一種氧化石墨烯輔助的SERS活性基底表面清潔方法與流程
本發明屬于化學分析技術領域，主要涉及一種氧化石墨烯輔助的SERS活性基底表面清潔方法。
背景技術：
蛋白質結構是蛋白質功能的基礎，測定蛋白質結構是蛋白質研究的重要組成部分。了解蛋白質的結構對于認識、利用和改造蛋白質都具有十分重要的意義。血清蛋白的濃度長期以來一直被視為健康和疾病的一個重要標準。它具有結合和運輸內源性和外源性物質，維持血液膠體滲透壓，清除自由基，抑制血小板聚集和抗凝血等生理功能。與其他蛋白相比，血清白蛋白分子量小、溶解度大、穩定性較好且容易較大量、高純度制備。因此血清白蛋白是研究高分子蛋白質的理化性質、生物學功能、體內代謝、臨床應用及遺傳變異等方面的理想蛋白質，在生物學和臨床上均有重要意義。
利用增強拉曼光譜技術可直接分析水相生物分子的結構狀態且用量少，與其他方法相比有著明顯的優勢。更多的研究表明利用增強拉曼光譜手段很好地解決了生物化學、生物物理和分子生物學中的諸多問題。不僅如此，越來越多的科研人員也已經嘗試利用增強拉曼光譜技術的非破壞性和指紋式的分辨能力研究蛋白質及其之間的相互作用，并取得了一定的成果。但是其獲得的拉曼光譜的重現性和重復性不高，主要原因：實驗操作過程繁雜；加入電解質和離心過程會對基底材料的造成大的團聚而不能形成適用于目標分子有效的“熱點”。尤其是表面活性劑本身的信號嚴重干擾檢測，且會屏蔽蛋白質與基底的接觸，導致無法測得蛋白質信號。
技術實現要素：
本發明的目的是提供一種氧化石墨烯輔助的SERS活性基底表面清潔方法。
為實現上述目的，本發明采用的技術方案是：一種氧化石墨烯輔助的SERS活性基底表面清潔方法，包括下列步驟：
將氧化石墨烯溶膠和銀溶膠均勻混合，超聲下加入NaCl溶液，控制NaCl在混合溶液中的最終濃度為0.01～0.05M，銀在混合溶液的最終濃度為0.1～0.5g/L，氧化石墨烯在混合溶液的最終濃度為0.01～0.1g/mL，得到表面增強拉曼光譜的微團聚的基底材料；向基底材料中加入HCl溶液調節pH值2.5～3.5。
上述步驟中，銀溶膠的制備采用檸檬酸還原法，將硝酸銀和檸檬酸三鈉混合后煮沸5～8min，后降溫至92±2℃加熱50～90min，得到銀溶膠。
上述步驟中，氧化石墨烯溶膠的制備采用兩次氧化法得到氧化石墨烯溶膠。
上述步驟中，向基底材料中加入HCl溶液調節pH≈3。
與現有技術相比，本發明的有益效果是：本發明的最大亮點在于超聲條件下依次加入的少量的鹽酸鹽溶液和鹽酸具有協同效應，能降低GO和貴金屬納米粒子表面的帶電層，使得貴金屬納米粒子沉積到GO上，同時，又能夠快速清潔貴金屬納米材料表面的活性劑檸檬酸根離子，這樣GO代替檸檬酸根離子作為“新型表面活性劑”能夠較好地保持貴金屬納米粒子的穩定性，而貴金屬粒子表面裸露出的部分能夠直接與待檢測的蛋白質分子等相作用，從而避免了表面活性劑的干擾，實現對蛋白質等生物分子的免標記檢測。此方法操作簡單，成本低廉和較好的SERS效果等優點，為后續的蛋白質的結構和功能及疾病的診斷研究提供了重復性非常好的方法。
附圖說明
圖1是本發明制備的改進型銀溶膠的TEM圖。
圖2是本發明制備的改進型銀溶膠的UV-vis圖。
圖3是本發明所述的GO輔助清潔SERS活性基底的TEM圖。
圖4是利用本發明清潔后的基底材料檢測牛血清蛋白得到的表面增強拉曼圖。
具體實施方式
下面結合附圖對本發明的較佳實施例進行詳細闡述，以使本發明的優點和特征能更易于被本領域技術人員理解，從而對本發明的保護范圍做出更為清楚明確的界定。
本發明的機理是：在超聲條件下，依次加入的少量的鹽酸鹽溶液和鹽酸具有協同效應，能降低GO和貴金屬納米粒子表面的帶電層，使得貴金屬納米粒子沉積到GO上，同時，又能夠快速清潔貴金屬納米材料表面的活性劑檸檬酸根離子，這樣GO代替檸檬酸根離子作為“新型表面活性劑”能夠較好地保持貴金屬納米粒子的穩定性，而貴金屬粒子表面裸露出的部分能夠直接與待檢測的蛋白質分子等相作用，從而避免了表面活性劑的干擾，實現對蛋白質等生物分子的免標記檢測。
本發明所述的氧化石墨烯輔助的SERS活性基底表面清潔方法，包括如下步驟：
1)改進型銀溶膠的合成：本方法是對Lee和Meisel的合成方法的改進；具體過程是：電熱套加熱盛有220mL去離子水的三口燒瓶，待溶液沸騰后用移液槍移取1.5mL濃度為30mg/mL的AgNO3溶液至燒瓶中，等待溶液重新沸騰后，快速加入4.5mL質量分數為1％的新制的檸檬酸鈉溶液，劇烈攪拌回流，5分鐘后，溶液顏色由無色變為淺黃色，快速加入20mL 20℃蒸餾水，控制電熱套溫度，使溶液內溫度為92±2℃，繼續回流反應1h，冷卻后定容至250mL，最后所得溶液為橙綠色,記為改進AgNPs，其TEM圖和UV-vis圖分別見圖1和圖2。從Ag的UV-Vis譜圖可以看出改進型銀溶膠只在419nm處有一個強的吸收峰，是銀顆粒表面等離子共振產生的，峰型尖銳，說明銀納米粒子尺寸和形貌比較均勻。從TEM可以看出，改進法制備的AgNPs顆粒形貌比較均勻，呈球形或類球形，沒有棒狀銀存在，尺寸在30-40nm之間，分散性良好。
2)采用改進的Hummers法制備GO：兩次氧化法。首先將石墨粉過400目的篩子。預氧化：將10g K2S2O8和10g P2O5加入到3L三口燒瓶中，在1min內快速加入60mL濃硫酸，不斷攪拌并加熱至80℃。待燒瓶內白煙消失后，用鑰匙緩慢加入過篩的石墨粉20g(前5g非常緩慢)，加熱攪拌6h，反應完成后，冷卻至室溫，抽濾洗滌至pH為7左右；得到蓬松狀的濾餅，濾餅在室溫下干燥一夜。二次氧化：將460mL濃硫酸加入到3L三口燒瓶中，并處于0℃冰浴環境下，緩慢加入濾餅，保持溫度小于20℃，攪拌1h，使濾餅均勻擴散。然后緩慢加入60g KMnO4，每次小半勺，每次間隔6s。加入完成后，升溫至35℃，反應2h，溶液開始逐漸變粘稠。分多次加入920mL的蒸餾水，然后快速升溫至98℃，攪拌15min，轉移溶液至5L的燒杯中，在攪拌下加入50mL 30％(質量分數)的H2O2，然后加入2.8L的去離子水終止反應，所得溶液為亮黃色。抽濾，用稀鹽酸(VHCl:VH2O＝1:10)洗滌；然后再用去離子水洗滌至用BaCl2溶液檢驗濾液無白色沉淀為止(檢測SO42-)，得到的濾餅用蒸餾水溶解后，用透析膜透析，每天更換清水，直至pH為7。將透析好的氧化石墨烯配制成一定濃度的溶液，在大功率超聲儀下振蕩3h，使得石墨烯片碎化為小片。最后通過紫外-可見光譜儀測試吸光度，與標準曲線對比，將石墨烯濃度定量至0.5mg/mL，備用。
3)GO輔助清潔SERS活性基底：a.分別取2mL的銀溶膠和0.2mL的氧化石墨烯，在容量為10mL的試劑瓶中均勻混合，超聲條件下加入0.1mL濃度為0.55M的NaCl溶液，向微團聚懸浮性基底材料中加入HCl，在GO輔助的條件下實現SERS活性基底表面快速清潔(溶液最終pH在2.5～3.5之間)，得到清潔后的基底材料，其TEM圖見圖3。可以看出，加入的少量的鹽酸鹽溶液和鹽酸具有協同效應，不僅能清潔納米銀顆粒表面的活性劑檸檬酸根離子，而且能同時降低GO和貴金屬納米粒子表面的帶電層，使得貴金屬納米粒子沉積到GO上。形成活性基底材料。
4)將待測血清溶液加入基底溶液中混合均勻，拉曼光譜檢測。得到了牛血清蛋白的表面增強拉曼圖譜，同時，也做了清潔后的活性基底材料的表面增強拉曼圖譜，如圖4。可以看出，加入的少量的鹽酸鹽溶液和鹽酸具有協同效應，能夠有效地清除納米銀顆粒表面的活性劑檸檬酸根粒子，形成的活性基底材料能夠有效地吸附牛血清蛋白質分子，并產生良好的牛血清蛋白的SERS信號。
以上所述僅為本發明的實施例，并非因此限制本發明的專利范圍，凡是利用本發明說明書及附圖內容所作的等效結構或等效流程變換，或直接或間接運用在其他相關的技術領域，均同理包括在本發明的專利保護范圍內。
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