一種腎陽虛證動物模型生物標志物的篩選及確定方法與流程

本發明屬于基礎研究領域，具體涉及一種腎陽虛證動物模型生物標志物的篩選及確定方法。

背景技術：

“證”是中醫學理論體系的核心，中醫臨床首重辨證論治，但辨證很大程度上受醫家自身（如對中醫藥知識的理解、臨床經驗等）及患者主觀因素的影響，難以客觀化和定量化，造成辨證結果不統一，影響治法的確立、選方用藥及臨床療效的評價，阻礙中醫學的研究及發展。中醫基礎研究中采用動物模型可以模擬疾病的真實過程，與“證”的生理和病理狀態相似，因此借助腎陽虛證動物模型是研究腎虛證實質的必由之路。

本實驗采用氫化可的松肌肉注射所模擬出的腎陽虛證模型大鼠的癥狀、體征和血清cAMP、cGMP含量檢測及cAMP/cGMP比值結果符合目前常用的腎陽虛證模型的鑒定要求，表明本研究的腎陽虛模型制作是成功的，但以上評價方法以主觀評價為主，評價指標缺乏特異性、客觀性，研究結果能否科學闡明中醫“證”的實質以及所復制的動物證候模型是否具有代表性，同樣涉及辨證的客觀化和定量化的問題。因此尋找具有一定特異性的客觀指標來判別鑒定腎陽虛模型是否成功，是進行后續相關實驗的關鍵。

基于中醫“腎主骨”的理論，骨組織作為“腎”功能的外在表現部位之一，其內在生物學特征的變化與“腎”的功能狀態必然存在著密切聯系。蛋白質是體現組織細胞功能與執行生命活動最直接的活性物質，骨組織的結構與功能狀態最終體現于其內在功能蛋白質組和基因組的表達狀態。隨著對疾病中醫“證”與蛋白質組相關研究的深入，目前已經認識到：中醫“證”的表現實質是疾病個體特定的功能蛋白質組及其基因組的表達水平；疾病不同中醫證型之間區別的實質是功能蛋白質組及其基因組表達水平的差異。因此，通過對骨組織差異蛋白質組表達水平的檢測，有望從骨組織功能蛋白質組層面上進一步揭示中醫腎陽虛證候的實質。

基于以上理論基礎與研究背景，本研究借助于蛋白質組學研究思路和技術上的優勢，以大鼠的骨組織（松質骨）為研究對象，分別展示它們在腎陽虛與正常狀態下松質骨的蛋白質組圖譜，比較它們之間存在的差異表達蛋白質，從松質骨功能蛋白質組層面深入探討中醫腎陽虛證的實質，進一步深化對中醫“腎”與骨內在關聯的認識。同時，這些差異表達的蛋白質可能在腎陽虛證發生發展過程中發揮重要作用，可能是腎陽虛證診斷的潛在生物標志物。由于生物標記物的發現是冗長而又繁雜的過程，需借助多種實驗技術，從多層面多角度反復鑒定、驗證及確認。故對于初步篩選的差異蛋白，我們需要從蛋白水平、基因水平進一步對靶定蛋白進行驗證，以規避單一實驗方法的局限，保證前期蛋白質組學檢驗結果的準確性。如何選取感興趣的候選蛋白，對其進一步研究，探討其與腎陽虛證的密切聯系，并同時證明本生物標志物篩選方法的可行性是本研究的重點。

當今科技正步入云媒體、大數據的時代，各種信息蜂擁而至，經云計算、大數據挖掘，一些功能強大、內容豐富、更新頻繁的在線蛋白質相互作用數據庫(PPI Database)應運而生，已成為研究預測蛋白質功能重要手段之一。本部分研究利用免費在線PPI Database –String10對前期所鑒定出已知蛋白進行系統綜合分析，篩選候選蛋白作進一步研究。該數據庫覆蓋面廣、整合度高、更新頻率快，并能對蛋白質之間直接和間接相互作用的關系能做出一定的預測，從而可初步在生物信息學層面對所鑒定的差異蛋白在疾病中的作用進行預測，為對后續的驗證性研究提供思路。借助于String數據庫檢索提供的生物學信息提示，同時我們查閱相關文獻結合前期研究結果，我們推測腎陽虛證癥狀和體征的改變可能與某幾個關鍵差異蛋白所在蛋白調控網絡的調控密切相關。因此我們挑選了Ⅰ型膠原α-1鏈和GDP解離抑制因子1作為驗證對象。

此外，在基礎實驗中，動物模型的骨骼標本不易獲取，相對而言血標本獲取較為便捷且容易保存。血液檢測已是臨床上預防和診治疾病最普遍的輔助手段之一。血液幾乎涵蓋來自機體各器官組織的蛋白，既然在腎陽虛與正常大鼠骨組織（松質骨）之間存在差異蛋白質，那么在血液中是否也存在這種差異。鑒于此，我們還試圖抽取兩組實驗大鼠血液測定相應蛋白質的含量，并分析其濃度與骨組織（松質骨）相應蛋白表達水平的一致性，參照臨床上的“醫學參考值范圍”的定義：將腎陽虛大鼠模型的ELISA測定結果與正常組大鼠的數值進行比較，觀察測定值是否超出了正常大鼠相應指標的波動范圍，我們選用正態分布資料雙側95%參考值范圍的公式（±1.96S）計算出正常組大鼠血清中相應蛋白含量的波動范圍，作為判別測定結果的重要參考，探尋腎陽虛證診斷的潛在血液標志物。

基于以上所述，本研究以大鼠的骨組織（松質骨）為研究對象，在前期蛋白質組學實驗基礎上，選取在腎陽虛證發生發展過程中可能起到重要作用的差異蛋白質，使用Western-Blot和RT-PCR技術從蛋白及基因水平進行雙重驗證，進一步明確腎陽虛證的骨組織（松質骨）差異蛋白質。同時，采用ELISA測定相應蛋白在腎陽虛證與正常大鼠的血液中含量，為基礎實驗中腎陽虛證模型的評價奠定研究基礎。

技術實現要素：

本發明的目的是為克服目前腎陽虛證辨證技術未客觀化的不足，應用雙向凝膠電泳（2DE）及MALDI-TOF/MS技術，獲取腎陽虛證及正常組大鼠骨組織蛋白圖譜，經質譜分析及鑒定，篩選出松質骨中存在差異表達的蛋白，并且選取可能在腎陽虛證發生發展過程中發揮重要作用的部分蛋白進行Western-Blot和RT-PCR技術從蛋白及基因水平雙重驗證，并結合血清中相關蛋白的ELISA檢測，最終靶定可以成為腎陽虛證動物模型的潛在生物標志物。

為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

一種腎陽虛證動物模型生物標志物的篩選及方法，其具體步驟如下：

（1）腎陽虛證大鼠模型的建立；用于構建動物模型的大鼠為WISTAR大鼠。

（2）差異蛋白的篩選。具體包括如下步驟：

a)大鼠松質骨總蛋白的提取；

b)測定蛋白濃度；

c)雙向凝膠電泳分析；

d)凝膠蛋白點的檢測與差異蛋白點顯示分析；

e)差異蛋白的MALDI-TOF-MS質譜分析；

f)蛋白質數據庫檢索及鑒定，確定差異蛋白。

（3）部分差異蛋白的驗證。具體采用以下兩種方法進行差異蛋白的驗證：

a)應用Western-Blot方法從蛋白質水平對標志物進行驗證；

b)應用RT-PCR方法從基因水平對標志物進行驗證。

（4）腎陽虛證動物模型生物標志物的確定。其確定方法為：將血清蛋白的ELISA檢測結果與Western-Blot、RT-PCR檢測對比分析，選取表達趨勢一致且在正常值范圍之外的差異蛋白作為生物標志物。

較之現有技術而言，本發明的優點在于：

（1）根據中醫“腎主骨”理論，以腎陽虛證狀態下骨組織作為研究對象，采用蛋白組學等先進研究方法，深化了對“腎主骨”理論的科學認識。

（2）本發明建立在完整的蛋白組學方法基礎之上，經過反復驗證和篩選，挑選出的待測蛋白能反應腎陽虛證的病理本質。

（3）血液涵蓋了幾乎來自全身機體組織的蛋白質，因此血液檢測是臨床上最普遍的輔助診療手段之一；而ELISA技術可直接用于檢測體液中大分子抗原和特異性抗體等，具有快速、靈敏、簡便、載體易于標準化等優點。本發明將二者有機結合，篩選出的腎陽虛證的標志蛋白，可應用ELISA方法檢測其在血液中含量，并運用正態分布資料雙側95%參考值范圍的公式（±1.96S）計算出正常組大鼠血清中相應蛋白含量的波動范圍，作為判別測定結果的重要參考，因此可十分簡便高效地對實驗動物腎陽虛的狀態進行判斷，篩選符合需求的動物模型。

（4）本發明可以進一步推動中醫診斷的便捷、客觀化，促進基礎實驗中動物模型的科學評定。

附圖說明

圖1正常組-腎陽虛組大鼠股骨干松質骨差異蛋白點標識。

圖2 GDP解離抑制因子1（Arhgdia）的MAIDI-TOF-TOF/MS質譜圖。

圖3 Ⅰ型膠原α-1鏈（Col1a1）的MAIDI-TOF-TOF/MS質譜圖。

圖4正常組-腎陽虛組大鼠松質骨中Col1a1和Arhgdia 蛋白表達的比較。

圖5正常組-腎陽虛組大鼠松質骨中Col1a1 mRNA表達的比較。

圖6正常組-腎陽虛組大鼠松質骨中Arhgdia mRNA表達的比較。

圖7正常組-腎陽虛組大鼠血清中Col1a1和Arhgdia含量表達的比較。

具體實施方式

下面結合實施例對本發明內容進行詳細說明：

實施例一：

腎陽虛證模型大鼠的建立和鑒定：

1 實驗耗材

1.1 實驗動物

雄性3月齡健康SPF（Specific Pathogen Free）級WISTAR大鼠共40只，體重200~240 g，由福建中醫藥大學實驗動物中心代購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司，實驗動物許可證號：SCXK（滬）2012-0002，實驗動物質量合格證編號：2007000548015。福建中醫藥大學實驗動物中心實驗動物使用許可證號：SYXK（閩）2014-0001。

1.2 主要試劑及藥物

表1 主要試劑及藥物

1.3 主要儀器

表2 主要儀器

2 實驗方法

2.1 動物分組

40只WISTAR大鼠適應性喂養一周，采用隨機數字表法分為正常組、腎陽虛組，每組20只。腎陽虛大鼠連續造模15 d后，模型穩定觀察21 d，兩組大鼠均正常飼養。

2.2 腎陽虛證大鼠模型造模方法

2.2. 1 腎陽虛證大鼠模型

氫化可的松注射液充分混勻后，按照2.5 mg／100g比例于大鼠后肢肌肉注射，每日1次，正常飲食、飲水，連續15d。

2.3 大鼠模型鑒定及模型穩定性觀察方法

2.3.1一般狀態觀察

觀察模型大鼠一般狀態、日常活動、精神狀態、反應靈敏、弓背情況，毛發爪甲色澤，糞便質地等方面并記錄大鼠體重與體溫的變化。

2.3.2大鼠血清中環核苷酸系統的變化檢測

造模結束時，取腎陽虛及正常組大鼠，乙醚麻醉后，眶后靜脈叢進行采血1-1.5 ml。4℃冰箱放置4 h后，2000 rpm離心10 min取上清，使用cAMP和cGMP ELISA試劑盒檢測大鼠血清中cAMP、cGMP含量。具體操作步驟按試劑盒說明書操作。

造模結束后21 d，腹主動脈采血3~5 ml。具體檢測方法同造模結束時。

2.4 松質骨標本的獲取

造模結束后21 d，取腎陽虛模型穩定大鼠及正常大鼠，腹腔麻醉，放血處死，在冰上快速切取各組大鼠雙側股骨髁，對半剖開股骨髁，刮匙刮取松質骨，放入5 ml EP管，標記后置于液氮罐中，快速轉存于-80℃冰箱，備用。

實施例二：

差異蛋白的篩選，它包括以下步驟：

1.松質骨總蛋白的提取

①將冰凍新鮮股骨干用骨剪剪開，用超純水將骨髓沖洗干凈，并用刮匙將股骨干松質骨輕輕刮入研缽（提前液氮預冷）中，往研缽中加入液氮并迅速研磨粉碎，重復研磨3～5次，取粉末并稱取質量，然后按照1 g骨組織加1.8 mL裂解液的比例加入蛋白樣品裂解液，置于4℃冰箱裂解提取蛋白4 h（每隔1h充分混勻1次）；②將盛有骨組織混懸液的EP管置于低溫高速離心機中，4℃ 100000 rpm離心1 h，吸取上清液；③加核酸酶：每1 ml裂解液加入2 ul Dnase和2 ul Rnase，冰上放置15 min；④超聲：用超聲清洗儀超聲致液體不黏稠為止。然后置低溫高速離心機中，4℃ 100000 rpm離心30 min，吸取上清液；⑤2-D clean-up試劑盒提純濃縮蛋白。

2 Bradford法測定蛋白濃度并計算上樣蛋白體積

參照Bio-Rad公司Bradford蛋白定量試劑盒操作說明書操作，按照蛋白上樣總質量為2500 ug計算所需蛋白樣本體積為：2500ug/蛋白濃度。

表3 蛋白定量標準曲線上樣體系

3.雙向凝膠電泳

雙向電泳主要參照美國Bio-Rad公司的2-DE操作指南進行操作。

3.1上樣量及電泳條件 吸取（2500ug/蛋白濃度）蛋白樣本與適量水化上樣緩沖液充分混合，總體積為380 ul。膠條在20℃，50 V低電壓條件下泡脹12 h后，進行等電聚焦。泡脹和等電聚焦參數見表4。

表4 IEF參數設置

3.2灌制12%的垂直板SDS-PAGE凝膠 按表5中配方比例配制凝膠溶液。

表5 12%SDS-PAGE凝膠配方

3.3膠條平衡 分別在膠條平衡緩沖液、中平衡潤洗15分鐘，濾干并轉移至二向凝膠上。

3.4第二向SDS-PAGE凝膠電泳

設置循環水溫度10℃進行SDS-PAGE，電泳條件為：接通電源，起初以100 V的恒電壓40 min，后換用300 V恒電壓4.5 h進行電泳，當溴酚藍跑至距凝膠底部約1 cm處時停止電泳。

4.凝膠染色與掃描顯示

電泳結束后取出凝膠，并作好標記。考馬斯亮藍染色后用Image Scanner掃描儀獲取2-DE凝膠圖片。

5.凝膠蛋白點的檢測與差異蛋白點顯示分析

利用Bio-Rad公司提供的PD Quest 8.0分析軟件進行骨組織（松質骨）雙向電泳凝膠圖譜蛋白點檢測及差異蛋白點顯示分析。設置faint spot、small spot和large spot三個參數并去除背景及橫縱條紋等進行蛋白點的自動檢測。待檢測完畢后，設置點的匹配分析參數，以點的體積作為蛋白點含量的測量值，設定蛋白點相對標準化體積變化達1.5倍以上作為差異蛋白點的匹配分析的基本參數并設置t檢驗達99%為有統計學意義。初步匹配完成后，進行手動人工校正，對每個匹配的蛋白點進行放大觀察，以排除一些非真實的蛋白點。

6.質譜樣品制備及差異蛋白的MALDI-TOF-MS質譜分析

將差異蛋白點手動切膠，酶解，除鹽點樣后進行基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（MALDI-TOF-MS）技術定性各組間松質骨差異表達的蛋白質，并通過生物信息學檢索對差異表達蛋白的功能進行初步分析。

7.蛋白質數據庫檢索及鑒定

使用MASCOT（V3.2，Matrix Science，London，U.K）搜庫軟件對每個差異蛋白樣品的一級和二級質譜數據進行蛋白質數據庫檢索并鑒定蛋白質。

8 蛋白質相關功能的生物信息學檢索

在Uniprot及NCBI蛋白質數據庫中查找質譜鑒定得到的已知蛋白的相關信息，包括蛋白的基因名稱、蛋白家族、氨基酸序列、主要功能等。

實施例三：

Western Blot和RT-PCR技術從蛋白及基因水平雙重驗證，它包括以下步驟：

1.各組大鼠股骨干松質骨相關蛋白的Western Blot的檢測

1.1松質骨總蛋白的提取

從﹣80℃冰柜中每組隨機抽取8只大鼠股骨干松質骨取出，置于冰上，迅速用咬骨鉗將骨組織剪碎，放入事先預冷的研磨器中，迅速研磨至粉末狀，研磨過程中適時加入液氮冷卻，然后轉移至Eppendorf管中，稱取重量；按比例1 g骨組織加1 ml裂解液，微型渦旋器震蕩5 s，而后置于4 ℃冰箱，每隔30 min渦旋震蕩一次，4 h后取出；轉入低溫高速離心機中，設置程序4 ℃，14000 rpm，離心20 min，吸取上清液。

1.2 BCA法測定蛋白濃度

（1）配制蛋白標準溶品（25 mg/ml）：將0.8 ml蛋白標準配制液加入20 mg 牛血清蛋白（BSA）完全溶解后，分裝備用；

（2）稀釋蛋白標準品（0.5 mg/ml）：取適量配置好的蛋白標準品（25 mg/ml），用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）將其稀釋至0.5 mg/ml濃度；

（3）配制BCA工作液：根據所需樣品的數量，將BCA試劑A液、B液按50:1比例，充分渦旋混勻；

（4）按0，1，2，4，8，12，16，20 μl將標準品（0.5 mg/ml）依次加到96孔板蛋白標準品孔中，每孔補足PBS緩沖液至20 μl；

（5）加適當蛋白樣品，用PBS緩沖液稀釋5倍、10倍、20倍，每孔補足至20 μl；

（6）各孔均加入200 μl BCA工作液；

（7）37 ℃孵育30 min；

（8）測定波長570 nm，讀取吸光度（OD）值；

（9）依據標準曲線計算出樣品的蛋白濃度。

1.3松質骨總蛋白變性

取適量蛋白樣品按5:1比例和SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（6×）渦旋混勻，置恒溫金屬浴100 ℃ 5 min，變性后迅速置于冰上冷卻，存于-80 ℃冰箱備用。

1.4溶液的配制

（1）裂解液 取適量RIPA裂解液和PMSF（l00 mM）按99:1比例混合均勻，使PMSF的最終濃度為1 mM，冰上保存待用。

（2）電泳液 將5×的電泳液用超純水稀釋5倍，配成1×的電泳液。

（3）10%過硫酸銨 0.1 g過硫酸銨加超純水定容至1 ml，完全溶解混勻，現配現用；

（4）TBST洗滌液 將50 ml TBS（20×）和1 ml吐溫一起置于燒杯中混勻，用超純水定容至1 L，充分混勻，4 ℃冰箱保存備用。

（5）BeyoECL Plus工作液 按1:1比例分別取適量BeyoECL Plus A液和B液混勻，現配現用，操作時避光。

1.5 SDS-PAGE凝膠配制

按照表6依序加入相應體積的凝膠試劑，室溫下凝固約20 min后，置于電泳液中存于4 ℃冰箱備用，一般提前一天配制SDS-PAGE凝膠。

表6 SDS-PAGE凝膠配制所需各成分體積（ml）

1.6上樣 根據BCA測定的樣品濃度，按每孔30 ug的加樣量計算出樣品所需上樣體積，依次將待測蛋白緩慢勻速加樣，并加入標準品Marker 4 ul。未上樣的邊緣孔加上SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（1×）10 ul。

1.7蛋白電泳 蓋上電極蓋，接通電源，初始以恒壓20 V跑10 min確保孔道中漂浮的蛋白下沉，再以恒壓60 V跑20 min，最后以80 V跑100 min，待溴酚藍染料到達膠的底部，停止電泳。

1.8半干轉 在恒定電壓25 V下根據膜面積設定電流，整塊膠限制電流1.3 A，1條膠時電流0.7 A。根據目的蛋白分子量調整轉膜時長（見表7）；轉膜結束后，將膠置于考馬斯亮藍染液染中搖床過夜，第二天將其脫色至透明，檢查蛋白是否完全轉移。

表7目的蛋白轉膜時長

1.9膜的封閉 轉膜結束后，用鑷子夾marker處，取出PVDF膜標記好正面，用超純水漂洗5 min ×3次，將PVDF膜放入裝有5 ml封閉液的自封袋中，置于室溫，水平搖床孵育2 h。

1.10一抗孵育 根據說明書見表8的一抗稀釋倍數，用WB一抗稀釋液稀釋一抗，稀釋后總體積約為5 ml，將封閉后的PVDF膜置于含有一抗工作液的自封袋中，在水平搖床上4℃孵育過夜。

表8 抗體稀釋倍數

1.11二抗孵育 一抗孵育結束后，將膜放入裝有TBST的洗膜盒中，在室溫下水平搖床上漂洗5 min×3次；洗膜結束后，根據一抗來源配制相應二抗工作液，將膜置于二抗工作液中，在水平搖床上緩慢搖動、室溫孵育1 h。

1.12ECL化學發光檢測 二抗孵育結束后用TBST漂洗濾膜5 min×3次，洗去未結合的二抗。避光配制BeyoECL Plus工作液（A液：B液=1：1），充分混勻，在化學發光成像儀上將膜覆于顯影墊片上，用濾紙將多余液體吸干，用滾軸去除膜下氣泡，將顯影液均勻滴于膜上，在室溫中待膜與之反應1 min后顯影。

1.13定量分析 采用Bio-Rad image lab 3.0軟件分析蛋白條帶，計算各組目的蛋白與相應β-actin蛋白顯色積分的光密度比值，即各目的蛋白相對表達量。

2.各組大鼠股骨干松質骨相關蛋白的基因檢測

2.1骨組織處理 骨組織研磨至粉末狀過程同蛋白提取，迅速用1.5 ml無RNA酶Eppendorf管（以下Eppendorf管均為無RNA酶）沿缽底將骨粉摳出，稱取約100 mg。

2.2用Trizol法提取總RNA

2.3總RNA濃度檢測 在超微量核酸蛋白測定儀主畫面點選Nucleic Acid，調零后，加1 μl待測樣品于偵測臺上，測定260/280 nm的吸光度比值，得出所提取RNA的濃度。

2.4逆轉錄反應（Reverse Transcription，RT） 根據以上所測得總核糖核酸的濃度，計算出2 μg 總核糖核酸所需的上樣體積V_RNA，按表9體系配制逆轉錄反應體系；于42 ℃下反應2 min。設置逆轉錄步驟：25℃ 10min，50℃下反應30min，85℃滅火5min，靜置于4℃下。

表9逆轉錄反應體系

2.5引物的設計與合成

本實驗所用目的基因引物、GAPDH RT-PCR引物合成均由上海生工生物工程股份有限公司設計合成（表10）。

表 10 實驗相關引物列表

2.6聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction PCR） 嚴格按照PCR試劑盒說明書操作，將以上反應得到的cDNA用來配制PCR擴增體系（表11）。

表11 PCR擴增體系

注：2×AceTaqMaster Mix中包含Taq^TMDNA聚合酶、MgCl₂、dNTPs、反應緩沖液

將配制好的反應體系混勻離心后放入基因擴增儀中，按以下反應條件設置反應參數：94℃預變性3min；94℃變性30s，退火30s（各體系退火溫度為所加引物的退火溫度），72℃延伸60s，35個循環；72℃終延伸10min，4℃下保存。

2.7瓊脂糖凝膠電泳 取PCR產物各3 μl進行瓊脂糖凝膠電泳，電泳條件為90 V，15 min；電泳后染色并采用GEL DOC 2000凝膠成像系統Quantity One 465軟件分析圖像，得到相應蛋白表達的光密度值與對應內參照基因（GAPDH）光密度值的比值。

實施例四：

ELISA測定相關蛋白在正常與腎陽虛大鼠的血液中含量，包括以下步驟：

1.各組大鼠血清的制備

各組大鼠血清制備，同造模結束后21 d。見實施例一2.3.2。

2.各組大鼠血清中相關蛋白含量的檢測

2.1.ELISA法主要試劑的配制：按照ELISA試劑盒說明書操作。

2.2.ELISA檢測方法

（1）加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40 μl，然后再加待測樣品10 μl（樣品最終稀釋度為5倍）加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻；

（2）溫育：用封板膜封板后置溫育箱靜置37 ℃ 40 min；

（3）洗板：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，如此重復5次，向濾紙上印干；

（4）加酶：每孔均加入酶標試劑50 μl，除空白孔外；

（5）溫育：方法同（2）；

（6）洗板：方法同（3）；

（7）顯色：每孔均先后加入顯色A、顯色B各50 μl，輕輕震蕩混勻，靜置于溫箱37 ℃ 避光孵育，顯色15 min；

（8）終止：每孔均加入終止液50 μl，此時顏色轉變由藍轉黃，終止反應；

（9）測定：以空白調零，測定波長450 nm，讀取吸光度值。應在加終止液后15 min以內完成。

實施例五：

通過上述實驗進行反復驗證，將血清蛋白的ELISA檢測結果與Western-Blot、RT-PCR檢測結果對比分析，選取表達趨勢一致且在正常值范圍之外的差異蛋白差異蛋白作為腎陽虛證生物標志物。

上述試驗可得如下實驗結果：

1.動物模型的建立及鑒定結果

造模結束后21d內，腎陽虛組3只大鼠由于體質過于虛弱，采食及飲水量不足等因素，耗竭而亡。所以最后正常組數量不變，腎陽虛組余17只。造模結束后21d，與正常組大鼠比較，腎陽虛組大鼠依舊耳廓爪甲無血色，喜弓背蜷曲、扎堆，活動量少，便溏，體重減輕，體溫降低，血清cAMP含量及cAMP/cGMP比值均下降。以上癥狀、體征和血清cAMP及cAMP/cGMP比值結果均符合腎陽虛證模型的鑒定要求，提示本實驗動物造模是成功的。

2.差異蛋白篩選結果

2.1凝膠蛋白點差異的辨識與分析

2.1.1凝膠蛋白點的檢測 通過Bio-Rad公司PDQuest軟件分析，各凝膠蛋白圖譜可辨識的蛋白點均為560個。

2.1.2凝膠蛋白點差異的辨識與分析 通過對正常組與腎陽虛組骨組織（松質骨）蛋白質組雙向電泳凝膠圖譜比較分析，檢測到29個明顯差異表達的蛋白質點，以正常組為參考，標記出差異表達的蛋白質點，點3、7均為下調表達蛋白（見圖1）。

2.2差異蛋白的MALDI-TOF-MS質譜鑒定

將29個差異表達蛋白質點從凝膠上手工切下，經胰蛋白酶酶解消化后進行MALDI-TOF-MS質譜分析。獲得的肽質量指紋圖譜信號強且基線較平穩，噪音低，適于進行數據庫檢索。以下列舉部分肽段的MS和MS/MS質譜圖信息（見圖2，3），使用MASCOT搜庫軟件進行蛋白質鑒定，表12為質譜鑒定的部分蛋白點相關信息，包括蛋白質的登記編碼、種類、等電點、分子量、得分。

表12 部分差異蛋白點MALDI-TOF-MS鑒定結果

2.3差異蛋白相關功能的生物信息學檢索

將質譜鑒定確立的差異蛋白質名稱輸入UniProt及NCBI蛋白質數據庫中進行蛋白相關功能的生物信息學檢索，結果詳見表13。借助String數據庫檢索提供的生物學信息提示，同時我們查閱相關文獻結合研究結果，我們推測腎陽虛證癥狀體征的改變可能與GDP解離抑制因子1、Ⅰ型膠原α-1鏈有關。

表13 部分蛋白質相關功能的生物信息學檢索結果

3.正常組-腎陽虛組大鼠股骨松質骨中Colla1和Arhgdia蛋白表達的檢測

3.1 Western bolt檢測顯示：與正常組比較，腎陽虛組Colla1表達降低，有顯著性差異（P＜0.05）；與正常組比較，腎陽虛組Arhgdia表達降低，有顯著性差異（P＜0.05）。見表14，圖4。

表14兩組大鼠松質骨中Col1a1和Arhgdia蛋白表達的比較（±S）

注：與正常組比較，a P＜0.05。

3.2 正常組-腎陽虛組大鼠股骨干松質骨Col1a1和Arhgdia mRNA表達的檢測

兩組均可見Colla1的mRNA的表達。與正常組比較，腎陽虛組大鼠Colla1表達下降，有顯著性差異(P＜0.05)；與正常組比較，腎陽虛大鼠Arhgdia表達下降，有顯著性差異(P＜0.05)。見表15，圖5、6。

表15 兩組大鼠松質骨中Col1a1和Arhgdia mRNA表達的比較（±S）

注：與正常組比較，a P＜0.05。

3.3 正常組-腎陽虛組大鼠血清中Col1a1和Arhgdia含量的檢測

ELISA方法檢測正常組及腎陽虛組大鼠血清中Colla1含量測定情況顯示：兩組均可檢測定出Colla1的表達。與正常組比較，腎陽虛大鼠Colla1表達下降，有顯著性差異(P＜0.05) ；與正常組比較，腎陽虛大鼠Arhgdia表達下降，有顯著性差異(P＜0.05)。見表16，圖7。

表16 兩組大鼠血液中Col1a1和Arhgdia 蛋白表達的比較（±S）

注：與正常組比較，a P＜0.05。

3.4 正常組大鼠血清中Col1a1、Arhgdia含量的參考值范圍

根據正常組中三個蛋白的ELISA檢測結果，我們計算出參考值范圍。見表17。

表17 大鼠血液中Col1a1、Arhgdia的含量的參考值范圍（pmol?mL^-1）

4. 初步篩選確認可用作腎陽虛證標志物的蛋白。

經過Western blot和RT-PCR驗證結果表明：在腎陽虛及正常組大鼠松質骨骨組織中，Colla1、Arhgdia在蛋白及基因水平表達趨勢均與前期蛋白質組學結果一致，表現為：腎陽虛組中Colla1、Arhgdia呈顯著性低表達。表明前期研究結果的準確性可靠性，可作為腎陽虛證在骨組織中的生物標志物。

ELISA檢測結果表明，在外周血中Colla1及Arhgdia與股骨干松質骨中蛋白表達一致，與正常組比較有顯著性差異，含量均低于正常參考值范圍，提示Colla1及Arhgdia下降可能與腎陽虛證密切相關，可以作為腎陽虛證診斷的血液潛在標志物。

以上所述僅為本發明的較佳實施例，凡依本發明申請專利范圍所做的蛋白篩選及確定，皆應屬本發明的涵蓋范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建中醫藥大學

<120> 一種腎陽虛證動物模型生物標志物的篩選及確定方法

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<170> PatentIn version 3.3

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