本發明屬于酒類檢測領域,具體涉及一種用三維指紋圖譜(高效液相色譜法、氣相色譜法和紫外可見分光光度法)鑒別特定產地特定品種葡萄酒的方法。
背景技術:
葡萄酒是世界上最早的飲料酒之一,在世界各類酒中占據著十分顯赫的位置,其產量在世界飲料酒中列第二位。葡萄酒酒精含量低、營養價值高,是最健康、最衛生的飲料,所以它一直是飲料酒中優先發展的品種之一。葡萄酒(特指紅葡萄酒)不僅具有飲料酒的飲用、滋補功能,而且適量飲用葡萄酒還有保健功能。
葡萄酒跟人們的生活息息相關,因此,其質量的好壞直接關系到人民的身體健康。葡萄酒是以新鮮葡萄或葡萄汁經酵母部分或完全發酵釀制而成的,其酒精體積分數通常為8~16%。
但近年來,部分商家在商業利益的驅使下,制售假葡萄酒,給消費者的身心健康帶來了威脅。一種制假方式是用一種或多種低端葡萄酒混合后貼高端產品的標簽以次充好,另外一種是用水、色素、酒精、香精來調制所謂的葡萄酒,生產原料中唯獨沒有造葡萄酒必備的葡萄原汁。無論是哪種制假方法,都對消費者的消費權益和身心健康造成侵害。
葡萄酒成分多,具有類似中草藥的復雜體系,但葡萄酒因其葡萄品種固定、種植技術穩定和生產工藝的一致,葡萄酒的質量還是具有均一性和穩定性的。因此借鑒中藥研究方法,把建立指紋圖譜方法引入葡萄酒的檢測體系中。葡萄酒指紋圖譜的建立,不需要對葡萄酒各組分物質的定性分析,只需對葡萄酒中主要化學成分的組成和含量利用現代分析技術如色譜分析技術反映出來,再從宏觀上進行分析確定各組分間的差異。
葡萄酒成分大致可分為揮發性成分和不揮發性成分兩大類,揮發性成分包括醇類、酯類、有機酸類、揮發性酚類、硫醇類、萜烯醇類等;不揮發性成分包括黃酮類、氨基酸、糖類、色素、維生素、微量金屬等。由于葡萄酒成分十分復雜,很難通過單一的檢測方法進行產地的溯源和質量鑒定,目前,毛細管柱—氣相色譜分析葡萄酒中揮發性成分是葡萄酒分類鑒定、質量控制以及了解葡萄酒香氣特點的重要手段。而葡萄酒中不揮發性成分可通過液相色譜分析進行鑒定。
技術實現要素:
本發明的目的是提供一種用三維指紋圖譜(高效液相色譜法、氣相色譜法和紫外可見分光光度法)鑒別特定產地特定品種葡萄酒的方法,該方法通過對多批次特定產地特定品種的葡萄酒樣品進行數據收集,利用HPLC和UV建立該產地該品種葡萄酒中提取物的特征指紋圖譜,利用GC法建立該產地該品種葡萄酒二氯甲烷提取物的特征指紋圖譜,最終建立該葡萄酒的共有模式圖譜;將待測葡萄酒樣品的指紋圖譜與該共有模式圖譜進行比較,即可鑒別真假。
本發明的目的通過下述技術方案實現:
一種用三維指紋圖譜鑒別特定產地特定品種葡萄酒的方法,包括以下步驟:
(1)收集多批次的相同品牌或不同品牌的特定產地特定品種葡萄酒,分別用高效液相色譜法、氣相色譜法、紫外可見分光光度法提取各批次該葡萄酒的液相圖譜、氣相圖譜和紫外-可見光吸收光譜;
(2)建立該葡萄酒的共有模式圖譜;
2-1:氣相部分
提取各批次該葡萄酒氣相色譜中的共有峰,以所有共有峰峰面積之和為分母,每個成分的峰面積做分子,處理后為歸一化面積;歸一化面積大于1%為篩選條件,得到若干個指紋特征峰,為該葡萄酒氣相部分的共有模式圖譜;
2-2:液相部分
提取各批次該葡萄酒液相色譜中的共有峰,以所有共有峰峰面積之和為分母,每個成分的峰面積做分子,處理后為歸一化面積;歸一化面積大于0.7%為篩選條件,得到若干個指紋特征峰,為該葡萄酒液相部分的共有模式圖譜;
2-3:紫外-可見光吸收光譜部分
取各批次吸收光譜中各波長吸光值的平均值,建立紫外-可見光吸收光譜的共有模式圖譜;
(3)待測的聲稱是相同產地相同品種的葡萄酒,分別用高效液相色譜法、氣相色譜法、紫外可見分光光度法提取其液相圖譜、氣相圖譜和紫外-可見光吸收光譜,與步驟(2)得到的共有模式圖譜進行比對,依據以下標準判斷其真偽:
3-1:氣相部分
待測葡萄酒的氣相圖譜應含有共有模式圖譜的全部指紋特征峰,同時以相對含量計算各個指紋特征峰的相似度,差值法應全部大于0.9;
3-2:液相部分
待測葡萄酒的液相圖譜應含有共有模式圖譜的全部指紋特征峰,同時以相對峰面積計算各個指紋特征峰的相似度,差值法應全部大于0.9;
3-3:紫外-可見光吸收光譜部分
待測葡萄酒的紫外-可見光吸收光譜與共有模式圖譜進行比較,差值法應全部大于0.9;
若待測葡萄酒的氣相圖譜、液相圖譜和紫外-可見光吸收光譜與共有模式圖譜比對都全部合格,則可以判定待測葡萄酒的確是相同產地相同品種的葡萄酒。
步驟(1)所述的多批次至少需要9個批次;
步驟(1)所述的特定產地是指葡萄酒的主產區,諸如河北秦皇島、山東煙臺、法國波爾多等等;
步驟(1)所述的特定品種是指赤霞珠葡萄酒、梅洛葡萄酒、西拉葡萄酒等等;
步驟(1)和(3)中,葡萄酒樣品做氣相色譜時,樣品的處理步驟如下:
向玻璃離心管加入3mL樣品、7mL二級水和60μL 0.02%(v/v)的內標溶液4-甲基-2-戊醇,然后加入4.5g優級純硫酸銨以提高萃取效率和消除乳化現象,然后加入0.5mL二氯甲烷,于渦旋震蕩儀1100r/min渦旋10min后放入離心機以2500r/min離心10min,取下層二氯甲烷層至300μL微量進樣瓶中用于氣相分析;
氣相色譜標準品溶液的制備:
1、2%(V/V)單標母液的配制:各精密吸取表1中的標準物質(純度為99%左右)2mL于100mL容量瓶中,用無水乙醇定容;
2、0.02%(V/V)內標溶液的配制:精密吸取1.00mL 2%(V/V)4-甲基-2-戊醇于100mL容量瓶中,用無水乙醇定容;
3、混合標液的配制:按表1中各標準物質質量濃度配制,最終混合標液中含12%乙醇,并用酒石酸和0.2M NaOH調節pH值至3.2;
表1:混合標液中各標準物質質量濃度
氣相色譜條件是:40℃保持5min后以3℃/min升溫至190℃,保持10min;載氣為高純氮氣,流速1.5mL/min;進樣量0.5μL;進樣口200℃;分流模式:不分流進樣;
步驟(1)和(3)中,葡萄酒樣品做高效液相色譜時,樣品的處理步驟如下:
將葡萄酒樣品用磷酸調節pH值至2.3,采用SDB-L固相萃取小柱,上樣10ml,不吹干;用磷酸鹽緩沖溶液(pH值2.3)5ml清洗,清洗2次,吹干;用甲醇洗脫三次,每次1ml,吹干;收集洗脫液在55℃條件下,吹至1ml;
液相色譜條件是:
流動相組成:甲醇-磷酸鹽緩沖液(0.2%H3PO4+0.05M NaH2PO4,用磷酸調節pH值2.3);洗脫梯度為:在保留時間為0min、80min、90min、100min、120min時,磷酸鹽緩沖液和甲醇的比例分別為98:2,42:58,10:90,98:2,98:2;流速:1.0ml/min;進樣量:10μl;檢測波長:300nm;柱溫:25℃;
步驟(1)和(3)中,葡萄酒樣品做紫外-可見光吸收光譜時,樣品的處理步驟如下:
取2ml葡萄酒樣品于50ml容量瓶中,加入0.4M磷酸1.7ml,用pH值2.0的磷酸二氫鈉-磷酸緩沖液定容;
紫外-可見光吸收光譜的檢測方法是:
先用空白對照溶液在波長200-800nm下進行基線校正,然后再將處理后的樣品在波長200-800nm下進行掃描,掃描步長為1nm;
步驟(3)所述的差值法,其計算公式如下:
其中,n為特征峰數目或步長,A和B為比較對象;
當本發明方法用于鑒別秦皇島產赤霞珠葡萄酒時,步驟(3)中,氣相部分差值法應全部大于0.9670,液相部分差值法應全部大于0.9380,紫外-可見光吸收光譜部分差值法應全部大于0.9650。
本發明相對于現有技術具有如下的優點及效果:
本發明通過利用HPLC和UV法建立葡萄酒不揮發類物質成分的指紋圖譜,利用GC法建立葡萄酒香氣等揮發性成分的指紋圖譜。通過對兩種類型(揮發性成分指紋圖譜和非揮發性物質指紋圖譜)指紋圖譜數據進行分析和擬合,建立一種三維指紋圖譜技術鑒別特定產地特定品種葡萄酒的方法。本發明具有靈敏、準確、穩定、精密度高、重現性好等優點。
附圖說明
圖1是秦皇島產赤霞珠葡萄酒9個批次的氣相色譜。
圖2是秦皇島產赤霞珠葡萄酒9個批次的液相色譜。
圖3是秦皇島產赤霞珠葡萄酒9個批次的紫外-可見光吸收光譜。
圖4是秦皇島產赤霞珠葡萄酒氣相部分的共有模式圖譜。
圖5是秦皇島產赤霞珠葡萄酒液相部分的共有模式圖譜。
圖6是××品牌批次20120527葡萄酒的液相圖譜。
圖7是××品牌批次20120527葡萄酒的氣相圖譜。
圖8是××品牌批次20120527葡萄酒的紫外-可見光吸收光譜。
圖9是××品牌批次20111211葡萄酒的液相圖譜。
圖10是××品牌批次20111211葡萄酒的氣相圖譜。
圖11是××品牌批次20111211葡萄酒的紫外-可見光吸收光譜。
具體實施方式
下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述,但本發明的實施方式不限于此。
實施例1
一種用三維指紋圖譜鑒別秦皇島產赤霞珠葡萄酒的方法,包括以下步驟:
(1)收集9個批次的不同品牌秦皇島產赤霞珠葡萄酒,分別用高效液相色譜法、氣相色譜法、紫外可見分光光度法提取各批次該葡萄酒的液相圖譜、氣相圖譜和紫外-可見光吸收光譜;
氣相色譜的樣品處理步驟如下:
向玻璃離心管加入3mL樣品、7mL二級水和60μL 0.02%(v/v)的內標溶液4-甲基-2-戊醇,然后加入4.5g優級純硫酸銨以提高萃取效率和消除乳化現象,然后加入0.5mL二氯甲烷,于渦旋震蕩儀1100r/min渦旋10min后放入離心機以2500r/min離心10min,取下層二氯甲烷層至300μL微量進樣瓶中用于氣相分析;
氣相色譜標準品溶液的制備:
1、2%(V/V)單標母液的配制:各精密吸取表1中的標準物質(純度為99%左右)2mL于100mL容量瓶中,用無水乙醇定容;
2、0.02%(V/V)內標溶液的配制:精密吸取1.00mL 2%(V/V)4-甲基-2-戊醇于100mL容量瓶中,用無水乙醇定容;
3、混合標液的配制:按表1中各標準物質質量濃度配制,最終混合標液中含12%乙醇,并用酒石酸和0.2M NaOH調節pH值至3.2;
表1:混合標液中各標準物質質量濃度
氣相色譜條件是:40℃保持5min后以3℃/min升溫至190℃,保持10min;載氣為高純氮氣,流速1.5mL/min;進樣量0.5μL;進樣口200℃;分流模式:不分流進樣;氣相色譜儀(美國PerkinElmer公司,帶PSS分流進樣口、襯管2mm內徑和FID檢測器);TotalChrom色譜工作站(美國PerkinElmer公司);ZB-WAX毛細柱30m×0.25mm×0.25μm(美國)。
高效液相色譜的樣品處理步驟如下:
將葡萄酒樣品用磷酸調節pH值至2.3,采用SDB-L固相萃取小柱,上樣10ml,不吹干;用磷酸鹽緩沖溶液(pH值2.3)5ml清洗,清洗2次,吹干;用甲醇洗脫三次,每次1ml,吹干;收集洗脫液在55℃條件下,吹至1ml;
液相色譜條件是:
流動相組成:甲醇-磷酸鹽緩沖液(0.2%H3PO4+0.05M NaH2PO4,用磷酸調節pH值2.3);洗脫梯度為:在保留時間為0min、80min、90min、100min、120min時,磷酸鹽緩沖液和甲醇的比例分別為98:2,42:58,10:90,98:2,98:2;流速:1.0ml/min;進樣量:10μl;檢測波長:300nm;柱溫:25℃;色譜柱:Phenomenex Gemini 5 C18
紫外-可見光吸收光譜的樣品處理步驟如下:
取2ml葡萄酒樣品于50ml容量瓶中,加入0.4M磷酸1.7ml,用pH值2.0的磷酸二氫鈉-磷酸緩沖液定容;pH值2.0的磷酸二氫鈉-磷酸緩沖液的配制方法如下:分別配制0.2M磷酸二氫鈉溶液和0.4M磷酸溶液,按78:122ml比例混合,測緩沖液實際pH值,若pH值有偏差再調至2.0。
此外,空白對照溶液是:取2mL 10%乙醇溶液于50ml容量瓶中,用pH值2.0的磷酸二氫鈉-磷酸緩沖液定容。
紫外-可見光吸收光譜的檢測方法是:
先用空白對照溶液在波長200-800nm下進行基線校正,然后再將處理后的樣品在波長200-800nm下進行掃描,掃描步長為1nm。
9個批次葡萄酒的氣相色譜圖如圖1所示;
9個批次葡萄酒的液相色譜圖如圖2所示;
9個批次葡萄酒的紫外-可見光吸收光譜如圖3所示;
(2)建立該葡萄酒的共有模式圖譜;
2-1:氣相部分
提取各批次該葡萄酒氣相色譜中的共有峰(共有69個),以所有共有峰峰面積之和為分母,每個成分的峰面積做分子,處理后為歸一化面積;歸一化面積大于1%為篩選條件,得到9個指紋特征峰,為該葡萄酒氣相部分的共有模式圖譜(圖4);
9個指紋特征峰及其歸一化面積分別是:1號峰1-丙醇1.1%,2號峰異丁醇6.0%,3號峰為內標(4-甲基-2-戊醇),4號峰異戊醇40.5%,5號峰乳酸乙酯14.8%,6號峰1.0%,7號峰r-丁內酯1.6%,8號峰琥珀酸二乙酯2.6%,9號峰苯乙醇12.7%,10號峰13.4%(6號、10號為未知峰,未做定性試驗,不影響指紋圖譜建立);
2-2:液相部分
提取各批次該葡萄酒液相色譜中的共有峰,以所有共有峰峰面積之和為分母,每個成分的峰面積做分子,處理后為歸一化面積;歸一化面積大于0.7%為篩選條件,得到24個指紋特征峰,為該葡萄酒液相部分的共有模式圖譜(圖5);
24個特征峰及其歸一化面積分別為:1號峰1.4%,2號峰9.1%,3號峰1.3%,4號峰9.3%,5號峰2.6%,6號峰4.8%,7號峰9.8%,8號峰2.9%,9號峰3.9%,10號峰4.7%,11號峰0.9%,12號峰10.8%,13號峰2.2%,14號峰3.3%,15號峰0.8%,16號峰2.9%,17號峰1.4%,18號峰3.9%,19號峰2.6%,20號峰1.1%,21號峰1.6%,22號峰2.1%,23號峰1.1%,24號峰1.9%;
2-3:紫外-可見光吸收光譜部分
取各批次吸收光譜中各波長吸光值的平均值,建立紫外-可見光吸收光譜的共有模式圖譜(圖3中的R即為共有模式圖譜);
(3)待測的××品牌聲稱是秦皇島產赤霞珠葡萄酒(批次:20120527),分別用高效液相色譜法、氣相色譜法、紫外可見分光光度法提取其液相圖譜(圖6)、氣相圖譜(圖7)和紫外-可見光吸收光譜(圖8),將它們與步驟(2)得到的共有模式圖譜進行比對:
3-1:氣相部分
待測葡萄酒的氣相圖譜含有共有模式圖譜的全部指紋特征峰,同時以相對含量計算相似度,差值法為0.9889,大于0.9670,符合要求;
3-2:液相部分
待測葡萄酒的液相圖譜含有共有模式圖譜的全部指紋特征峰,同時以相對峰面積計算相似度,差值法為0.9884,大于0.9380,符合要求;
3-3:紫外-可見光吸收光譜部分
待測葡萄酒的紫外-可見光吸收光譜與共有模式圖譜進行比較,差值法為0.9717,大于0.9650,符合要求;
待測葡萄酒的氣相圖譜、液相圖譜和紫外-可見光吸收光譜與共有模式圖譜比對都全部合格,可以判定待測葡萄酒的確是秦皇島產赤霞珠葡萄酒。
實施例2
一種用三維指紋圖譜鑒別秦皇島產赤霞珠葡萄酒的方法,包括以下步驟:
秦皇島產赤霞珠葡萄酒的共有模式圖譜見實施例1;
(3)待測的××品牌聲稱是秦皇島產赤霞珠葡萄酒(批次:20111211),分別用高效液相色譜法、氣相色譜法、紫外可見分光光度法提取其液相圖譜(圖9)、氣相圖譜(圖10)和紫外-可見光吸收光譜(圖11),與共有模式圖譜進行比對:
3-1:氣相部分
待測葡萄酒的氣相圖譜含有共有模式圖譜的全部指紋特征峰,同時以相對含量計算相似度,差值法為0.9959,大于0.9670,符合要求;
3-2:液相部分
待測葡萄酒的液相圖譜含有共有模式圖譜的全部指紋特征峰,同時以相對峰面積計算相似度,差值法為0.9485,大于0.9380,符合要求;
3-3:紫外-可見光吸收光譜部分
待測葡萄酒的紫外-可見光吸收光譜與共有模式圖譜進行比較,差值法為0.9689,大于0.9650,符合要求;
待測葡萄酒的氣相圖譜、液相圖譜和紫外-可見光吸收光譜與共有模式圖譜比對都全部合格,可以判定待測葡萄酒的確是秦皇島產赤霞珠葡萄酒。
實施例3
一種用三維指紋圖譜鑒別秦皇島產赤霞珠葡萄酒的方法,包括以下步驟:
秦皇島產赤霞珠葡萄酒的共有模式圖譜見實施例1;
(3)待測的××品牌聲稱是秦皇島產赤霞珠葡萄酒,分別用高效液相色譜法、氣相色譜法、紫外可見分光光度法提取其液相圖譜、氣相圖譜和紫外-可見光吸收光譜,與共有模式圖譜進行比對:
3-1:氣相部分
待測葡萄酒的氣相圖譜含有共有模式圖譜的全部指紋特征峰,同時以相對含量計算相似度,差值法為0.8550,小于0.9670,不符合要求;
3-2:液相部分
待測葡萄酒的液相圖譜含有共有模式圖譜的全部指紋特征峰,同時以相對峰面積計算相似度,差值法為0.7600,小于0.9380,不符合要求;
3-3:紫外-可見光吸收光譜部分
待測葡萄酒的紫外-可見光吸收光譜與共有模式圖譜進行比較,差值法為0.8744,小于0.9650,不符合要求;
待測葡萄酒的氣相圖譜、液相圖譜和紫外-可見光吸收光譜與共有模式圖譜比對都全部不合格,可以判定待測葡萄酒非秦皇島產赤霞珠葡萄酒。
實施例4
一種用三維指紋圖譜鑒別秦皇島產赤霞珠葡萄酒的方法,包括以下步驟:
秦皇島產赤霞珠葡萄酒的共有模式圖譜見實施例1;
(3)待測的××品牌聲稱是秦皇島產赤霞珠葡萄酒,分別用高效液相色譜法、氣相色譜法、紫外可見分光光度法提取其液相圖譜、氣相圖譜和紫外-可見光吸收光譜,與共有模式圖譜進行比對:
3-1:氣相部分
待測葡萄酒的氣相圖譜含有共有模式圖譜的全部指紋特征峰,同時以相對含量計算相似度,差值法為0.3988,小于0.9670,不符合要求;
3-2:液相部分
待測葡萄酒的液相圖譜含有共有模式圖譜的全部指紋特征峰,同時以相對峰面積計算相似度,差值法為0.4180,小于0.9380,不符合要求;
3-3:紫外-可見光吸收光譜部分
待測葡萄酒的紫外-可見光吸收光譜與共有模式圖譜進行比較,差值法為0.7826,小于0.9650,不符合要求;
待測葡萄酒的氣相圖譜、液相圖譜和紫外-可見光吸收光譜與共有模式圖譜比對都全部不合格,可以判定待測葡萄酒非秦皇島產赤霞珠葡萄酒。
上述實施例為本發明較佳的實施方式,但本發明的實施方式并不受上述實施例的限制,其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化,均應為等效的置換方式,都包含在本發明的保護范圍之內。