹽過程中首先分別用純凈水及TBS緩沖液進行處理，最后加入得到的鼠抗人IgG標記的吖啶酯溶液，收集離心管中的液體至保存管得到鼠抗人IgG標記的吖啶酯，每瓶5 mL分裝保存于4℃備用。
（3）抗Jo-1抗體IgG定標品的制備：
用標準品緩沖液（40 mM Tris-HCl，0.5% BSA，1% NaCl，pH 8.0）將抗Jo-1抗體IgG配置成濃度為0.1 AU/mL、12.4 AU/mL、24.9 AU/mL、51.4 AU/mL、101.6 AU/mL、201.4 AU/mL ，每瓶0.5 mL分裝，4 ℃保存備用。
(4)化學發光預激發液的配制：
量取1.0升純化水，依次加入80uL質量分數為20%的雙氧水(H2O2)、1.0克疊氮化鈉、1.5克吐溫20，搖勻后避光存放。
(5)化學發光激發液的配制：
量取1.0升純化水，依次加入0.6克氫氧化鈉、0.5克PC300、0.5g疊氮化鈉、1.5克Triton 405，搖勻后避光存放。
實施例2：抗Jo-1抗體IgG化學發光免疫檢測方法：
本發明以全自動化學發光免疫分析儀為檢測工具，本發明的方法學模式為間接法，即儀器依次加入5 uL的樣品（1:20稀釋）、50 uL的抗Jo-1抗體IgG單克隆抗體包被的磁顆粒反應10 min后，清洗，加入100 uL的抗Jo-1抗體IgG測試稀釋液及50uL的鼠抗人IgG標記的吖啶酯，反應10 min后，進行磁分離，儀器將反應混合物送入暗室，依次加入50uL化學發光預激發液、50uL化學發光激發液進行發光反應，最后記錄發光強度，從標準曲線計算出被測樣品的 抗Jo-1抗體IgG含量。
實施例3：抗Jo-1抗體IgG化學發光免疫檢測試劑盒性能評價
檢測曲線見附圖1。
靈敏度的檢測：
參照CLSI EP17-A 文件推薦實驗方案，計算抗Jo-1抗體IgG化學發光免疫層析試劑盒的靈敏度，求得的靈敏度為0.2AU/ mL。
線性的檢測：
對濃度為12.4 AU/mL、24.9 AU/mL、51.4 AU/mL、101.6 AU/mL、201.4 AU/mL 標準品做線性分析，計算線性相關系數，r=0.9996，另外，該試劑盒對抗Jo-1抗體IgG樣品檢測的線性范圍為3-190 AU/mL。
精密度測定：
取濃度為52.2 AU/mL及113.1AU/mL兩個抗Jo-1抗體IgG樣品，每個樣本每個濃度各做3個平行，用三批試劑盒進行檢測，計算試劑盒批內及批間差，結果表明該試劑盒批內及批間差均小于5%。
干擾性實驗：
取混合血清分別添加干擾物包括： 結合膽紅素、游離膽紅素、血紅蛋白、抗壞血酸、甘油酯，添加比例按照 1: 20 進行，分別測定混合血清及添加了各種干擾物后混合血清的測值，計算二者之間的偏差，以 ±10%為可接受范圍。結果表明，干擾性均達到 NCCLS 的文件標準，可用于臨床實驗室抗Jo-1抗體IgG狀況的準確評估。
實施例4:抗Jo-1抗體IgG化學發光免疫檢測試劑盒的靈敏度對比實驗
分別用化學發光檢測方法和傳統的酶聯免疫吸附法對濃度為0AU/mL的校準品或樣本稀釋液為樣本進行檢測，重復測定20次，得出20次測量結果的RLU值（相對發光值），計算其平均值（M）和標準差（SD），得出M+2SD，將該發光值代入校準曲線計算得到相應的濃度值。采用化學發光檢測方法得到的濃度值為0.2AU/mL，相對于傳統的酶聯免疫吸附法最低檢測限2.4AU/mL，提高了約12倍。