一種快速區(qū)分單增李斯特菌與斯氏李斯特菌的檢測方法與流程

本發(fā)明涉及一種利用頂空氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(Headspace gas chromatography-mass spectrometry，HS-GC-MS)技術(shù)快速區(qū)分單增李斯特菌與斯氏李斯特菌的檢測方法。

背景技術(shù)：

單核細胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)簡稱單增李斯特菌，是一種能夠引起人獸共患病的食源性致病菌。單增李斯特菌可污染許多食品，包括生家禽、家畜肉、發(fā)酵香腸和海產(chǎn)品等。WHO將其列為20世紀(jì)90年代食品中四大致病菌之一。它在自然界中分布廣泛，4℃的環(huán)境中仍可生長繁殖，是冷藏食品威脅人類健康的主要病原菌之一，極易污染食品而引起食物中毒和李斯特菌病(由單增李斯特菌引起的急性傳染病)的暴發(fā)，尤其是在歐美國家經(jīng)常發(fā)生，給人類的健康及畜牧業(yè)的生產(chǎn)帶來嚴(yán)重的威脅。近年來，歐美國家因食品感染的李斯特菌病患者呈上升趨勢：2014年9月，丹麥發(fā)生一起因食用香腸中毒事件，12人死亡，還有至少20人被李斯特菌感染。經(jīng)調(diào)查，疑似使用了被單增李斯特菌污染的原料肉。2015年4月9日，美國疾病控制預(yù)防中心宣布，美國至少8人因食用冰淇淋產(chǎn)品后，感染單增李斯特菌而患病就醫(yī)，已經(jīng)導(dǎo)致3人死亡。美國疾病預(yù)防控制中心(CDC)估計，美國每年約有2600人感染單增李斯特菌，其中約1500人罹患李斯特菌病住院治療，約260人死亡。世界糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組織(FAO/WHO)風(fēng)險評估報告(JEMRA，2004)中指出，李斯特菌病的平均死亡率為20～30％。2001年11月以來，我國質(zhì)檢部門多次從美國、加拿大、法國、愛爾蘭、比利時、丹麥等二十多家肉類加工廠進口的豬腰、豬肚、豬耳、小排等三十多批近千噸豬副產(chǎn)品中檢出單增李斯特菌等食源致病菌。

單增李斯特菌的鑒定多采用傳統(tǒng)的生化反應(yīng)實驗和溶血試驗等，該方法所需時間長，一般情況下需要5～7天，很難滿足快速鑒定的需要。國家標(biāo)準(zhǔn)《GB 4789.30-2010》中，溶血試驗：單增李斯特氏菌和斯氏李斯特氏菌(Listeria seeligeri)在刺種點周圍都產(chǎn)生狹小的透明溶血環(huán)，兩者難以區(qū)分；協(xié)同溶血試驗(cAMP)：單核細胞增生李斯特氏菌在靠近金黃色葡萄球菌的接種端溶血增強，斯氏李斯特氏菌的溶血也增強，兩者也無法區(qū)分。近幾年發(fā)展起來的PCR技術(shù)，是一種快速、靈敏、特異性好的技術(shù)，但是目前該技術(shù)還是依賴于傳統(tǒng)方法的前增菌步驟，增菌液中往往含有PCR抑制劑，從而影響PCR的擴增結(jié)果。斯氏李斯特氏菌和單增李斯特菌都屬于李斯特菌屬，采用免疫學(xué)檢測方法，操作簡便，可在同一時間內(nèi)檢測大量樣品，但由于菌體及鞭毛抗原交叉反應(yīng)的存在，難以進行李斯特菌屬種間特異性鑒別。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種快速區(qū)分單增李斯特菌與斯氏李斯特菌的檢測方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)的上述缺點，從而為食品安全提供科學(xué)的依據(jù)和指導(dǎo)作用。

本發(fā)明的主要原理為：利用頂空氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(Headspace gas chromatography-mass spectrometry，HS-GC-MS)技術(shù)檢測單增李斯特菌與斯氏李斯特菌液態(tài)發(fā)酵代謝的揮發(fā)性產(chǎn)物，根據(jù)兩種細菌產(chǎn)生的代謝揮發(fā)性產(chǎn)物種類不同，區(qū)分單增李斯特菌與斯氏李斯特菌。

具體包括下列步驟：

1、單增李斯特菌與斯氏李斯特菌的培養(yǎng)物制備

接種環(huán)轉(zhuǎn)接菌株到滅菌的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，30～40℃，100～200r/min條件下，搖床振蕩培養(yǎng)8～24h。吸取該培養(yǎng)物5～10mL轉(zhuǎn)入20mL頂空瓶內(nèi)，加蓋密封，作為測試樣品。

其中，營養(yǎng)肉湯組分為：蛋白胨10.0g/L，牛肉粉3.0g/L，氯化鈉5.0g/L，葡萄糖1.0g/L。

2、HS-GC-MS分析

頂空(HS)進樣條件：加熱箱溫度30～60℃，定量環(huán)溫度：85℃，傳輸線溫度：100℃，樣品平衡時間：30～60min；色譜柱壓力：7.7psi；填充壓力：15psi；加壓時間：0.2min；進樣持續(xù)時間：1.0min，拔針時間：0.5min。

氣相色譜(GC)條件：色譜柱(30m×250μm×0.25μm)；分流進樣，分流比為5:1，隔墊吹掃流量為3mL/min；升溫程序：初始溫度35～55℃保持2～10min，以3～10℃/min升至120～200℃；再以5～10℃/min升至250℃，保持1～5min，進樣口溫度：250℃；載氣：高純氦(He)，流速：1mL/min。

質(zhì)譜(MS)條件：離子源EI，離子源溫度230℃，四級桿溫度150℃，電子能量70eV，傳輸線溫度280℃，采集模式全掃描，質(zhì)量掃描范圍m/z：33～300u，溶劑延遲：1～3min。

3、代謝揮發(fā)性產(chǎn)物的定性與定量

MS結(jié)果經(jīng)計算機檢索譜庫進行定性分析，同時由軟件系統(tǒng)完成手動對照檢索。采用提取離子流方式報告揮發(fā)性物質(zhì)的峰面積。

其中，兩種細菌產(chǎn)生的代謝揮發(fā)性產(chǎn)物種類不同，區(qū)分化合物為十二醇，單增李斯特菌的液態(tài)發(fā)酵代謝的揮發(fā)性產(chǎn)物中可以檢測到十二醇，并且采用面積歸一法計算十二醇的相對含量為10％～30％，而斯氏李斯特菌的液態(tài)發(fā)酵代謝的揮發(fā)性產(chǎn)物中未檢測到十二醇。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明的方法作為一種篩選工具，比現(xiàn)有的傳統(tǒng)生化實驗鑒定時間縮短1-2天，可以快速區(qū)分平板上的單增李斯特菌與斯氏李斯特菌，實現(xiàn)當(dāng)天篩選。相對于PCR方法和免疫方法，該篩選方法自動化程度更高，降低一線檢測人員接觸食源致病菌的幾率，減少食源致病菌對人和環(huán)境污染的風(fēng)險。

具體實施方式

下列實施例進一步說明本發(fā)明，但不應(yīng)當(dāng)作對本發(fā)明的限制。

圖1是單增李斯特菌ATCC 13932與斯氏李斯特菌ATCC 35967產(chǎn)生的揮發(fā)性化合物的總離子流色譜圖。

圖2是單增李斯特菌ATCC 19114與斯氏李斯特菌ATCC 35867產(chǎn)生的揮發(fā)性化合物的總離子流色譜圖。

實施例1

(1)單增李斯特菌(Listeria monocytogenes)ATCC 13932與斯氏李斯特菌(Listeria seeligeri)ATCC 35967的培養(yǎng)物制備

采用接種環(huán)，無菌操作轉(zhuǎn)接單增李斯特菌ATCC 13932到5mL的滅菌營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，36℃，150r/min條件下，搖床振蕩培養(yǎng)12h。吸取全部培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入20mL安捷倫鉗口頂空樣品瓶內(nèi)，加蓋密封，作為單增李斯特菌待測試培養(yǎng)物。

采用接種環(huán)，無菌操作轉(zhuǎn)接斯氏李斯特菌ATCC 35967到5mL的滅菌營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，36℃，150r/min條件下，搖床振蕩培養(yǎng)12h。吸取全部培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入20mL安捷倫鉗口頂空樣品瓶內(nèi)，加蓋密封，作為斯氏李斯特菌待測試培養(yǎng)物。

其中，營養(yǎng)肉湯組分為：蛋白胨10.0g/L，牛肉粉3.0g/L，氯化鈉5.0g/L，葡萄糖1.0g/L。購自北京陸橋技術(shù)責(zé)任有限公司。

(2)培養(yǎng)物的頂空氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法分析

采用美國安捷倫公司Agilent 7890B-5977A系列氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)(配有Agilent7697A頂空自動進樣器)對單增李斯特菌待測試培養(yǎng)物、斯氏李斯特菌待測試培養(yǎng)物進行揮發(fā)性產(chǎn)物的化學(xué)分析。頂空進樣、氣相色譜和質(zhì)譜條件如下：

頂空(HS)進樣條件：加熱箱溫度52℃，定量環(huán)溫度：85℃，傳輸線溫度：100℃，樣品平衡時間：50min；色譜柱壓力：7.7psi；填充壓力：15psi；加壓時間：0.2min；進樣持續(xù)時間：1.0min，拔針時間：0.5min。

氣相色譜(GC)條件：HP-INNOWax色譜柱(30m×250μm×0.25μm)；分流進樣，分流比為5:1，隔墊吹掃流量為3mL/min；升溫程序：初始溫度40℃保持5min，以3℃/min升至140℃；再以6℃/min升至250℃，保持5min，進樣口溫度：250℃；載氣：高純氦(He)，流速：1mL/min。

質(zhì)譜(MS)條件：離子源EI，離子源溫度230℃，四級桿溫度150℃，電子能量70eV，傳輸線溫度280℃，采集模式全掃描，質(zhì)量掃描范圍m/z：33～300u，溶劑延遲：2.2min。

3、代謝揮發(fā)性產(chǎn)物的定性與定量

采用安捷倫GCMS Chemstation軟件中的譜庫(NIST11.L)對氣相色譜-質(zhì)譜結(jié)果進行化合物的定性分析，同時由NIST MS Search 2.0軟件系統(tǒng)完成手動對照檢索，要求正反向匹配因子(Match)都大于700(良好匹配)，可能性(Prob.％)大于60。采用提取離子流方式計算揮發(fā)性物質(zhì)的峰面積，利用面積歸一法計算揮發(fā)性化合物的相對含量。選取相對含量大于1％的代表性揮發(fā)性化合物作為區(qū)分單增李斯特菌與斯氏李斯特菌的化合物種類(表1)。

表1單增李斯特菌ATCC 13932與斯氏李斯特菌ATCC 35967產(chǎn)生的各種揮發(fā)性化合物

注：CAS編號是化學(xué)物質(zhì)登錄號。

單增李斯特菌ATCC 13932與斯氏李斯特菌ATCC 35967產(chǎn)生的揮發(fā)性化合物的總離子流色譜圖(圖1)可以直觀顯示出兩種細菌的化合物種類差別。其中，斯氏李斯特菌ATCC 35967的揮發(fā)性化合物(圖1-A)中未檢測到十二醇，而在單增李斯特菌ATCC 13932的揮發(fā)性化合物(圖1-B)檢測到十二醇(相對含量16.12％)。十二醇，又名月桂醇，具有頗弱但很持久的油脂氣息，在大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌的VCs中普遍存在^[1]，可以用來區(qū)別單增李斯特菌ATCC 13932與斯氏李斯特菌ATCC 35967。

實施例2

(1)單增李斯特菌(Listeria monocytogenes)ATCC 19114與斯氏李斯特菌(Listeria seeligeri)ATCC 35867的培養(yǎng)物制備

采用接種環(huán)，無菌操作轉(zhuǎn)接單增李斯特菌ATCC 19114到5mL的滅菌營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，36℃，150r/min條件下，搖床振蕩培養(yǎng)12h。吸取全部培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入20mL安捷倫鉗口頂空樣品瓶內(nèi)，加蓋密封，作為單增李斯特菌待測試培養(yǎng)物。

采用接種環(huán)，無菌操作轉(zhuǎn)接斯氏李斯特菌ATCC 35867到5mL的滅菌營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，36℃，150r/min條件下，搖床振蕩培養(yǎng)12h。吸取全部培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入20mL安捷倫鉗口頂空樣品瓶內(nèi)，加蓋密封，作為斯氏李斯特菌待測試培養(yǎng)物。

營養(yǎng)肉湯(Nutrient Broth)購自北京陸橋技術(shù)責(zé)任有限公司。

(2)培養(yǎng)物的頂空氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法分析

采用美國安捷倫公司Agilent 7890B-5977A系列氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)(配有Agilent 7697A頂空自動進樣器)對單增李斯特菌待測試培養(yǎng)物、斯氏李斯特菌待測試培養(yǎng)物進行揮發(fā)性產(chǎn)物的化學(xué)分析。頂空進樣、氣相色譜和質(zhì)譜條件如下：

頂空(HS)進樣條件：加熱箱溫度55℃，定量環(huán)溫度：85℃，傳輸線溫度：100℃，樣品平衡時間：50min；色譜柱壓力：7.7psi；填充壓力：15psi；加壓時間：0.2min；進樣持續(xù)時間：1.0min，拔針時間：0.5min。

氣相色譜(GC)條件：HP-INNOWax色譜柱(30m×250μm×0.25μm)；分流進樣，分流比為5:1，隔墊吹掃流量為3mL/min；升溫程序：初始溫度40℃保持5min，以3℃/min升至140℃；再以6℃/min升至250℃，保持5min，進樣口溫度：250℃；載氣：高純氦(He)，流速：1mL/min。

質(zhì)譜(MS)條件：離子源EI，離子源溫度230℃，四級桿溫度150℃，電子能量70eV，傳輸線溫度280℃，采集模式全掃描，質(zhì)量掃描范圍m/z：33～300u，溶劑延遲：2.2min。

3、代謝揮發(fā)性產(chǎn)物的定性與定量

采用安捷倫GCMS Chemstation軟件中的譜庫(NIST11.L)對氣相色譜-質(zhì)譜結(jié)果進行化合物的定性分析，同時由NIST MS Search 2.0軟件系統(tǒng)完成手動對照檢索，要求正反向匹配因子(Match)都大于700(良好匹配)，可能性(Prob.％)大于60。采用提取離子流方式計算揮發(fā)性物質(zhì)的峰面積，利用面積歸一法計算揮發(fā)性化合物的相對含量。選取相對含量大于1％的代表性揮發(fā)性化合物作為區(qū)分單增李斯特菌與斯氏李斯特菌的化合物種類(表2)。

表2單增李斯特菌ATCC 19114與斯氏李斯特菌ATCC 35867產(chǎn)生的各種揮發(fā)性化合物

注：CAS編號是化學(xué)物質(zhì)登錄號。

單增李斯特菌ATCC 19114與斯氏李斯特菌ATCC 35867產(chǎn)生的揮發(fā)性化合物的總離子流色譜圖(圖2)可以直觀顯示出兩種細菌的化合物種類差別。其中，單增李斯特菌ATCC 19114的揮發(fā)性化合物(圖2-A)檢測到十二醇(相對含量14.45％)，而在斯氏李斯特菌ATCC 35867的揮發(fā)性化合物(圖2-B)中未檢測到十二醇。十二醇，又名月桂醇，具有頗弱但很持久的油脂氣息，在大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌的VCs中普遍存在，可以用來區(qū)別單增李斯特菌ATCC 19114與斯氏李斯特菌ATCC 35867。

當(dāng)然，上述說明并非是對本發(fā)明的限制，本發(fā)明也并不限于上述舉例，本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，在本發(fā)明的實質(zhì)范圍內(nèi)，作出的變化、改型、添加或替換，都應(yīng)屬于本發(fā)明的保護范圍。