一種低分子肝素分子量及分子量分布檢測方法與流程

本發(fā)明涉及一種藥物的檢測方法，特別涉及一種抗凝血藥物低分子肝素的分子量及分子量分布檢測方法。
背景技術：
：低分子肝素是由普通肝素解聚制備而成的一類分子量較低的肝素的總稱。平均分子量4000～6000，根據(jù)分子量、鏈末端結構和化合物結合鹽類的不同，可以分為不同的商品制劑，目前中國市場上使用的主要有達肝素鈉、依諾肝素鈉和那曲肝素鈣，均為無色或淡黃色的澄明液體。低分子肝素具有以下藥物作用(1)預防深部靜脈血栓形成和肺栓塞。(2)治療已形成的急性深部靜脈血栓。(3)在血液透析或血液透過時，防止體外循環(huán)系統(tǒng)中發(fā)生血栓或血液凝固。(4)治療不穩(wěn)定性心絞痛及非ST段抬高心肌梗死。低分子肝素(LMWH)的分子量測定有多種方法，如粘度法、高效液相色譜法和梯度聚丙烯醉胺凝膠電泳法等，也有采用采用高效凝膠滲透色譜法(HPGPC)測定低分子肝素分子量及其分布，色譜柱為ShodexAsahipakGF-510HQ(7.6mm×300mm)或TSKG3000SWxl(7.8mm×300mm),理論塔板數(shù)以葡萄糖峰計算分別為15206和15731；柱溫35℃；流速0.5ml.min-1；示差折光檢測器和二極管陣列檢測器聯(lián)用，檢測波長為234nm。該方法具有簡便、快速和重現(xiàn)性好等特點，適合于該類藥物的質(zhì)量控制。中國藥典公開了以下方法：流動相的配制：稱取無水硫酸鈉28.4g置于燒杯中，加純化水約900ml溶解，用稀硫酸調(diào)pH至5.0，純化水定容到1000ml，經(jīng)0.22um的濾膜過濾，可根據(jù)所需的量成比例配制，每天使用時必須觀察流動相的外觀，并經(jīng)0.22um的濾膜過濾進行過濾，如發(fā)現(xiàn)渾濁應棄去，重新配制。低分子肝素鈉標準品溶液：稱取低分子肝素鈉標準品約20mg，加入流動相溶解成10mg/ml的標準溶液，一次性0.22um過濾膜過濾到樣品瓶中，貼好標識。將標準溶液用封口膜封口，冷凍保存。使用前取出平衡至室溫并混勻再使用。樣品溶液的配制：稱取樣品約20mg，加入流動相溶解成10mg/ml的樣品溶液，一次性0.22um過濾膜過濾到樣品瓶中，貼好標識。0.01％疊氮鈉溶液的配制：稱取疊氮鈉10mg置于燒杯中，加純化水約90ml溶解，用超純水定容到100ml，使用前用0.22um的濾膜過濾。分子量校準標準溶液的配制：稱取低分子肝素分子量校準標準品10mg，加入已過濾的流動相溶解成10mg/ml的校準溶液。將校準溶液分裝到若干個內(nèi)插管中，每支裝入約150ul。將分裝好的溶液用封口膜封口，冷凍保存。使用前取出平衡至室溫并混勻再使用。色譜條件：條件內(nèi)容名稱/指標液相色譜儀Waters2695檢測器紫外檢測器和示差檢測器紫外檢測波長234nm2414檢測器內(nèi)部溫度：37℃；sensitivity：4凝膠色譜柱TSKG2000SWXL，7.8mm×300mm×5μm流速0.5ml/min進樣量25μl采集時間30minGPC專用軟件EMPOWER工作站上述方法操作復雜，周期長，效率低，分辨率低同時準確性和靈敏度有待提高。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明提供一種低分子肝素分子量及分子量分布檢測方法，采用高效液相色譜法，所述方法步驟如下：步驟1，低分子肝素鈉標準品溶液的配制：步驟2，低分子肝素鈉分子量校準標準溶液的配制：步驟3，供試品溶液的配制：步驟4，0.01％疊氮鈉溶液配制：步驟5，將上述0.01％疊氮鈉溶液，低分子肝素鈉標準品溶液，低分子肝素鈉分子量校準標準溶液以及供試品溶液分別注入高效液相色譜儀，得到色譜圖，根據(jù)色譜圖計算供試品的分子量和得出分子量分布結果。優(yōu)選的，本發(fā)明所述的檢測方法，步驟如下：步驟1，低分子肝素鈉標準品溶液的配制：稱取低分子肝素鈉標準品約18-22mg，加入流動相溶解成8-12mg/ml的標準溶液，一次性0.2-0.24um過濾膜過濾到樣品瓶中，貼好標識，將標準溶液用封口膜封口，冷凍保存，使用前取出平衡至室溫并混勻再使用，步驟2，低分子肝素鈉分子量校準標準溶液的配制：稱取低分子肝素鈉分子量校準標準品8-12mg，加入已過濾的流動相溶解成8-12mg/ml的校準溶液，將校準溶液分裝到若干個內(nèi)插管中，每支裝入145-155ul，將分裝好的溶液用封口膜封口，冷凍保存，使用前取出平衡至室溫并混勻再使用，步驟3，供試品溶液的配制：稱取樣品18-22mg，加入流動相溶解成8-12mg/ml的樣品溶液，一次性0.2-0.24um過濾膜過濾到樣品瓶中，貼好標識，步驟4，0.008-0.012％疊氮鈉溶液配制：稱取疊氮鈉48-52mg于480-520mL容量瓶中，加流動相溶解定容，搖勻即得，步驟5，將上述0.008-0.012％疊氮鈉溶液，低分子肝素鈉標準品溶液，低分子肝素鈉分子量校準標準溶液以及供試品溶液分別注入高效液相色譜儀，得到色譜圖，根據(jù)色譜圖計算供試品的分子量和得出分子量分布結果，其中所述高效液相色譜的色譜條件如下：流動相：25～75mM醋酸銨溶液洗脫方式：等度洗脫。最優(yōu)選的，本發(fā)明所述的檢測方法，步驟如下：步驟1，低分子肝素鈉標準品溶液的配制：稱取低分子肝素鈉標準品約20mg，加入流動相溶解成10mg/ml的標準溶液，一次性0.22um過濾膜過濾到樣品瓶中，貼好標識，將標準溶液用封口膜封口，冷凍保存，使用前取出平衡至室溫并混勻再使用，步驟2，低分子肝素鈉分子量校準標準溶液的配制：稱取低分子肝素鈉分子量校準標準品10mg，加入已過濾的流動相溶解成10mg/ml的校準溶液，將校準溶液分裝到若干個內(nèi)插管中，每支裝入約150ul，將分裝好的溶液用封口膜封口，冷凍保存，使用前取出平衡至室溫并混勻再使用，步驟3，供試品溶液的配制：稱取樣品約20mg，加入流動相溶解成10mg/ml的樣品溶液，一次性0.22um過濾膜過濾到樣品瓶中，貼好標識，步驟4，0.01％疊氮鈉溶液配制：稱取疊氮鈉50mg于500mL容量瓶中，加流動相溶解定容，搖勻即得，步驟5，將上述0.01％疊氮鈉溶液，低分子肝素鈉標準品溶液，低分子肝素鈉分子量校準標準溶液以及供試品溶液分別注入高效液相色譜儀，得到色譜圖，根據(jù)色譜圖計算供試品的分子量和得出分子量分布結果，其中所述高效液相色譜的色譜條件如下：流動相：25～75mM醋酸銨溶液洗脫方式：等度洗脫。本發(fā)明的方法是經(jīng)過篩選獲得的，篩選過程如下：色譜柱選擇：僅使用一根WatersAcquityuplcBEH125SEC,4.6*150mm1.7um色譜柱運行該方法，能把樣品中分子量較小部分很好的分離開，分析時間縮短，但校準曲線的相關性不高，檢測結果與藥典方法差別較大。若僅使用一根WatersAcquityuplcAPC200,4.6*150mm2.5um色譜柱運行該方法，能把樣品中分子量較大部分很好的分離開，分析時間縮短，但同樣校準曲線的相關性不高，檢測結果與藥典方法差別較大。最終采用兩根色譜柱聯(lián)用的方式，可得到較好的分離效果，同時檢測結果也準確。流動相濃度的選擇：在方法開發(fā)過程中，考察了流動相濃度對方法的影響，分別使用25mM醋酸銨溶液、50mM醋酸銨溶液、75mM醋酸銨溶液作為淋洗液進行低分子肝素分子量及分子量分布方法的檢測。發(fā)現(xiàn)檢測結果沒有明顯差別，但是色譜峰的分離度隨著濃度增加有變好的趨勢。方法學驗證:方法的專屬性：空白溶液在分子量校準標準品及低分子肝素鈉標準品溶液的保留時間內(nèi)無色譜峰出現(xiàn)。準確度：采用本方法檢測得到的低分子肝素標準品重均分子量與標示值或藥典方法檢測值的絕對差值均≤150Da。重復性：單個檢驗員做的6針低分子肝素的重均分子量最大與最小的差值≤150Da,分子量大于8000(＞M8000)的組分重量百分比的RSD≤2％，分子量小于2000(＜M2000)的組分重量百分比的RSD≤2％，分子量介于8000到2000(M8000～2000)的組分重量百分比RSD≤2％。中間精密度：兩名檢驗員12針低分子肝素的重均分子量最大與最小的差值≤150Da,分子量大于8000(＞M8000)的組分重量百分比的RSD≤2％，分子量小于2000(＜M2000)的組分重量百分比的RSD≤2％，分子量介于8000到2000(M8000～2000)的組分重量百分比RSD≤2％。驗證結論：本方法能夠準確、穩(wěn)定、高效的檢測出低分子肝素的重均分子量及分子量分布。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明采用高效液相色譜法進行測定，高效快速，穩(wěn)定性好，靈敏度高。本發(fā)明的和現(xiàn)有技術比較，優(yōu)點是：本發(fā)明的方法現(xiàn)有技術方法流速低，節(jié)約流動相流速高，耗費流動相進樣量小，節(jié)約樣品進樣量大，浪費樣品平衡時間短30min左右平衡時間長5小時或平衡過夜基線穩(wěn)定基線容易漂移分析時間短10～20min分析時間長30～60min分辨率高分辨率低靈敏度高靈敏度低附圖說明圖1藥典方法得到的色譜圖圖2本發(fā)明方法得到的色譜圖具體實施方式以下通過實施例進一步說明本發(fā)明。實施例1步驟1，低分子肝素鈉標準品溶液的配制：稱取低分子肝素鈉標準品約20mg，加入流動相溶解成10mg/ml的標準溶液，一次性0.22um過濾膜過濾到樣品瓶中，貼好標識。將標準溶液用封口膜封口，冷凍保存。使用前取出平衡至室溫并混勻再使用。步驟2，低分子肝素鈉分子量校準標準溶液的配制：稱取低分子肝素鈉分子量校準標準品10mg，加入已過濾的流動相溶解成10mg/ml的校準溶液。將校準溶液分裝到若干個內(nèi)插管中，每支裝入約150ul。將分裝好的溶液用封口膜封口，冷凍保存。使用前取出平衡至室溫并混勻再使用。步驟3，供試品溶液的配制：稱取樣品約20mg，加入流動相溶解成10mg/ml的樣品溶液，一次性0.22um過濾膜過濾到樣品瓶中，貼好標識。步驟4，將上述低分子肝素鈉標準品溶液，低分子肝素鈉分子量校準標準溶液以及供試品溶液分別注入高效液相色譜儀，得到色譜圖，根據(jù)色譜圖計算供試品的分子量和得出分子量分布結果。結果是：當前第1頁1 2 3