一種沙格列汀中間體4基因毒性雜質(zhì)的檢測(cè)方法與流程

本發(fā)明屬于分析化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種用氣相色譜法測(cè)定沙格列汀中間體4中基因毒性雜質(zhì)—甲磺酸異丙酯含量的方法。

背景技術(shù)：

甲磺酸異丙酯是合成沙格列汀中間體4過(guò)程中產(chǎn)生的基因毒性雜質(zhì)，為保證沙格列汀成品的質(zhì)量，需建立準(zhǔn)確檢測(cè)沙格列汀中間體4中甲磺酸異丙酯殘留量的方法。沙格列汀中間體4的化學(xué)名是(S)-2-{(1S,3S,5S)-3-氰基-2-氮雜雙環(huán)[3,1,0]己烷-2-基}-1-[(3-羥基金剛烷-1-基）-2-氧代乙基]叔丁氧甲酰胺，結(jié)構(gòu)式如下。

分子式為C₂₃H₃₃N₃O₄ 分子量：415.53。

甲磺酸異丙酯的結(jié)構(gòu)式為。

分子式為C₄H₁₀SO₃ 分子量：138.19 沸點(diǎn)：82℃。

目前對(duì)甲磺酸酯類化合物的檢測(cè)方法很多，如頂空進(jìn)樣 GC 法，萃取技術(shù)和衍生化法與 GC-MS 聯(lián)用，高效液相（HPLC）色譜法，HPLC-MS 法，萃取技術(shù)和衍生化法與 HPLC-MS 聯(lián)用等，但直接進(jìn)樣 GC 法相比于其他方法操作簡(jiǎn)單成本低，并且GC-FID 靈敏度高，專屬性強(qiáng)，應(yīng)用廣泛。李衛(wèi)勇采用GC-FID， 使用DB-WAX 石英毛細(xì)管柱（30 m×0.53 mm,1 μm），以乙腈-水（80∶20）為溶劑，測(cè)定藥物中的痕量檢測(cè)限（LOD）和定量限（LOQ）分別為 1×10^?6 和 5×10^?6，但采用的進(jìn)樣量為5μl。本發(fā)明人在研究檢測(cè)沙格列汀中間體4中的甲磺酸異丙酯時(shí)，建立方法將進(jìn)樣量降低到1μl，測(cè)定藥物中的痕量為檢測(cè)限（LOD）和定量限（LOQ）分別為2×10^?6 和 6×10^?6。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種采用GC-FID法測(cè)定沙格列汀中間體4中基因毒性雜質(zhì)—甲磺酸異丙酯含量，該方法具有成本低，靈敏度高，專屬性強(qiáng)，應(yīng)用廣泛的特點(diǎn)。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

1.采用GC-FID法測(cè)定沙格列汀中間體4中基因毒性雜質(zhì)—甲磺酸異丙酯含量，其創(chuàng)新點(diǎn)在于：氣相色譜條件為設(shè)置采用型號(hào)為HP-5毛細(xì)管色譜柱，設(shè)置色譜柱起始柱溫為55~65℃，載氣壓力為11~13 psi，升溫程序?yàn)橐?0℃/min的升溫速率升至170℃，保持2min，以50℃/min的升溫速率升至300℃，保持2min，進(jìn)樣量為1uL，進(jìn)樣口溫度為250℃，檢測(cè)器溫度為300℃，分流模式為不分流。

2.如上述發(fā)明的檢測(cè)方法，其特征在于色譜柱起始柱溫55~65℃，色譜柱起始柱溫優(yōu)選為60℃。

3.如上述發(fā)明的檢測(cè)方法，其特征在于色譜柱載氣壓力為11~13℃，色譜柱載氣壓力為優(yōu)選為12 psi。

4.進(jìn)一步，本發(fā)明所述的分析檢測(cè)方法，該方法用于甲磺酸異丙酯的殘留量測(cè)定包括以下4個(gè)步驟：

（1）精密稱取甲磺酸異丙酯約20 mg至100 mL容量瓶中，用乙腈溶解，定容，得對(duì)照品儲(chǔ)備液（200 μg/mL）。精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液100 μL至10 mL容量瓶中，加乙腈稀釋定容，搖勻，得對(duì)照品溶液；

（2）精密稱取沙格列汀中間體-4約1.000 g至10 mL容量瓶中，用乙腈溶解，定容，搖勻，得供試品溶液；

（3）設(shè)置起始柱溫為55~65℃；色譜柱載氣壓力為11~13℃；

（4）分別取步驟（1）中對(duì)照品溶液、步驟（2）中供試品溶液1μL，注入氣相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算的甲磺酸異丙酯的殘留量。

色譜方法的方法驗(yàn)證

1.專屬性

分別取空白溶劑、對(duì)照品溶液、供試品溶液、測(cè)試溶液各1μL進(jìn)入氣相色譜儀，記錄色譜圖，空白溶劑、供試品溶液對(duì)潛在的雜質(zhì)甲磺酸異丙酯的測(cè)定無(wú)干擾，甲磺酸異丙酯能夠準(zhǔn)確定量。

2.線性

精密稱取沙格列汀中間體-4約10.000 g至100 mL容量瓶中，用乙腈溶解，定容，得中間體-4儲(chǔ)備液（100mg/mL）。分別精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液150 μL、120 μL、100 μL、80 μL、50 μL、30 μL至10 mL容量瓶中，加中間體-4儲(chǔ)備液稀釋定容，制成濃度分別為3 μg/mL（30ppm）、2.4 μg/mL（24ppm）、2.0 μg/mL（20ppm）、1.6 μg/mL（16ppm）、1.0 μg/mL（10ppm）、0.6 μg/mL（6ppm）的測(cè)試溶液，進(jìn)樣1.0 μL，記錄色譜圖。以濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸。結(jié)果甲磺酸異丙酯在0.6-3.0μg/mL范圍內(nèi)，峰面積與濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，回歸方程為：

Y=4.4083X-0.9435，R²=0.9995。

3.重復(fù)性

平行配制6份測(cè)試溶液，測(cè)定測(cè)試溶液中甲磺酸異丙酯的含量。試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明：測(cè)試溶液中甲磺酸異丙酯含量的RSD值小于10.0%，方法重復(fù)性好。

4.中間精密度

由不同人員分別在不同時(shí)間測(cè)定測(cè)試溶液中甲磺酸異丙酯的含量，結(jié)果12份測(cè)試溶液中甲磺酸異丙酯含量的RSD小于10%，說(shuō)明本方法中間精密度良好。

5.回收率

取上述對(duì)照品儲(chǔ)備液和沙格列汀中間體-4儲(chǔ)備液，配制成濃度分別為限度（20 ppm）的50%、100%、150%的溶液。每個(gè)濃度平行配制3份，作為回收率測(cè)試溶液。取對(duì)照品溶液1.0 μL，注入氣相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，峰面積RSD應(yīng)小于10%，滿足測(cè)定需要后，取測(cè)試溶液1.0 μL注入氣相色譜儀，記錄色譜圖。按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算甲磺酸異丙酯的量，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)下表。

表1 回收率測(cè)試結(jié)果

結(jié)果表明，樣品回收率符合要求。

6.耐用性

通過(guò)改變載氣壓力±1 psi、起始柱溫±5 ℃來(lái)評(píng)估測(cè)定條件下，參數(shù)微小變動(dòng)時(shí)，測(cè)定結(jié)果不受影響的承受程度。取測(cè)試溶液進(jìn)樣，記錄色譜圖。柱壓、起始柱溫的微小變動(dòng)不影響甲磺酸異丙酯含量測(cè)定，含量的RSD值小于10.0%，說(shuō)明該方法耐用性好。

7.溶液穩(wěn)定性

取測(cè)試溶液，室溫放置，每隔2h進(jìn)樣1.0 μL，記錄色譜圖?？疾烊芤旱姆€(wěn)定性；另取對(duì)照品溶液，同法考察溶液的穩(wěn)定性。試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明：測(cè)試溶液、對(duì)照品溶液在室溫下放置，甲磺酸異丙酯峰面積在12小時(shí)內(nèi)均無(wú)明顯變化（RSD值小于10.0%）。說(shuō)明供試品溶液、對(duì)照品溶液在12小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。

8.檢測(cè)限

取測(cè)試溶液，逐級(jí)稀釋至適當(dāng)?shù)臐舛龋M(jìn)樣1.0μL，記錄色譜圖，當(dāng)信噪比S/N約為3時(shí)，此時(shí)的濃度為最低檢測(cè)濃度。最低檢測(cè)濃度為0.200 μg/mL（2ppm）。

9.定量限

取測(cè)試溶液，逐級(jí)稀釋至適當(dāng)?shù)臐舛?，進(jìn)樣1.0 μL，記錄色譜圖，當(dāng)信噪比S/N約為10時(shí)，此時(shí)的濃度為最低定量濃度。平行配制最低定量濃度的樣品6份，分別進(jìn)樣，考察其重復(fù)性。6份樣品峰面積RSD值小于10.0%，表明重復(fù)性良好。

方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果總結(jié)見(jiàn)下表2。

附圖說(shuō)明

圖1是專屬性試驗(yàn)空白溶劑GC圖譜。

圖2是專屬性試驗(yàn)對(duì)照品溶液GC圖譜。

圖3是專屬性試驗(yàn)供試品溶液GC圖譜。

圖4是專屬性試驗(yàn)測(cè)試溶液GC圖譜。

實(shí)施例 三批小試驗(yàn)證沙格列汀中間體-4中甲磺酸異丙酯的測(cè)定

精密稱取3批沙格列汀中間體-4約1.000 g至10 mL容量瓶中，用乙腈溶解，定容，搖勻，作為供試品溶液。精密稱取甲磺酸異丙酯約20 mg至100 mL容量瓶中，用乙腈溶解，定容，得對(duì)照品儲(chǔ)備液（200 μg/mL）。精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液100 μL至10 mL容量瓶中，加乙腈稀釋定容，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

色譜條件：色譜柱：HP-5毛細(xì)管色譜柱（30m×0.32mm×0.25μm）；色譜柱起始柱溫：60℃；升溫程序：以10℃/min的升溫速率升至170℃，保持2min，以50℃/min的升溫速率升至300℃，保持2min；載氣壓力：12psi。

精密量取供試品和對(duì)照溶液各1uL，分別注入氣相色譜儀中，進(jìn)樣并記錄色譜圖，按外標(biāo)法計(jì)算甲磺酸異丙酯的含量，三批沙格列汀中間體-4中甲磺酸異丙酯測(cè)定結(jié)果均為未檢出。