一種有效觀察油棕雌蕊解剖結構的石蠟切片方法與流程

本發明涉及顯微觀察植物樣品技術領域，尤其涉及一種植物組織石蠟切片方法，具體涉及一種有效觀測油棕雌蕊解剖結構的石蠟切片方法。

背景技術：

油棕(Elaeis guineensis Jacq.)屬于棕櫚科油棕屬的多年生木本油料作物，是世界上生產效率最高的產油植物，有“世界油王”之稱。油棕用途廣泛，主要產品為棕櫚油和棕櫚仁油，在食品、化工及生物能源等方面都有使用。

油棕在自然界的生殖方式為有性生殖方式，花是其重要的生殖器官。油棕的花為雌雄同株異序，雌蕊包括柱頭、花柱和子房，子房受精后發育成為果實，而子房中的胚珠發育成為種子。雌蕊解剖結構研究作為鑒定種質資源的重要依據之一，常作為評價植物結果情況和適應性強弱的重要手段，主要是通過利用植物組織切片在顯微鏡下觀察其結構的特征而得以實現。因此，探索有效獲得切片的方法在鑒定評價大量油棕種質時有重要的應用價值，有利于縮短油棕種質資源的鑒定周期。

作為植物組織切片的主要方式，冷凍切片雖然制作周期短，但由于油棕雌蕊本身組織結構易褐化、組織結構密實，冷凍切片切出的片子結構不易完整，切出片子無法長久保存，而且在冷凍切片過程每次都需取新鮮樣品進行固定和切片，很受取樣的限制，不夠靈活，不適宜于油棕雌蕊的觀察。

探索適合的石蠟切片技術應用于油棕組織解剖結構及細胞學研究中是一個重要問題，以前雖有其它植物組織石蠟切片的報道，但是，不同種類的植物組織有不同的特性，相關結果雖然有借鑒意義，卻不能完全應用于油棕組織切片研究。

目前，尚未見將石蠟切片技術應用于油棕雌蕊解剖結構研究的報道。

技術實現要素：

本發明的目的是提供了一種有效觀測油棕雌蕊解剖結構的石蠟切片方法，采用石蠟切片技術可有效獲得結構清晰、完整的石蠟切片，有利于根據雌蕊的解剖結構開展油棕種質資源的鑒定和評價工作，對于培育或篩選適合我國栽培的油棕品種或種質資源具有重要意義。

為了實現上述目的，本發明的技術方案為：提供一種有效觀察油棕雌蕊解剖結構的石蠟切片方法，包括以下步驟：

(1)取樣固定：首先摘取所要觀察油棕整個的雌花序，帶回實驗室立刻進行選擇分割，選擇需要觀察的雌蕊，把接近花托部位的雌蕊完全剝下來，之后將萼片剝掉，立刻用刀將柱頭與子房分開，立刻將柱頭與子房一塊放入盛有卡諾固定液的高型稱量瓶(40×70mm)里面，每瓶的樣品數目為4～6個，當所需的樣品選取完后，用橡皮筋將牙簽扎有8～12個洞的塑料薄膜包裹在瓶口上面，放在真空干燥器中，抽真空1～1.5個小時；其中：樣品與卡諾固定液的質量體積比為1：16～1：20(g/ml)，卡諾固定液是按體積比3：1將乙醇與乙酸均勻混合構成；后面所述步驟中的材料與浸泡液的質量體積比范圍均為1：16～1：20(g/ml)；針對油棕雌蕊中胚珠非常接近花托部位的特點，本發明該步驟的取樣操作能夠有效觀察到油棕雌蕊中的胚珠結構；

(2)保存：樣品經抽真空固定后，經濃度95％乙醇、85％乙醇，每級浸泡20～25min，之后轉入濃度70％乙醇中浸泡2～3d保存備用，保存溫度為16～18℃。保存溫度為16～18℃有利于降低油棕組織的生命代謝過程，而又不會對其產生凍害作用，可以保存較長時間。

(3)整染：將保存后的樣品轉入濃度50％乙醇-乙二醇混合溶液中浸泡5～6h后，轉入愛氏蘇木精稀釋液中，用橡皮筋將扎有8～12個洞的塑料薄膜包裹在瓶口上面，放在真空干燥器中，抽真空1個小時后，繼續放置在真空干燥器中，時間為20～24h，之后從真空干燥器中取出，蓋上蓋子，常溫下繼續放置48～52h；其中乙醇-乙二醇混合溶液是按體積比4：1將乙醇與乙二醇混合構成。乙醇-乙二醇混合溶液對樣品的脫水較為溫和，并且減少引起樣品脫水過程中嚴重收縮和變硬的現象。針對油棕雌蕊結構密實的特點，將油棕雌蕊放入愛氏蘇木精稀釋液中進行真空抽氣，不僅能夠縮短染色時間，提高切片效率，而且能夠使愛氏蘇木精稀釋液盡快滲透到油棕雌蕊內部，使油棕雌蕊內部組織染上顏色，提高染色質量。

(4)水洗、返藍：樣品經愛氏蘇木精稀釋液染色后，用蒸餾水浸洗樣品，浸洗3～4次，中間每次浸泡1～2h，最后一次浸泡12～15h，之后用自來水返藍，換水4～6次，每次2～3min，最后蒸餾水過一遍，浸泡5～7h。

(5)脫水、透明、加碎蠟：蒸餾水浸泡5～7h后，經過脫水劑逐級脫水后，再經氯仿逐級透明后，先加入純氯仿40～50％體積的碎蠟沫，在36℃溫箱中保溫1h，再加入以有少量碎蠟沫漂浮在氯仿中，在36℃溫箱中保溫24h以上；其中脫水劑為七種，依次為：濃度30％乙醇-乙二醇混合水溶液、濃度50％乙醇-乙二醇混合水溶液、濃度70％乙醇-乙二醇混合水溶液、濃度85％乙醇-乙二醇混合水溶液、含濃度1％伊紅的95％乙醇、無水乙醇-乙二醇混合溶液、無水乙醇；上述各種濃度的乙醇-乙二醇混合水溶液中，乙醇與乙二醇的體積比均為4：1；無水乙醇-乙二醇混合溶液中，無水乙醇與乙二醇的體積比為4：1；依次經七種脫水劑脫水時間依次為14～15h、3h、3h、3h、14～15h、3h、3h。

(6)透蠟、包埋：加碎蠟沫后的樣品經濃度50％石蠟，濃度70％石蠟各浸泡3h，再經純蠟A、純蠟B、純蠟C三杯，每杯浸泡50min，包埋時樣品橫臥，樣品與石蠟的體積比為1：60～1：80；

(7)修蠟塊、切片：將包埋樣品后的蠟塊分割，修整，修整好的蠟塊固定在底板后，進一步修成梯形，其中梯形的下底與雌蕊的高平行，油棕雌蕊縱切，切片厚度為11～15μm；

(8)展片、粘片、烘干：選取所需蠟帶進行粘片，于溫度為35℃的電熱展片臺展片后，將材料平放在鋪有白色A4紙的托盤上，放置在溫度為36℃鼓風干燥箱中，直至烘干；其中粘片時所選的高品質載玻片需用新醫用脫脂棉擦干凈，肉眼觀察透亮無雜物，所選的蠟帶長度小于封片時所用蓋玻片長度。采用新醫用脫脂棉擦高品質載玻片，觀察的效果更加清晰，不會受到載玻片上雜物的影響，并且清洗載玻片速度快，節省時間。

(9)脫蠟、透明：烘片結束后，在二甲苯溶液中脫蠟、透明各一次，每次浸泡28～35min，此流程在通風櫥內操作，其中在操作過程中，脫蠟缸與透明缸隨手蓋蓋子。

(10)封片、烘片：將從透明缸里面取出的載玻片放在圓形濾紙上面，從右邊方向立即滴2～3滴封片劑，封片后放置在溫度為36℃烘箱中烘烤10～15d，待樹膠烤干后，進行觀察；其中封片劑是按體積比5：1將中性樹膠與二甲苯混合構成。本發明采用的封片劑，封片過程中中性樹膠稀稠度適宜，易操作，而且在封片烘干后不會因為二甲苯的大量揮發導致油棕雌蕊組織結構萎縮，影響觀片效果，脫蠟后立即滴加該封片劑能夠獲得較好的觀測視野和清晰的顯微結構。

(11)觀片：將完成的切片在顯微鏡上觀測，獲得所需圖像。

本發明一種有效觀察油棕雌蕊解剖結構的石蠟切片方法，采用石蠟切片技術可有效獲得油棕雌蕊結構完整的石蠟切片，切片平整、無皺褶、厚度均勻，顯微結果清晰，具有經濟實惠、易操作、結果清晰、可長期保存、不受取樣時間限制、并可一次固定多份樣品等優點，有利于開展油棕雌蕊解剖結構的觀察和研究，在培育適合我國栽培的品種或篩選優良種質資源類型的工作中具有重要的意義。

附圖說明

圖1是不同厚度的石蠟切片結果比較。

圖2是不同條件下顯微圖像結果比較。A、脫蠟后立即滴加中性樹膠(中性樹膠：二甲苯＝5：1)并用蓋玻片封片；B、脫蠟后延遲滴加中性樹膠(中性樹膠：二甲苯＝1：1)，并用蓋玻片封片；C、脫蠟后立即滴加中性樹膠(中性樹膠：二甲苯＝1：1)并用蓋玻片封片；D、脫蠟后延遲滴加中性樹膠(中性樹膠：二甲苯＝5：1)，并用蓋玻片封片。

圖3是油棕雌蕊的冷凍切片與本發明石蠟切片效果比較。A、厚度為14μm的冷凍切片的顯微圖像；B、本發明厚度為14μm的石蠟切片的顯微圖像。

具體實施方式

實施例一

1、取樣固定：首先摘取所要觀察油棕的整個雌花序，帶回實驗室立刻進行選擇分割，選擇新鮮、正常、有代表性的雌蕊，把接近花托部位的雌蕊完全剝下來，之后將萼片剝掉，立刻用刀將柱頭與子房分開，立刻放入盛有卡諾固定液(純乙醇：乙酸＝3:1)的高型稱量瓶(40×70mm)里面，每瓶的樣品數目6個，材料與固定液的質量體積比為1：17(g/ml)，之后用牙簽扎有10個洞的塑料薄膜用橡皮筋包裹在瓶口上面，放在真空干燥器(真空泵型號DP-01)中，抽氣1.2個小時。后面所述步驟中的材料與浸泡液的質量體積比范圍均為1：17(g/ml)。

2、保存整染：真空抽氣后的樣品依次經濃度95％乙醇，85％乙醇各浸泡20min，之后轉入濃度70％乙醇中浸泡3d，保存溫度為17℃。

3、整染：將保存后的樣品從濃度70％乙醇中轉入50％乙醇-乙二醇混合溶液中浸泡5h，轉入愛氏蘇木精稀釋液中，用橡皮筋將牙簽扎有10個洞的塑料薄膜用包裹在瓶口上面，放在真空干燥器中，抽氣1個小時后，繼續放置在真空干燥器中，時間為23h，之后從干燥器中取出，蓋上蓋子，常溫下繼續放置50h。

4、水洗、返藍：樣品經愛氏蘇木精稀釋液染色后，用蒸餾水浸洗樣品，浸洗4次，中間每次浸泡1h，最后一次浸泡14h，之后用自來水返藍，換水5次，每次2min，最后蒸餾水過一遍，浸泡6h。

5、脫水、透明、加碎蠟：蒸餾水浸泡6h后，經過脫水劑逐級脫水后，再經氯仿逐級透明后，先加入純氯仿40％體積的碎蠟沫，在36℃溫箱中保溫1h，再加入以有少量碎蠟沫漂浮在氯仿中，在36℃溫箱中保溫24h以上；其中脫水劑為七種，依次為：濃度30％乙醇-乙二醇混合水溶液、濃度50％乙醇-乙二醇混合水溶液、濃度70％乙醇-乙二醇混合水溶液、濃度85％乙醇-乙二醇混合水溶液、含濃度1％伊紅的95％乙醇、無水乙醇-乙二醇混合溶液、無水乙醇；上述各種濃度乙醇-乙二醇混合水溶液中，乙醇與乙二醇的體積比均為4：1；無水乙醇-乙二醇混合溶液中，無水乙醇與乙二醇的體積比為4：1。

具體為：依次經七種脫水劑脫水時間依次為14h、3h、3h、3h、14h、3h、3h。最后一次無水乙醇浸泡3h后，吸出20％無水乙醇后，加入相同體積的純氯仿，浸泡2.5h后，依次進行3次吸出20％溶液，加入相同體積的純氯仿，依次浸泡2.5h，14h，2.5h。之后吸出全部溶液，依次經100％純氯仿2次，依次浸泡2.5h，1h。加氯仿過程全部在通風櫥內完成。第二次浸泡氯仿后，將提前刮好的碎蠟沫加入氯仿中，加入碎蠟沫與氯仿的體積比在40％，至于36℃溫箱中保溫1h后，再次加入提前刮好的碎蠟沫，以有少量碎蠟沫漂浮在氯仿中為好，在36℃溫箱中保溫24h以上。

6、透蠟、包埋：先將放置好自制活動鋁盒(長×寬×高為7.0cm×2.0cm×2.0cm)的提籃浸泡在50％石蠟杯中，之后將樣品等共同轉入活動鋁盒內，并將頂部用鉛筆標寫名稱序號白色A4紙條(長×寬＝8.0cm×0.7cm)豎放在鋁盒內，并將放有樣品的50％石蠟杯在42℃溫箱中保溫3h。隨后將放有樣品的提籃轉入到75％石蠟蠟中浸泡，并在50℃溫箱中保溫3h。之后放有樣品提籃分別經純蠟A杯、純蠟B杯、純蠟C杯浸泡，都在58℃溫箱中保溫50min。選用光滑、有一定硬度的白紙，紙的大小為(10.5cm×12cm)，折疊好后，用紅色特種鉛筆在紙盒底部或者側面寫上材料編號。先將電磁爐調節到100℃，溶解提前熬制和過濾好的石蠟3-5min；再將電磁爐調節到70℃，將石蠟完全溶解后，用電磁爐上的余熱保溫。將自來水浸濕吸水紙放置在大小為(7cm×9cm)的玻璃板上，其上再放折疊好的紙盒，用蠟勺盛蠟于紙盒中后平放，再將純蠟C杯中的鋁盒取出放入紙盒中，將鋁盒拆開，將材料落入盒中，將4-6個樣品平均分布到紙盒中(樣品與石蠟的體積比為1：60)，樣品橫臥。靜置到蠟塊表面結膜后可連同玻璃片一起移入水中，然后慢慢抽出玻璃片，使包埋盒浮于水中。以此類推。

7、修蠟塊、切片：首先在桌上墊一張A4紙，紙上放一塊小木板，之后將包埋好的蠟塊的紙剝掉，正面放在小木板上，先用單面刀片在所要切取的材料四周蠟塊上劃數條直線，四周相接與直線之間也劃線，之后輕輕的加深刀口，然后用兩手的大拇指和食指夾住蠟塊輕輕用力折斷。用單面刀將分割的蠟塊修成小塊。將修好的蠟塊按組裝入自封袋中，自封袋上寫好編號。將所要切片的材料的蠟塊牢固粘在底板上，當底板上的蠟塊冷卻后，再進一步修整成梯形，其中梯形的下底與雌蕊的高平行，并將切面表面的石蠟仔細削去，只剩下薄薄一層覆蓋在材料上。將已固著和修整好的蠟塊裝在樣品固定器上，油棕雌蕊的高與刀的方向平行，并固定好。將切片刀裝在切片機(型號LEICA RM 2235)的刀架上，調節切片刀的角度為15°左右，并固定好。調節切片的厚度：轉動厚度調節器調節至所需的切片厚度，一般在11μm。打開停刀扎，進行切片，將切好，連成帶的片子放在白色A4紙上，用剪剖刀切斷蠟帶，蠟帶的長度小于封片時蓋玻片長度。在粘片前，將電熱展片臺溫度調至35℃。

8、展片、粘片、烘干：先用鉛筆在載玻片左側磨砂處標好編號和粘片順序號碼，然后用新醫用脫脂棉將載玻片擦干凈，肉眼觀察無雜物。選擇所需的蠟帶進行粘片，粘貼劑(蛋清甘油配制)，將蘸有蛋清甘油的細竹簽的一小滴涂2張載玻片，用洗干凈的小手指涂抹均勻，之后在載玻片上滴3-4滴純水，將提前切割好的蠟帶用小鑷子轉移載玻片上的蒸餾水中，然后平移到提前預熱好的電熱展片臺上(金華益迪/YD-AB)，用鑷子輕輕促動蠟帶邊緣，使材料擺放整齊和蠟帶展開，放置2.5小時以上。之后平移到鋪有白色A4紙的托盤上，放置在鼓風干燥箱(36℃)中，直至烘干。

9、脫蠟、透明：取10片玻璃脫蠟缸4個，在缸的外壁的一側貼上脫蠟、透明字樣的標簽，用玻璃膠布覆蓋，之后放在通風廚里面，在蠟缸里面加入脫蠟劑二甲苯，二甲苯的量與齒槽高度平齊。將待脫蠟的載玻片放在脫蠟缸里面，有材料的一面朝向標簽和人，每個卡槽放至一張載玻片，注意勿粘貼住，之后蓋上蓋子，放置30min后轉入透明缸中。

10、封片、烘片：將從透明缸里面取出的載玻片放在圓形濾紙上面，從右邊方向立即滴2滴封片劑(封片劑是按體積比5：1將中性樹膠與二甲苯混合構成)；之后將蓋玻片從右側蓋住，平放在鋪有白色A4紙的托盤上。裝滿一盤后放置在烘箱中烘烤(36℃)烘箱中烘烤10d，待樹膠烤干后，進行觀察。

11、觀片：將完成的切片至于顯微鏡(型號：Leica DM 2500)上觀察油棕雌蕊解剖結構，拍照獲取所需圖像。

實施例二

1、取樣固定：首先摘取所要觀察油棕的整個雌花序，帶回實驗室立刻進行選擇分割，選擇新鮮、正常、有代表性的雌蕊，把接近花托部位的雌蕊完全剝下來，之后將萼片剝掉，立刻用刀將柱頭與子房分開，立刻放入盛有卡諾固定液(純乙醇：乙酸＝3:1)的高型稱量瓶(40×70mm)里面，每瓶的樣品數目6個，材料與固定液的質量體積比為1：20(g/ml)，之后用牙簽扎有12個洞的塑料薄膜用橡皮筋包裹在瓶口上面，放在真空干燥器(真空泵型號DP-01)中，抽氣1.2個小時。后面所述步驟中的材料與浸泡液的質量體積比范圍均為1：20(g/ml)。

2、保存整染：真空抽氣后的樣品依次經濃度95％乙醇，85％乙醇各25min，之后轉入濃度70％乙醇中浸泡2d，保存溫度為18℃。

3、整染：將保存后的樣品從濃度70％乙醇中轉入50％乙醇-乙二醇混合溶液中浸泡6h，轉入愛氏蘇木精稀釋液中，用橡皮筋將牙簽扎有12個洞的塑料薄膜用包裹在瓶口上面，放在真空干燥器中，抽氣1個小時后，繼續放置在真空干燥器中，時間為20h，之后從干燥器中取出，蓋上蓋子，常溫下繼續放置52h。

4、水洗、返藍：樣品經愛氏蘇木精稀釋液染色后，用蒸餾水浸洗樣品，浸洗4次，中間每次浸泡2h，最后一次浸泡13h，之后用自來水返藍，換水5次，每次2min，最后蒸餾水過一遍，浸泡6h。

5、脫水、透明、加碎蠟：蒸餾水浸泡5h后，經過脫水劑逐級脫水后，再經氯仿逐級透明后，先加入純氯仿50％體積的碎蠟沫，在36℃溫箱中保溫1h，再加入以有少量碎蠟沫漂浮在氯仿中，在36℃溫箱中保溫24h以上；其中脫水劑為七種，依次為：濃度30％乙醇-乙二醇混合水溶液、濃度50％乙醇-乙二醇混合水溶液、濃度70％乙醇-乙二醇混合水溶液、濃度85％乙醇-乙二醇混合水溶液、含濃度1％伊紅的95％乙醇、無水乙醇-乙二醇混合溶液、無水乙醇；上述各種濃度乙醇-乙二醇混合水溶液中，乙醇與乙二醇的體積比均為4：1；無水乙醇-乙二醇混合溶液中，無水乙醇與乙二醇的體積比為4：1。

具體為：依次經七種脫水劑脫水時間依次為14h、3h、3h、3h、14h、3h、3h。最后一次無水乙醇浸泡3h后，吸出20％無水乙醇后，加入相同體積的純氯仿，浸泡2.5h后，依次進行3次吸出20％溶液，加入相同體積的純氯仿，依次浸泡2.5h，14h，2.5h。之后吸出全部溶液，依次經100％純氯仿2次，依次浸泡2.5h，1h。加氯仿過程全部在通風櫥內完成。第二次浸泡氯仿后，將提前刮好的碎蠟沫加入氯仿中，加入碎蠟沫與氯仿的體積比在50％，至于36℃溫箱中保溫1h后，再次加入提前刮好的碎蠟沫，以有少量碎蠟沫漂浮在氯仿中為好，在36℃溫箱中保溫24h以上。

6、透蠟、包埋：先將放置好自制活動鋁盒(長×寬×高為7.0cm×2.0cm×2.0cm)的提籃浸泡在50％石蠟杯中，之后將樣品等共同轉入活動鋁盒內，并將頂部用鉛筆標寫名稱序號白色A4紙條(長×寬＝8.0cm×0.7cm)豎放在鋁盒內，并將放有樣品的50％石蠟杯在42℃溫箱中保溫3h。隨后將放有樣品的提籃轉入到75％石蠟蠟中浸泡，并在50℃溫箱中保溫3h。之后放有樣品提籃分別經純蠟A杯、純蠟B杯、純蠟C杯浸泡，都在58℃溫箱中保溫50min。選用光滑、有一定硬度的白紙，紙的大小為(10.5cm×12cm)，折疊好后，用紅色特種鉛筆在紙盒底部或者側面寫上材料編號。先將電磁爐調節到100℃，溶解提前熬制和過濾好的石蠟3-5min；再將電磁爐調節到70℃，將石蠟完全溶解后，用電磁爐上的余熱保溫。將自來水浸濕吸水紙放置在大小為(7cm×9cm)的玻璃板上，其上再放折疊好的紙盒，用蠟勺盛蠟于紙盒中后平放，再將純蠟C杯中的鋁盒取出放入紙盒中，將鋁盒拆開，將材料落入盒中，將4-6個樣品平均分布到紙盒中(樣品與石蠟的體積比為1：80)，樣品橫臥。靜置到蠟塊表面結膜后可連同玻璃片一起移入水中，然后慢慢抽出玻璃片，使包埋盒浮于水中。以此類推。

7、修蠟塊、切片：首先在桌上墊一張A4紙，紙上放一塊小木板，之后將包埋好的蠟塊的紙剝掉，正面放在小木板上，先用單面刀片在所要切取的材料四周蠟塊上劃數條直線，四周相接與直線之間也劃線，之后輕輕的加深刀口，然后用兩手的大拇指和食指夾住蠟塊輕輕用力折斷。用單面刀將分割的蠟塊修成小塊。將修好的蠟塊按組裝入自封袋中，自封袋上寫好編號。將所要切片的材料的蠟塊牢固粘在底板上，當底板上的蠟塊冷卻后，再進一步修整成梯形，其中梯形的下底與雌蕊的高平行，并將切面表面的石蠟仔細削去，只剩下薄薄一層覆蓋在材料上。將已固著和修整好的蠟塊裝在樣品固定器上，油棕雌蕊的高與刀的方向平行，并固定好。將切片刀裝在切片機(型號LEICA RM 2235)的刀架上，調節切片刀的角度為15°左右，并固定好。調節切片的厚度：轉動厚度調節器調節至所需的切片厚度，一般在14μm。打開停刀扎，進行切片，將切好，連成帶的片子放在白色A4紙上，用剪剖刀切斷蠟帶，蠟帶的長度小于封片時蓋玻片長度。在粘片前，將電熱展片臺溫度調至35℃。

8、展片、粘片、烘干：先用鉛筆在載玻片左側磨砂處標好編號和粘片順序號碼，然后用新醫用脫脂棉將載玻片擦干凈，肉眼觀察無雜物。選擇所需的蠟帶進行粘片，粘貼劑(蛋清甘油配制)，將蘸有蛋清甘油的細竹簽的一小滴涂2張載玻片，用洗干凈的小手指涂抹均勻，之后在載玻片上滴3-4滴純水，將提前切割好的蠟帶用小鑷子轉移載玻片上的蒸餾水中，然后平移到提前預熱好的電熱展片臺上(金華益迪/YD-AB)，用鑷子輕輕促動蠟帶邊緣，使材料擺放整齊和蠟帶展開，放置2.5小時以上。之后平移到鋪有白色A4紙的托盤上，放置在鼓風干燥箱(36℃)中，直至烘干。

9、脫蠟、透明：取10片玻璃脫蠟缸4個，在缸的外壁的一側貼上脫蠟、透明字樣的標簽，用玻璃膠布覆蓋，之后放在通風廚里面，在蠟缸里面加入脫蠟劑二甲苯，二甲苯的量與齒槽高度平齊。將待脫蠟的載玻片放在脫蠟缸里面，有材料的一面朝向標簽和人，每個卡槽放至一張載玻片，注意勿粘貼住，之后蓋上蓋子，放置30min后轉入透明缸中。

10、封片、烘片：將從透明缸里面取出的載玻片放在圓形濾紙上面，從右邊方向立即滴3滴封片劑(封片劑是按體積比5：1將中性樹膠與二甲苯混合構成)；之后將蓋玻片從右側蓋住，平放在鋪有白色A4紙的托盤上。裝滿一盤后放置在烘箱中烘烤(36℃)烘箱中烘烤10d，待樹膠烤干后，進行觀察。

11、觀片：將完成的切片至于顯微鏡(型號：Leica DM 2500)上觀察油棕雌蕊解剖結構，拍照獲取所需圖像。

試驗過程：

重復上述步驟，將實施例一所得的修整好的蠟塊分別在厚度8μm、9μm、10μm、12μm、14μm、16μm、18μm下進行切片，之后按照實施例一方法進行下面的步驟，然后將完成的切片置于顯微鏡(型號：Leica DM2500)下拍照獲取所需顯微圖像，部分結果見圖1。結果表明在相同放大倍數條件下，切片厚度小于10μm時，蠟帶薄，切片過程中蠟帶褶皺，放置在展片機上也無法展平，但獲得視野清晰，而觀察結果有重疊褶皺情況。切片厚度在11～15μm時，切片過程中，蠟帶平滑，不彎曲，材料不破碎，觀察結構清楚，無疊褶皺情況。切片厚度大于16μm時，切片過程中，蠟帶不相連，無疊褶皺情況，切片結果清晰，但厚度厚，透光性差。

將實施例一所得切片采用不同的封片劑進行封片：1、脫蠟后立即滴加封片劑(中性樹膠：二甲苯＝5：1)并用蓋玻片封片；2、脫蠟后延遲滴加封片劑(中性樹膠：二甲苯＝1：1)，并用蓋玻片封片；3、脫蠟立即滴加封片劑(中性樹膠：二甲苯＝1:1)并用蓋玻片封片；4、脫蠟后延遲滴加封片劑(中性樹膠：二甲苯＝5：1)，并用蓋玻片封片。所獲得的顯微圖像結果見圖2，脫蠟后立即滴加封片劑(中性樹膠：二甲苯＝5：1)獲得較好的觀測視野和清晰的雌蕊解剖結構(圖2A)；脫蠟后延遲滴加封片劑(中性樹膠：二甲苯＝1：1)易導致油棕雌蕊解剖結構萎縮，使其結構失去真實結構，而無法達到觀察效果(圖2B)；脫蠟后立即滴加封片劑(中性樹膠：二甲苯＝1：1)，溫箱中烘干后，其觀察結果較延遲滴加封片劑(中性樹膠：二甲苯＝1：1)獲得觀察結果清晰，但由于中性樹膠太少，溫箱中烘干過程中，二甲苯揮發，導致其組織結構萎縮，無法達到所需觀察效果(圖2C)；脫蠟后延遲滴加封片劑(中性樹膠：二甲苯＝5：1)獲得觀察效果(圖2D)中有細胞結構不清晰，無法獲得清晰的顯微結構圖片，其原因是由于在延遲的過程中，二甲苯揮發所致細胞結構萎縮。其中所涉及到的延遲過程均指從透明缸中拿出載玻片后延遲30s～60s滴加封片劑。

對照：采用冷凍切片法制備油棕雌蕊厚度為14μm的切片樣品，在Leica DMIL LED倒置生物顯微鏡下觀察拍照。結果如圖3A。

由圖3B可以看出，本發明所采用的石蠟切片技術得到的油棕雌蕊切片平整、無皺褶、厚度均勻，其顯微結果結構完整、排列整齊，清晰，蘇木精對細胞核的染色效果好，與冷凍切片技術相比，具有易操作、不受取樣時間限制、結果清晰等優點，有利于開展油棕雌蕊解剖結構的觀察和研究，在培育適合我國栽培的品種或篩選優良種質資源類型的工作中具有重要的意義。

以上所揭露的僅為本發明的較佳實施例而已，當然不能以此來限定本發明之權利范圍，因此依本發明權利要求所作的等同變化，仍屬于本發明所涵蓋的范圍。