一種多層納米金球的液相開管柱及其制作方法和應(yīng)用與流程

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種多層納米金球的液相開管柱及其制作方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

納米金球即指金的微小球形顆粒，其直徑在1～100 nm，具有高電子密度、介電特性和催化作用，能與多種生物大分子結(jié)合，且不影響其生物活性。由氯金酸通過還原法可以方便地制備各種不同粒徑的納米金球，其顏色依直徑大小而呈紅色至紫色。納米金球因其獨特的物理化學(xué)性質(zhì)而受到越來越廣泛的關(guān)注。納米金球可以輕易地與氨基發(fā)生靜電相互作用，與巰基之間生成化學(xué)鍵。因此納米金球可以有條件的自主裝在毛細管的內(nèi)表面。

常規(guī)的Si基或玻璃毛細管內(nèi)表面可以進行內(nèi)部修飾, 例如修飾氨基或巰基。當(dāng)毛細管內(nèi)充滿金溶膠時，金溶膠內(nèi)懸浮的納米金球就會通過靜電吸引或者化學(xué)鍵作用，自主裝在毛細管內(nèi)表面。只要通入的金溶膠足夠多，就有可能形成連續(xù)的納米金球自主裝層。當(dāng)相鄰金球使用二巰基試劑相連時，該納米金球自組裝層就會比較牢固，可以承受十個以上氣壓的液體沖刷。

連續(xù)多層的納米金球?qū)拥慕饘賹幼鳛槊毠軆?nèi)壁的修飾層是復(fù)雜修飾的前導(dǎo)步驟。因為其不但可以將內(nèi)壁改造為導(dǎo)體層,方便電位控制和信號傳導(dǎo),而且還可以大大豐富吸附的功能分子種類,這在醫(yī)學(xué)檢測、生物分離、DNA鑒定等領(lǐng)域廣為應(yīng)用。

同時，連續(xù)多層的納米金球?qū)邮且粋€多孔結(jié)構(gòu)，而它的孔則來自于金球與金球之間堆積形成的空隙?？障兜拇笮∮锌赡茴愃朴谏V保留所需的孔隙。因此，經(jīng)過進一步的修飾，內(nèi)壁自主裝了多層納米金球的毛細管可以成為毛細管液相開管柱，對物質(zhì)進行分離分析。液相開管柱的極小體積可以用來分離少量細胞中的微量蛋白質(zhì)和肽段，這在單細胞分析領(lǐng)域很有作用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種多層納米金球的液相開管柱及其制作方法和應(yīng)用。

本發(fā)明提供的多層納米金球的液相開管柱及其制作方法，其步驟為：

（1）首先，預(yù)處理毛細管內(nèi)壁，并通入氨基硅烷偶聯(lián)劑反應(yīng)，在毛細管內(nèi)壁修飾氨基；

（2）然后，將納米金溶膠通過氣體壓入內(nèi)壁修飾了氨基的毛細管中，在毛細管內(nèi)壁自主裝上第一層金球；

（3）再將二巰基試劑通入內(nèi)壁修飾了第一層納米金球的毛細管中，在第一層金球上修飾巰基；

（4）再將納米金溶膠通過氣體壓入內(nèi)壁修飾了帶巰基的納米金球的毛細管中，在毛細管內(nèi)壁自主裝上第二層金球；

（5）重復(fù)通入二巰基試劑和納米金溶膠的步驟，在毛細管內(nèi)壁自主裝上更多層金球；

（6）最后向毛細管內(nèi)通入巰基試劑，使內(nèi)壁自組裝了多層納米金球的毛細管成為液相開管柱。

將制作好的固定相為多層納米金球的液相開管柱用于100個細胞的蛋白酶解液的色譜分離，利用Orbitrap MS在線檢測色譜餾分。

本發(fā)明提供的多層納米金球的液相開管柱的制作方法，具體操作流程如下：

（1）取一根200-1000 μm外徑、5-500 μm內(nèi)徑、長度1-1000 cm的玻璃或石英毛細管，4-50 ℃下，依次用0.1-1 mol/L NaOH、水、0.1-1 mol/L HCl、水、CH₃CN分別沖洗5-30 min；

（2）將硅烷偶聯(lián)劑反應(yīng)液通入步驟（1）所得毛細管中，20-150 ℃下加熱反應(yīng)0.5-24 h；硅烷偶聯(lián)試劑包括但不限于3-氨丙基三甲氧基硅烷、3-氨丙基三乙氧基硅烷（1-99%，v/v）溶液，溶液的溶劑包括但不限于甲醇、乙醇、乙腈、丙醇、二甲基亞酰胺、二甲亞砜；硅烷偶聯(lián)反應(yīng)完成后用溶劑洗凈，溶劑包括但不限于甲醇、乙醇、丙醇、二甲基亞酰胺；

（3）將納米金球顆粒直徑為1-100 nm的金溶膠置于瓶口具有橡膠塞的氣瓶中；氣瓶和鋼瓶之間用內(nèi)徑為5-500 μm內(nèi)徑的石英毛細管連接；將步驟（2）所得毛細管直接插在氣瓶內(nèi)的金溶膠中；在4-50 ℃、0.1-10 bar壓力下，使用氣體鋼瓶的氣體，氣體包括但不限于氮氣、氬氣、氦氣，將10-1000倍毛細管體積金溶膠壓入毛細管中；

（4）將二巰基試劑置于瓶口具有橡膠塞的氣瓶中；二巰基試劑包括但不限于二巰基丙烷、二巰基丁烷、二巰基戊烷、二巰基己烷、二巰基庚烷、二巰基辛烷、二巰基壬烷、二巰基癸烷，濃度為0.1-50%（v/v），溶劑包括但不限于甲醇、乙醇、乙腈、丙醇、二甲基亞酰胺、二甲亞砜；氣瓶和鋼瓶之間用內(nèi)徑為5-500 μm內(nèi)徑的石英毛細管連接；將步驟（3）所得毛細管直接插在氣瓶內(nèi)的二巰基試劑中；在4-50 ℃、0.1-10 bar壓力下，使用氣體鋼瓶的氣體，氣體包括但不限于氮氣、氬氣、氦氣，將10-1000倍毛細管體積二巰基試劑壓入毛細管中；

（5）將納米金球顆粒直徑為1-100 nm的金溶膠置于瓶口具有橡膠塞的氣瓶中；氣瓶和鋼瓶之間用內(nèi)徑為5-500 μm內(nèi)徑的石英毛細管連接；將步驟（4）所得毛細管直接插在氣瓶內(nèi)的金溶膠中；在4-50 ℃、0.1-10 bar壓力下，使用氣體鋼瓶的氣體，氣體包括但不限于氮氣、氬氣、氦氣，將10-1000倍毛細管體積金溶膠壓入毛細管中；

（6）重復(fù)步驟（4）和步驟（5），重復(fù)次數(shù)1到20次；

（7）將巰基試劑置于瓶口具有橡膠塞的氣瓶中；巰基試劑包括但不限于巰基丁烷、巰基戊烷、巰基庚烷、巰基十八烷，濃度為0.1-50%（v/v），溶劑包括但不限于甲醇、乙醇、乙腈、丙醇、二甲基亞酰胺、二甲亞砜；氣瓶和鋼瓶之間用內(nèi)徑為5-500 μm內(nèi)徑的石英毛細管連接；將步驟（6）所得毛細管直接插在氣瓶內(nèi)的巰基試劑中；在4-50 ℃、0.1-10 bar壓力下，使用氣體鋼瓶的氣體，氣體包括但不限于氮氣、氬氣、氦氣，將10-1000倍毛細管體積巰基試劑壓入毛細管中；即得到固定相為多層納米金球的液相開管柱。

本發(fā)明所制備的多層納米金球的液相開管柱，可用于分離10-1000個細胞蛋白質(zhì)和肽。具體步驟為：

（1）將多層納米金球的液相開管柱裝入色譜系統(tǒng)；

（2）使用色譜系統(tǒng)對多層納米金球的液相開管柱進樣，樣品為10-1000個細胞的蛋白酶解液；

（3）使用色譜系統(tǒng)洗脫步驟（2）所得液相開管柱中的10-1000個細胞的蛋白酶解液，流動相為A相水，0.1%甲酸，B相乙腈，0.1%甲酸；

（4）使用Orbitrap MS對步驟（3）所得色譜餾分進行在線檢測，離子源為電噴霧離子源。

本發(fā)明的特點是利用納米金球方便快速的構(gòu)建開管柱的多孔層固定相，能夠在很寬內(nèi)徑范圍的毛細管中操作。所得的液相開管柱柱體積極小，分離少量細胞時，肽段和蛋白質(zhì)的稀釋作用小，利于檢測。

附圖說明

圖1為所得20 μm內(nèi)徑固定相為四層納米金球的液相開管柱橫截面的掃描電鏡圖。

圖2為所得通過Orbitrap MS檢測到的20 μm內(nèi)徑固定相為四層納米金球的液相開管柱100個Hep3B細胞的蛋白酶解液餾分的總離子流圖。

圖3為所得40 μm內(nèi)徑固定相為六層納米金球的液相開管柱橫截面的掃描電鏡圖。

圖4為所得通過Orbitrap MS檢測到的40 μm內(nèi)徑固定相為六層納米金球的液相開管柱500個HeLa細胞的蛋白酶解液餾分的總離子流圖。

具體實施方式

下面的實施例是對本發(fā)明的進一步說明，而不是限制本發(fā)明的范圍。

實施例1：20 μm內(nèi)徑固定相為四層納米金球的液相開管柱的制作：

（1）取一根2 m長，365 μm外徑，20 μm內(nèi)徑的石英毛細管，室溫下，依次用0.2 mol/L NaOH沖洗10 min，用水沖洗5 min，用0.1 mol/L HCl沖洗5 min，用水沖洗5 min，用CH₃CN沖洗5 min；

（2）將100 μL 3-氨丙基三甲氧基硅烷溶于400 μL 乙腈中，將所得溶液通入步驟（1）所得石英毛細管中，在60 ℃下加熱反應(yīng)14 h；

（3）將納米金球顆粒直徑為60 nm的金溶膠置于瓶口具有橡膠塞的氣瓶中；氣瓶和鋼瓶之間用內(nèi)徑為100 μm內(nèi)徑的石英毛細管連接；步驟（2）所得石英毛細管直接插在氣瓶內(nèi)的金溶膠中；在30 ℃，2 bar壓力下，使用氦氣鋼瓶的氦氣，將500倍毛細管體積金溶膠壓入毛細管中；

（4）將二巰基壬烷的二甲亞砜溶液置于瓶口具有橡膠塞的氣瓶中，濃度為20%（v/v）；氣瓶和鋼瓶之間用內(nèi)徑為100 μm內(nèi)徑的石英毛細管連接；步驟（3）所得石英毛細管直接插在氣瓶內(nèi)的二巰基壬烷試劑中；在30 ℃，2 bar壓力下，使用氦氣鋼瓶的氦氣，將100倍毛細管體積二巰基壬烷試劑壓入毛細管中；

（5）將納米金球顆粒直徑為60 nm的金溶膠置于瓶口具有橡膠塞的氣瓶中；氣瓶和鋼瓶之間用內(nèi)徑為100 μm內(nèi)徑的石英毛細管連接；步驟（4）所得石英毛細管直接插在氣瓶內(nèi)的金溶膠中；在30 ℃，2 bar壓力下，使用氦氣鋼瓶的氦氣，將500倍毛細管體積金溶膠壓入毛細管中；

（6）重復(fù)步驟（4）和（5），重復(fù)次數(shù)2次；

（7）將巰基十八烷的丙醇溶液置于瓶口具有橡膠塞的氣瓶中，濃度為30%（v/v）；氣瓶和鋼瓶之間用內(nèi)徑為100 μm內(nèi)徑的石英毛細管連接；步驟（6）所得石英毛細管直接插在氣瓶內(nèi)的巰基十八烷試劑中；在30 ℃，2 bar壓力下，使用氦氣鋼瓶的氦氣，將300倍毛細管體積二巰基壬烷試劑壓入毛細管中。

圖1為所得20 μm內(nèi)徑固定相為四層納米金球的液相開管柱橫截面的掃描電鏡圖。

實施例2：將實施例1所得20 μm內(nèi)徑固定相為四層納米金球的液相開管柱用于100個細胞的蛋白酶解液的色譜分離與Orbitrap MS在線檢測：

（1）將實例1所得液相開管柱裝入納升色譜系統(tǒng)；

（2）使用納升色譜系統(tǒng)的自動進樣系統(tǒng)對實施例1所得液相開管柱進樣，樣品為100個Hep3B細胞的蛋白酶解液，進樣量為20 fmol；

（3）使用納升色譜系統(tǒng)洗脫實例1所得液相開管柱中的100個Hep3B細胞的蛋白酶解液，流速100 nL/min,梯度洗脫，從99% 流動相A相（水，0.1%甲酸），1% 流動相B相(乙腈，0.1%甲酸)到60%流動相A相，40%流動相B相；

（4）使用Orbitrap MS對步驟（10）所得色譜餾分進行在線檢測，離子源為電噴霧離子源。

圖2為所得通過Orbitrap MS檢測到的20 μm內(nèi)徑固定相為四層納米金球的液相開管柱100個Hep3B細胞的蛋白酶解液餾分的總離子流圖。

實施例3：40 μm內(nèi)徑固定相為六層納米金球的液相開管柱的制作：

（1）取一根3 m長，365 μm外徑，40 μm內(nèi)徑的石英毛細管，室溫下，依次用0.1 mol/L NaOH沖洗5 min，用水沖洗5 min，用0.2 mol/L HCl沖洗15 min，用水沖洗35 min，用CH₃CN沖洗3 min；

（2）將100 μL 3-氨丙基三甲氧基硅烷溶于500 μL 乙腈中，將所得溶液通入步驟（1）所得石英毛細管中，在80 ℃下加熱反應(yīng)12 h；

（3）將納米金球顆粒直徑為30 nm的金溶膠置于瓶口具有橡膠塞的氣瓶中；氣瓶和鋼瓶之間用內(nèi)徑為100 μm內(nèi)徑的石英毛細管連接；步驟（2）所得石英毛細管直接插在氣瓶內(nèi)的金溶膠中；在25 ℃，1 bar壓力下，使用氦氣鋼瓶的氦氣，將400倍毛細管體積金溶膠壓入毛細管中；

（4）將二巰基壬烷的甲醇溶液置于瓶口具有橡膠塞的氣瓶中，濃度為15%（v/v）；氣瓶和鋼瓶之間用內(nèi)徑為100 μm內(nèi)徑的石英毛細管連接；步驟（3）所得石英毛細管直接插在氣瓶內(nèi)的二巰基壬烷試劑中；在25 ℃，1 bar壓力下，使用氦氣鋼瓶的氦氣，將70倍毛細管體積二巰基壬烷試劑壓入毛細管中；

（5）將納米金球顆粒直徑為30 nm的金溶膠置于瓶口具有橡膠塞的氣瓶中；氣瓶和鋼瓶之間用內(nèi)徑為100 μm內(nèi)徑的石英毛細管連接；步驟（4）所得石英毛細管直接插在氣瓶內(nèi)的金溶膠中；在25 ℃，1 bar壓力下，使用氦氣鋼瓶的氦氣，將400倍毛細管體積金溶膠壓入毛細管中；

（6）重復(fù)步驟（4）和（5），重復(fù)次數(shù)4次；

（7）將巰基十八烷的丙醇溶液置于瓶口具有橡膠塞的氣瓶中，濃度為40%（v/v）；氣瓶和鋼瓶之間用內(nèi)徑為100 μm內(nèi)徑的石英毛細管連接；步驟（6）所得石英毛細管直接插在氣瓶內(nèi)的巰基十八烷試劑中；在25 ℃，1 bar壓力下，使用氦氣鋼瓶的氦氣，將400倍毛細管體積二巰基壬烷試劑壓入毛細管中。

圖3為所得40 μm內(nèi)徑固定相為六層納米金球的液相開管柱橫截面的掃描電鏡圖。

實施例4：將實施例1所得40 μm內(nèi)徑固定相為六層納米金球的液相開管柱用于500個細胞的蛋白酶解液的色譜分離與Orbitrap MS在線檢測：

（1）將實例1所得液相開管柱裝入納升色譜系統(tǒng)；

（2）使用納升色譜系統(tǒng)的自動進樣系統(tǒng)對實施例1所得液相開管柱進樣，樣品為500個HeLa細胞的蛋白酶解液，進樣量為100 fmol；

（3）使用納升色譜系統(tǒng)洗脫實例1所得液相開管柱中的500個HeLa細胞的蛋白酶解液，流速300 nL/min,梯度洗脫，從99% 流動相A相（水，0.1%甲酸），1% 流動相B相(乙腈，0.1%甲酸)到60%流動相A相，40%流動相B相；

（4）使用Orbitrap MS對步驟（10）所得色譜餾分進行在線檢測，離子源為電噴霧離子源。

圖4為所得通過Orbitrap MS檢測到的40 μm內(nèi)徑固定相為六層納米金球的液相開管柱500個HeLa細胞的蛋白酶解液餾分的總離子流圖。