本發(fā)明涉及海水養(yǎng)殖技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種海水中脫一氧乙酰甲喹、脫二氧乙酰甲喹及MQCA（3-甲基喹噁啉-2-羧酸）的測(cè)定方法。
背景技術(shù)：
現(xiàn)代養(yǎng)殖業(yè)日益趨向于規(guī)模化、集約化，使用抗生素、維生素、激素、金屬微量元素等，更成為保障海水養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展必不可少的一環(huán)。然而不幸的是，由于科學(xué)知識(shí)的缺乏和經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使，在養(yǎng)殖中濫用藥物的現(xiàn)象普遍存在。在我國情況尤為嚴(yán)重。濫用獸藥的直接后果是導(dǎo)致獸藥在動(dòng)物性食品中的殘留，攝入人體后，影響人類的健康。動(dòng)物性食品中的獸藥殘留對(duì)人的潛在危害愈來愈引起人們的重視。只有建立起一套簡(jiǎn)便高效的藥物殘留測(cè)定方法，是有效地控制藥物殘留發(fā)生的基礎(chǔ)。
喹乙醇（Olaquindox）又稱喹酰胺醇、快育靈，是20世紀(jì)70年代初由西德拜爾藥廠研制合成的飼料添加劑，因其具有廣譜抗菌效果和促生長作用，被廣泛用于畜禽養(yǎng)殖、抗菌治療和水產(chǎn)動(dòng)物的疫病防控。然而大量生物毒性試驗(yàn)表明：過量的喹乙醇會(huì)在動(dòng)物體內(nèi)殘留，具有明顯的蓄積毒性，致癌、致畸變作用和DNA損傷等毒副作用。鑒于對(duì)人類健康造成的危害，歐盟委員會(huì)EC2788/98決議將喹乙醇列為禁用藥，國內(nèi)NY5070-2002準(zhǔn)則中也規(guī)定喹乙醇禁用漁藥。但喹乙醇本身不穩(wěn)定，在動(dòng)物體內(nèi)能夠短時(shí)間內(nèi)代謝成十多種產(chǎn)物，其中3-甲基喹噁啉-2-羧酸（MQCA）是主要代謝物之一，其在體內(nèi)相對(duì)穩(wěn)定，是國際食品法典委員會(huì)認(rèn)定的殘留標(biāo)識(shí)物之一，因此通常將喹乙醇代謝物MQCA作為殘留標(biāo)示物。2003年我國農(nóng)業(yè)部規(guī)定了肌肉和肝臟組織中MQCA的最大殘留量分別為4μg/kg和50μg/kg。
乙酰甲喹（Mequindox，MEQ）又稱痢菌凈，屬喹噁啉類化合物，是我國自行研制的具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的一類新獸藥。由于具有廣譜抗菌活性，在我國獸醫(yī)臨床上應(yīng)用廣泛。但是，生產(chǎn)實(shí)踐表明，乙酰甲喹毒性偏大，劑量高于治療量的3～5倍或長時(shí)間連續(xù)使用時(shí)可引起中毒甚至死亡。臨床毒理學(xué)研究也提示其可引起基因突變、染色體畸變，具有肝臟毒性、腎上腺毒性和兩代繁殖毒性。
華中農(nóng)業(yè)大學(xué)的劉兆穎對(duì)乙酰甲喹在肝微粒體中代謝物進(jìn)行了相對(duì)定量，認(rèn)為Ｎ４－脫一氧乙酰甲喹是乙酰甲喹在豬、雞和大鼠 肝 微粒體 中 的 主 要 代 謝 產(chǎn) 物 之 一。華中農(nóng)業(yè)大學(xué)的尹伏軍則進(jìn)行了氚標(biāo)乙酰甲喹在大鼠、雞和豬體內(nèi)的吸收分布、排泄和代謝研究，最終確定脫二氧乙酰甲喹（３－甲基－２－乙?；高橐阴＜奏谶@三種動(dòng)物體內(nèi)的殘留標(biāo)示物。
目前三種殘留標(biāo)示物均需通過三種不同的方法進(jìn)行分別測(cè)定，尚無通過一個(gè)樣本進(jìn)行三種殘留標(biāo)示物一次測(cè)定的先例。更無通過養(yǎng)殖海水間接體現(xiàn)生物體藥物殘留的先例。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是公開一種通過測(cè)定海水中脫一氧乙酰甲喹、脫二氧乙酰甲喹及MQCA（3-甲基喹噁啉-2-羧酸）從而間接體現(xiàn)生物體藥物殘留指標(biāo)的測(cè)定方法，包括儀器與試劑的選擇和調(diào)配、樣品提取與凈化、具體的色譜條件和質(zhì)譜條件。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明可通過測(cè)定海水中脫一氧乙酰甲喹、脫二氧乙酰甲喹及MQCA（3-甲基喹噁啉-2-羧酸）的含量從而間接體現(xiàn)生物體藥物殘留指標(biāo)，具有速度快、成本低、對(duì)養(yǎng)殖海產(chǎn)品無傷害的特點(diǎn)，進(jìn)而對(duì)目前養(yǎng)殖行業(yè)濫用抗生素的情況提供快速準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)支持，有利于促進(jìn)養(yǎng)殖行業(yè)的健康發(fā)展。
具體實(shí)施方式：
一種海水中脫一氧乙酰甲喹、脫二氧乙酰甲喹及MQCA的測(cè)定方法，其特征在于：
a) 儀器與試劑：
超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(Quattro Premier XE, Waters, USA)，超純水儀(Milli-Q Gradient, Millipore, France)，高速離心機(jī)(TGL-10C, 上海安亭科學(xué)儀器廠)，超聲波清洗器(KQ-600E, 昆山市超聲儀器有限公司)，氮吹儀(N-EVAPTM112, Organomation Associates, USA)，全自動(dòng)固相萃取儀(ASPEC XL4+，GILSON，F(xiàn)rance)；甲醇(色譜純)，乙腈(色譜純)，甲酸(優(yōu)級(jí)純)，鹽酸（優(yōu)級(jí)純），乙酸乙酯（色譜純），甲酸（優(yōu)級(jí)純），乙酸鈉（優(yōu)級(jí)純），固相萃取小柱(MAX 60mg 3mL，Waters，USA )；乙酰甲喹代謝物：MQCA（德國 Dr.）純度>98%，脫一氧乙酰甲喹和脫二氧乙酰甲喹均由武漢格林拜爾生物科技公司合成，純度>90%；混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取適量乙酰甲喹代謝物標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈溶解，配成100 mg/L 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液；
b) 前處理方法
量取500mL海水樣品，固相萃取小柱預(yù)先用3mL甲醇和3mL 水活化，加入海水樣品，用3mL水溶液淋洗，6mL含2%甲酸的乙酸乙酯洗脫收集；40℃下氮?dú)獯蹈?，加?mL含0.1%甲酸的乙腈-水溶液（70:30, v/v）1mL定容，超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定；其中脫一氧乙酰甲喹、脫二氧乙酰甲喹及MQCA（3-甲基喹噁啉-2-羧酸）的定量限均為：10ng/L；
c) 色譜條件：
色譜柱：ACQUITYTM UPLC BEHC18 (1.7μm, 2.1mm i.d.×100mm)；色譜柱溫度：40℃；流動(dòng)相：乙腈(A)和含有0.5%甲酸水 (B)；流速：0.25mL/min；進(jìn)樣量：10μL；柱溫：40℃；三種乙酰甲喹代謝物液相梯度洗脫程序如下：
d) 質(zhì)譜條件：
配制濃度均為1 μg/mL三種乙酰甲喹代謝物自動(dòng)調(diào)諧液，采用蠕動(dòng)泵進(jìn)樣方式(10 μL/min)，自動(dòng)調(diào)諧，優(yōu)化的質(zhì)譜條件如下所示：電離方式：正離子(ESI+)；電離電壓：2.50 kV；錐孔電壓：30 V；離子源溫度：110℃；錐孔反吹氣流速：50 L/h；脫溶劑氣溫度：350℃；脫溶劑氣流速：700 L/h；氬氣流速：0.11 mL/min；其他參數(shù)如下，*代表定量離子：
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