一種流式細胞系統熒光壽命高斯擬合測量方法與流程

本發明涉及熒光檢測及光譜分析領域，具體涉及流式細胞儀的熒光強度檢測及熒光壽命時域估算領域。

背景技術：

流式細胞儀是一種集激光技術、電子物理技術、光電測量技術、電子計算機技術、細胞熒光化學技術和單克隆抗體技術為一體的新型高科技儀器。對懸液中處于高速、直線流動的單細胞或其他顆粒，通過檢測散射光信號和(或)標記的熒光信號，實現高速逐一的多參數定量分析。在細胞生物學、細胞周期動力學、免疫學、血液學及腫瘤學等領域具有廣泛的應用。

流式細胞儀對懸液中處于高速、直線流動的單細胞或其他顆粒，通過檢測散射光信號和(或)標記的熒光信號，實現高速逐一的多參數定量分析。在細胞生物學、細胞周期動力學、免疫學、血液學及腫瘤學等領域具有廣泛的應用。流式細胞儀實現前向散射光(FS)、側向散射光(SS)及各色熒光信號(FLn)的收集及光電轉換，并對轉換后的脈沖信號進行多參數提取，最終根據提取得到的多參數實現對細胞/微球的統計學分析。熒光壽命測量能夠提供有機熒光素、熒光蛋白和其他可發熒光的無機分子相關的熒光弛豫、強度衰減等信息。并且熒光壽命不存在熒光強度測量過程中存在的非線性問題，所以熒光壽命被引入到流式細胞儀單細胞測量中作為一個多參數信息。

應用到流式分析的熒光壽命測量方法主要有頻域方法和時域方法兩種。頻域方法系統中，通過高頻正弦信號對激發光源進行調制，從而使激發出的熒光信號與激發光具有相同的調制頻率，并且兩者之間存在一定的相移。時域方法系統中，利用飛秒激光器作為激發光源對樣品或細胞進行激發，通過單光子計數器及指數衰減模型對熒光衰減時間進行觀測。頻域方法和時域方法都會大大增加傳統流式細胞儀的成本及復雜程度。

2014年C.Ruofan等人提出利用數字信號處理方法對傳統流式細胞儀熒光信號時延進行分析，在不改變流式細胞儀結構的情況下采用250Mbps高速ADC芯片對熒光信號進行采樣并利用(Direct method、Gaussian Fitting、Half Area)3種方法對熒光壽命進行計算，計算結果的時域分辨能力受限于ADC的采樣頻率。

技術實現要素：

為了解決上述問題，本發明的目的在于提供一種流式細胞系統熒光壽命高斯擬合測量方法，所述方法包括以下步驟：

1)利用時間微元法求出瞬時散射光強度和熒光信號強度，

由以下公式得出t時刻散射光強度：

其中，R為熒光微球的半徑，dx為微元的寬度，x為微元距位置原點的距離；

由以下公式得出t時刻熒光信號強度：

其中，τ為衰減周期；

2)利用卷積法對峰值位置的變化進行分析：

3)利用高斯擬合對散射光信號與熒光信號進行表示，得到的脈沖信號進行高斯擬合。

優選地，所述步驟3)中對擬合結果的評價指標為：

均方分誤差：RMSE(root-mean-square-error)

確定系數：R-square

預測數據與原始數據均值之差的平方和SSR。

原始數據和均值之差的平方和SST。

應當理解，前述大體的描述和后續詳盡的描述均為示例性說明和解釋，并不應當用作對本發明所要求保護內容的限制。

附圖說明

參考隨附的附圖，本發明更多的目的、功能和優點將通過本發明實施方式的如下描述得以闡明，其中：

圖1為散射光脈沖產生原理示意圖；

圖2為散射光產生機理示意圖；其中圖2(a)為第一個微元S1的散射光fs_S1產生過程示意圖；圖2(b)為最后一個微元Sn的散射光fs_Sn產生過程示意圖；

圖3為熒光產生機理示意圖；

圖4為利用卷積法與時間微元法進行分析的結果圖；

圖5為前向散射光信號fs及高斯擬合結果圖；

圖6為熒光信號fl1及高斯擬合結果圖；

圖7為熒光信號fl2及高斯擬合結果圖；

圖8為熒光信號fl3及高斯擬合結果圖；

圖9為三路熒光信號熒光時延直方圖。

具體實施方式

通過參考示范性實施例，本發明的目的和功能以及用于實現這些目的和功能的方法將得以闡明。然而，本發明并不受限于以下所公開的示范性實施例；可以通過不同形式來對其加以實現。說明書的實質僅僅是幫助相關領域技術人員綜合理解本發明的具體細節。

在下文中，將參考附圖描述本發明的實施例。在附圖中，相同的附圖標記代表相同或類似的部件，或者相同或類似的步驟。

本發明提供了一種對熒光脈沖信號進行高斯擬合的時延估計方法，利用熒光脈沖信號與散射光脈沖信號之間的時延，實現對熒光壽命的測量。高斯擬合的時延估計方法具有：(1)硬件電路系統結構簡單，易于實現；(2)避免了光強調制及高速處理模塊之間的同步等問題；(3)完全由數字信號處理芯片完成，計算速度快，靈活性好；(4)計算所得熒光壽命的時域分辨率不受ADC采樣頻率限制等優勢。

在流式細胞儀檢測過程中，散射光信號強度與光斑位置關系的產生原理如圖1所示，將熒光微球分成n個徑向等寬度的微元，寬度為dx，令微元距位置原點(l＝0)的距離為x(0≤x≤2R)，則該微元對應的表面積為

第一個微元S1的散射光fs_S1產生過程如圖2(a)所示，在時間微元范圍內散射光強度不存在衰減，故用矩形進行表示。fs_S1起始時刻為0，終止時刻為L/v。最后一個微元Sn的散射光fs_Sn產生過程如圖2(b)所示。fs_Sn起始時刻為2R/v，終止時刻為(L+2R)/v。光斑范圍內各個微元的散射光疊加可得對應時刻的瞬時散射光強度。t時刻散射光強度為：

熒光信號具有衰減特性，假定為單指數衰減其中τ為衰減周期(熒光信號衰減為初始值的1/e)。散射光信號fs(t)包含微球位置、相應的激發光斑強度分布等信息，故利用fs(t)作為熒光信號時間微元分析的初始時刻光強信號。圖3為熒光信號按照時間微元分析得到的效果圖。t時刻熒光信號強度為：

另外，利用卷積法對峰值位置的變化進行分析：

fl(t)與fs(t)的相頻差即為的相頻即，對應的時域時延為τ。散射光信號：熒光信號：

本發明的一個實施例激發光斑短軸長度L＝22μm，沿短軸的強度分布為熒光微球半徑R＝10μm，微球流速v＝10.5m/s。FS、FLm的采樣頻率為100MHz，即脈沖序列相鄰數據點之間的時間間隔為10ns。

本發明利用卷積法及時間微元法計算得到的熒光信號強度曲線如圖4所示。時間微元法曲線的包絡與卷積法結果一致，兩者峰值點相對于fs(t)峰值點時延均為衰減周期τ。散射光信號具有中心對稱性，且對稱中心為光斑中心位置l＝L/2，對應時刻為t＝(L+2R)/2。熒光信號相對于散射光信號的時延為衰減函數的衰減周期τ，同時衰減函數會引起熒光信號波形的非對稱性，并且τ越大波形的非對稱性越明顯。由于熒光信號寬度約為τ的102～103倍，故引起的非對稱性不是很顯著。

本發明利用高斯擬合對散射光信號與熒光信號進行表示，對100MSPS得到的脈沖信號進行高斯擬合，擬合結果如表1所示。具體波形如圖5～8所示。擬合結果的評價指標為：

均方分誤差：RMSE(root-mean-square-error)

確定系數：R-square

SSR:Sum of squares of the regression.預測數據與原始數據均值之差的平方和。

SST:Total sum of squares.原始數據和均值之差的平方和。

擬合結果為：a1＝10.51；b1＝2.01；c1＝0.5；評價指標：RMSE＝2.21×10^-5；R-square＝1.000；即，包含單指數衰減特性的熒光信號可以用高斯模型進行有效的表征。

本發明分別對1000組脈沖數據進行高斯擬合分析。最終得到平均值及標準差及變異系數(CV,coefficient of variation)，如表2所示，相應直方圖如圖9所示。

表1.高斯擬合結果及評價指標

表2熒光時延計算結果統計分析

結合這里披露的本發明的說明和實踐，本發明的其他實施例對于本領域技術人員都是易于想到和理解的。說明和實施例僅被認為是示例性的，本發明的真正范圍和主旨均由權利要求所限定。