一種檢測呋喃唑酮代謝物的膠體金免疫層析試紙條及其制備方法與應用與流程

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本發明涉及一種檢測呋喃唑酮代謝物的膠體金免疫層析試紙條及其制備方法與應用，其特別適于動物組織中呋喃唑酮代謝物殘留的檢測，屬于免疫學技術領域和獸藥殘留分析技術領域。

背景技術：

呋喃唑酮(Furazolidone，FZD)，又名痢特靈，是一種硝基呋喃類藥物，對常見的革蘭氏陰性菌和陽性菌有抑制作用，作用于微生物酶系統，抑制乙酰輔酶A，干擾微生物糖代謝，從而起到抑菌作用。廣泛用于水產和禽類，用以治療菌痢、腸炎、球蟲等，以及養殖魚的疥瘡、赤鰭病、潰瘍等。因其殺菌能力強，抗菌譜廣，不易產生耐藥性，口服吸收迅速，與其他抗生素無交叉耐藥性等優點，曾廣泛應用于臨床。呋喃唑酮具有很強的副作用，而且在動物體內很快就代謝為3-氨基-2-唑烷酮(AOZ)，AOZ在胃酸條件下直接代謝成為具有強烈致突變性和致癌性的β-羥乙基肼，對人體健康與生態平衡具有潛在威脅。目前，歐盟、美國、日本、中國等規定禁止在食用動物中使用硝基呋喃類抗生素，我國農業部文件農牧發[2002]1號文件規定食品性動物中呋喃唑酮的檢出限為不得檢出。

目前有關呋喃唑酮殘留的檢測技術主要有高效液相色譜法(HPLC)、液相色譜-質譜聯用法(LC-MS)、液相色譜串聯質譜法(LC-MS/MS)及免疫分析技術，前三種方法靈敏、準確，但操作繁瑣，對實驗設備和技術要求較高，不適合大批量樣品的快速檢測。免疫分析方法包括酶聯免疫吸附法(ELISA)和膠體金免疫層析法(GICA)，具有靈敏度高、特異性好、成本低、操作方便等特點，適于大批量樣品篩選。GICA作為一種新的免疫學檢測方法，既有免疫學方法的特異性，又有簡便快速、不需儀器的特點，其在醫學、動植物檢疫、食品檢測等多領域已得到了廣泛應用。開發呋喃唑酮膠體金試紙條有助于AOZ殘留快速、準確的檢測，有效遏制其在水產品中的違規使用及殘留超標問題，提高人民群眾水產品餐桌質量安全水平。

技術實現要素：

本發明所要解決的技術問題是克服現有技術之缺陷提供一種檢測呋喃唑酮代謝物的膠體金免疫層析試紙條，該膠體金免疫層析試紙條具有操作簡單，快速，適合大批量樣品初篩的優點。此外，本發明進一步提供該檢測呋喃唑酮代謝物的膠體金免疫層析試紙條的制備方法與應用。

本發明所述技術問題是由以下技術方案實現的。

一種檢測呋喃唑酮代謝物的膠體金免疫層析試紙條，該檢測試紙條由底板、樣品墊、膠體金墊、包被膜和吸水墊組成，試紙兩端設有保護膜，所述樣品墊、膠體金墊、包被膜和吸水墊依次粘貼于底板上；其中膠體金墊為吸附有膠體金標記的呋喃唑酮代謝物單克隆抗體，包被膜上含有用AOZ代謝物偶聯載體蛋白的預包被檢測線(T線)，用羊抗或兔抗小鼠IgG溶液預包被的質控線(C線)，兩條線豎直平行排列。

上述膠體金免疫層析試紙條，呋喃唑酮代謝物單克隆抗體為鼠源單克隆抗體，由CCTCC NO：C2016140的雜交瘤細胞株AOZ-4G3產生。該雜交瘤細胞株被命名為雜交瘤細胞株AOZ-4G3，于2016年7月31日送交中國典型培養物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏號為CCTCC NO:C2016140。

上述膠體金免疫層析試紙條，所述呋喃唑酮代謝物單克隆抗體由呋喃唑酮代謝物抗原產生，其為由呋喃唑酮代謝物與載體蛋白采用碳二亞胺法合成的偶聯物，包括免疫原與檢測原；所述載體蛋白為牛血清白蛋白、鼠血清白蛋白、免疫血清蛋白、甲狀腺蛋白、卵清蛋白、血藍蛋白或人血清白蛋白；免疫原優選載體為牛血清白蛋白，檢測原優選載體為卵清蛋白；

上述膠體金免疫層析試紙條，所述底板為PVC條或其它不吸水的硬質材料；所述樣品墊和膠體金墊由玻璃纖維棉制成；所述吸水墊由吸水濾紙制成；所述包被膜可為硝酸纖維素膜或醋酸纖維素膜；所述保護膜為不透明的膠膜。

本發明所述的膠體金層析試紙條制備方法，包括如下步驟：

(1)制備呋喃唑酮代謝物抗原工作液：

(a)呋喃唑酮代謝物衍生化：取0.25g AOZ，用2mL左右的甲醇于室溫下攪拌使之溶解；取0.15g 3-羧基苯甲醛，用2mL甲醇使之溶解，在攪拌下緩慢滴入上述AOZ溶液中，室溫下攪拌反應5h，過濾，烘干濾渣即得呋喃唑酮代謝物的衍生物CPAOZ；

(b)免疫原的合成：稱取50mg的牛血清白蛋白(BSA)溶于pH值7.4的1mL 0.1mol/L的PBS中，加入N,N-二甲基酰胺(DMF)1mL，攪拌溶解；再將步驟(a)所得的CPAOZ 8mg溶于1mLDMF溶液中，攪拌下加入二環己基亞胺(DCC)14mg和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)6mg，4℃下密封攪拌過夜，8000r/min離心15分鐘，收集上清液裝入透析袋中，4℃條件下用pH值7.4的0.01mol/L PBS透析3d，每天換液3-4次，得CPAOZ-BSA溶液；

(c)檢測原的合成：稱取40mg的卵清蛋白(OVA)溶于pH值7.4的1mL 0.1mol/L PBS中，加入N,N-二甲基酰胺(DMF)1mL，攪拌溶解；再將步驟(a)所得的CPAOZ 8mg溶于1mLDMF溶液中，攪拌下加入二環己基亞胺(DCC)14mg和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)6mg，4℃下密封攪拌過夜，8000r/min離心15分鐘，收集上清液裝入透析袋中，4℃條件下用pH值7.4的0.01mol/L PBS透析3d，每天換液3-4次，得CPAOZ-OVA溶液；

(2)制備呋喃唑酮代謝物單克隆抗體工作液：

(a)動物免疫：選擇載體蛋白為牛血清白蛋白的免疫原，免疫6-8周齡的雌性Blab/c小鼠，間隔2周免疫1次，三次免疫后斷尾取血測定效價和抑制率，選擇結果最佳的小鼠準備融合；

(b)細胞融合：取步驟(a)選定的小鼠的脾細胞和小鼠骨髓瘤SP2/O細胞進行融合，間接ELISA法測定上清液選取陽性高的孔，通過有限稀釋法對陽性孔進行亞克隆，直至建立產生單一抗呋喃唑酮代謝物的單克隆抗體的雜交瘤細胞株；

(c)單克隆抗體的大量制備：選取個體較大的雌性Blab/c小鼠，采用體內誘生腹水法，大量制備腹水，并通過辛酸-硫酸銨沉淀純化腹水，分成小管，-20℃保存，得呋喃唑酮代謝物單克隆抗體；

(3)制備膠體金標記的呋喃唑酮代謝物單克隆抗體：

將待標記的呋喃唑酮代謝物單克隆抗體溶液10000r/min離心30min，取膠體金溶液10mL，用0.1mol/L K₂CO₃溶液調節膠體金溶液的pH值至8.2；取等量呋喃唑酮代謝物單克隆抗體溶液，磁力攪拌下與膠體金溶液混合，室溫孵育15min，10000r/min離心30min，棄上清，將所得沉淀用每升含10g BSA、0.5g疊氮鈉、濃度為0.02mol/L的Na₂B₄O₇溶液稀釋，即獲得膠體金標記的呋喃唑酮代謝物單克隆抗體，4℃保存備用；

(4)膠體金墊制備：按規格裁取玻璃纖維棉，將膠體金標記的呋喃唑酮代謝物單克隆抗體用噴金儀均勻噴灑于玻璃纖維棉上，37℃干燥1h，密封，4℃保存備用；

(5)檢測線和質控線的制備：將呋喃唑酮代謝物抗原放于噴金儀貯存池A，羊抗小鼠IgG溶液放于貯存池B，開機分別點射于膜中央，形成間距0.5cm的直線式隱形檢測線和隱形質控線，自然干燥，密封，4℃保存備用；

(6)試紙條組裝：將樣品墊、膠體金墊、包被膜和吸水墊按順序依次粘貼于底板上，并在試紙條兩端的表面粘貼保護膜，在切槽機上切割成試紙條。

上述膠體金層析試紙條在用于檢測動物組織、尿液和牛奶中呋喃唑酮代謝物中的應用。

上述在用于檢測呋喃唑酮代謝物的應用，包括如下步驟：

(1)樣品前處理

(a)肉類、肝臟或水產品樣品組織的前處理

組織勻漿后，稱取2g于50ml離心管中，加入4mL去離子水，1mL 1mol/L鹽酸溶液，振蕩1min，再加入0.5mL對羧基苯甲醛，振蕩1min；取出后加入0.5mol/L磷酸氫二鈉溶液1mL，用1mol/L氫氧化鈉溶液調節PH至7.5左右，振蕩1min，加入5mL乙酸乙酯，振蕩1min，5000rpm離心10min；移取上層乙酸乙酯層溶液于另一離心管中，水相再用5mL乙酸乙酯重復萃取兩次，合并后氮氣吹干；加入1ml正己烷，加蓋振蕩1min，然后加入0.5mL PBST緩沖液，振蕩1min，5000rpm離心10min；吸取下層水相溶液用于分析；

(b)尿樣前處理

將尿樣5000rpm離心5min至清亮，取上清50ul進行檢測；

(c)奶樣前處理

取奶樣2mL室溫條件下5000rpm離心10min，取下層溶液加入4mL去離子水，1mL 1mol/L鹽酸溶液，振蕩1min，再加入0.5mL對羧基苯甲醛，振蕩1min；取出后加入0.5mol/L磷酸氫二鈉溶液1mL，用1mol/L氫氧化鈉溶液調節PH至7.5左右，振蕩1min，加入5mL乙酸乙酯，振蕩1min，5000rpm離心10min；移取上層乙酸乙酯層溶液于另一離心管中，水相再用5mL乙酸乙酯重復萃取兩次，合并后氮氣吹干；加入1ml正己烷，加蓋振蕩1min，然后加入0.5mL PBST緩沖液，振蕩1min，5000rpm離心10min；吸取下層水相溶液用于分析；

(2)用膠體金層析試紙條檢測

從包裝中取出所述檢測呋喃唑酮代謝物的膠體金免疫層析試紙條，將樣品端插入待測樣品液中，插入深度不超過標記線，約10-20秒鐘取出檢測試紙條，水平放置，3-5分鐘觀察判定檢測結果，10分鐘以后結果無效；

(3)結果判定

(a)陽性如果包被膜上對應的質控區C位置顯示一條棕紅色線，檢測區T位置不顯示棕紅色線，表示檢測結果為陽性，說明在待測樣品中含有AOZ；

(b)陰性如果在包被膜上T、C位置顯示有兩天棕紅色線，表示結果為陰性，說明在待測樣品中不含AOZ；

(c)失效當質控區C不顯示出棕紅色條帶，則無論檢測區T顯示出棕紅色條帶與否該試紙均判為無效。

本發明的呋喃唑酮代謝物膠體金層析試紙條的檢測限為4μg/L，與其他3種硝基呋喃代謝物的衍生物CPAHD、CPSEM、CPAMOZ均不存在交叉反應，對樣品的檢測與高效液相色譜結果一致。用本發明膠體金層析試紙條檢測呋喃唑酮代謝物的方法簡便、快速、直觀、準確、適用范圍廣、成本低、易推廣使用。

附圖說明

圖1本發明所述呋喃唑酮代謝物單克隆抗體親和力測定圖

圖2本發明所述呋喃唑酮代謝物單克隆抗體亞型測定圖

圖3本發明所述呋喃唑酮代謝物膠體金層析試紙條試紙剖面結構示意圖

圖4本發明所述呋喃唑酮代謝物膠體金層析試紙條試紙俯視結構示意圖

圖5本發明所述呋喃唑酮代謝物膠體金層析試紙條試紙結果判定圖

本發明所述產生呋喃唑酮代謝物單克隆抗體的雜交瘤細胞株AOZ-4G3，已于2016年7月31日送交中國典型培養物保藏中心(簡稱CCTCC，地址：武漢大學，中國典型培養物保藏中心，郵編：430072)保藏，保藏號為CCTCC NO:C2016140。

具體實施方式

下面結合具體實施方式對本發明作進一步詳細說明，所列舉的實施例不對本發明的內容和保護范圍構成任何限制。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。

實施例一本發明所述呋喃唑酮代謝物抗原的制備

(1)呋喃唑酮代謝物衍生化：取0.25g AOZ，用2mL左右的甲醇于室溫下攪拌使之溶解；取0.15g 3-羧基苯甲醛，用2mL甲醇使之溶解，在攪拌下緩慢滴入上述AOZ溶液中，室溫下攪拌反應5h，過濾，烘干濾渣即得呋喃唑酮代謝物衍生物CPAOZ；

(2)免疫原的合成：稱取50mg的牛血清白蛋白(BSA)溶于pH值7.4的1mL 0.1mol/L的PBS中，加入N,N-二甲基酰胺(DMF)1mL，攪拌溶解；再將步驟(a)所得的CPAOZ 8mg溶于1mLDMF溶液中，攪拌下加入二環己基亞胺(DCC)14mg和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)6mg，4℃下密封攪拌過夜，8000r/min離心15分鐘，收集上清液裝入透析袋中，4℃條件下用pH值7.4的0.01mol/L PBS透析3d，每天換液3-4次，得CPAOZ-BSA溶液；

(3)檢測原的合成：稱取40mg的卵清蛋白(OVA)溶于pH值7.4的1mL 0.1mol/L PBS中，加入N,N-二甲基酰胺(DMF)1mL，攪拌溶解；再將步驟(a)所得的CPAOZ 8mg溶于1mLDMF溶液中，攪拌下加入二環己基亞胺(DCC)14mg和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)6mg，4℃下密封攪拌過夜，8000r/min離心15分鐘，收集上清液裝入透析袋中，4℃條件下用pH值7.4的0.01mol/L PBS透析3d，每天換液3-4次，得CPAOZ-OVA溶液。

實施例二本發明所述呋喃唑酮代謝物單克隆抗體的制備

(1)動物免疫：載體蛋白為牛血清白蛋白的免疫原免疫6-8周齡的雌性Blab/c小鼠，間隔2周免疫1次，三免后斷尾取血測定效價和抑制率，選擇結果最佳的小鼠準備融合；

(2)細胞融合：取小鼠的脾細胞和小鼠骨髓瘤SP2/O細胞，進行融合，間接ELISA法測定上清選取陽性高的孔，通過有限稀釋法對陽性孔進行亞克隆，直至建立產生單一抗呋喃唑酮代謝物的單克隆抗體的雜交瘤細胞株；

(3)單克隆抗體的大量制備：選取個體較大的雌性Blab/c小鼠，采用體內誘生腹水法，大量制備腹水，并通過辛酸-硫酸銨沉淀純化腹水，分成小管，-20℃保存，得呋喃唑酮代謝物單克隆抗體。

實施例三本發明所述呋喃唑酮代謝物單克隆抗體特性鑒定

1、親和力測定

采用非競爭酶聯免疫法測定呋喃唑酮代謝物單克隆抗體的親和常數，結果如圖1所示，親和常數Ka＝1.6×10⁹L/mol。

2、亞型測定

采用購自Sigma公司的鼠源單抗亞型鑒定試劑盒進行亞型測定，結果見圖2所示，呋喃唑酮代謝物單克隆抗體亞型為IgG1。

3、效價測定

以1：40000稀釋包被原包被檢測板，將純化后的單克隆抗體進行1:200，1:400，1:800，……1:800000稀釋，加入到酶標板孔內，反應后加入HRP標記的羊抗鼠二抗，最后用TMB顯色，結果顯示純化后的呋喃唑酮代謝物單克隆抗體濃度為1mg/ml時的效價達1：1024000。

實施例四本發明所述檢測呋喃唑酮代謝物的膠體金層析試紙條

1、膠體金液制備：取100mL蒸餾水，煮沸5min，加入質量濃度為1％的氯金酸1mL和質量濃度為1％的檸檬酸三鈉溶液1.5mL，繼續攪拌加熱，溶液最終經過灰色、酒紅色至呈透亮的紅色，冷卻到室溫，分別通過目測法、紫外分光光度法進行質量鑒定，合格的膠體金溶液4℃避光保存；

2、膠體金標記的呋喃唑酮代謝物單克隆抗體的制備：將待標記的呋喃唑酮代謝物單克隆抗體溶液10000r/min離心30min，取膠體金溶液10mL，用0.1mol/L K₂CO₃溶液調節膠體金溶液的pH值至8.2；取等量呋喃唑酮代謝物單克隆抗體溶液，磁力攪拌下與膠體金溶液混合，室溫孵育15min，10000r/min離心30min，棄上清，將所得沉淀用每升含10g BSA、0.5g疊氮鈉、濃度為0.02mol/L的Na₂B₄O₇溶液稀釋，即獲得膠體金標記的呋喃唑酮代謝物單克隆抗體，4℃保存備用；

3、膠體金墊制備：按規格裁取玻璃纖維棉，將金標抗體用噴金儀均勻噴灑于玻璃纖維棉上，37℃干燥1h，密封，4℃保存備用；

4、檢測線和質控線的制備：將呋喃唑酮代謝物抗原放于噴金儀貯存池A，羊抗小鼠IgG溶液放于貯存池B，開機分別點射于膜中央，形成間距0.5cm的直線式隱形檢測線T線和隱形質控線C線，自然干燥，密封，4℃保存備用；

5、試紙條組裝：將樣品墊、膠體金墊、包被膜和吸水墊按順序依次粘貼于底板上，并在試紙條兩端的表面粘貼保護膜，在切槽機上切割成試紙條。

6、呋喃唑酮代謝物膠體金層析試紙條的結構，參見圖3、圖4。圖中底板1用PVC板制成，樣品墊2用玻璃纖維棉制成，膠體金墊3上吸附有抗呋喃唑酮代謝物單克隆抗體，包被膜4采用硝酸纖維素膜，吸水墊7用吸水濾紙制成，將編號2、3、4、7各層從右至左依次粘貼固定在底板1上，彼此交界處纖維互相交叉滲透。在包被膜4上設有隱形檢測線5和隱形質控線6，隱形檢測線用偶聯呋喃唑酮代謝物的雞卵白蛋白(OVA)溶液印制，隱形質控線用羊抗小鼠IgG抗體溶液印制，兩條印跡平行排列成“︱︱”。8為覆蓋在樣品墊2和膠體金墊3上面的樣品端保護膜，9為覆蓋在吸水墊7上面的手柄端保護膜，在樣品標記線右側的保護膜上印有箭頭及MAX字樣。

實施例五本發明所述膠體金層析試紙條檢測樣品中呋喃唑酮代謝物

(1)樣品前處理

(a)肉類、肝臟或水產品樣品組織的前處理

(b)尿樣前處理

將尿樣5000rpm離心5min至清亮，取上清50ul進行檢測；

(c)奶樣前處理

(2)用膠體金層析試紙條檢測

從包裝中取出所述檢測呋喃唑酮代謝物的膠體金免疫層析試紙條，將樣品端插入待測樣品液中，插入深度不超過標記線，約10-20秒鐘取出檢測試紙條，水平放置，3-5分鐘觀察判定檢測結果，10分鐘以后結果無效。

(3)結果判定

如圖5所示，a為陽性，包被膜上對應的質控區C位置顯示一條棕紅色線，檢測區T位置不顯示棕紅色線，表示檢測結果為陽性，說明在待測樣品中含有AOZ；b為陰性，在包被膜上T、C位置顯示有兩天棕紅色線，表示結果為陰性，說明在待測樣品中不含AOZ；c、d為失效，當質控區C不顯示出棕紅色條帶，則無論檢測區T顯示出棕紅色條帶與否該試紙均判為無效。

實施例六本發明所述呋喃唑酮代謝物膠體金層析試紙條性能檢測

1、靈敏度

將1mg/mL呋喃唑酮代謝物衍生物(1mg CPAOZ溶于1mL甲醇)用PBS分別稀釋為0、1、2、3、4、5、10μg/L的一系列標準溶液，再分別取90μL上述標準溶液滴在試紙條的樣品墊上，3min后觀察試紙條的顯色情況。

當CPAOZ添加濃度為3μg/L時，T線相對于0μg/L時的T線的顏色變淺，而當CPAOZ的添加濃度為4μg/L時，T線消線，說明膠體金試紙條的檢測限為4μg/L。

2、特異性

選取4種硝基呋喃代謝物衍生化試劑(CPAOZ、CPAHD、CPSEM、CPAMOZ)測試，觀察試紙條顯色效果。

將CPAOZ、CPAHD、CPSEM、CPAMOZ母液分別用0.01mol/L、PH7.4的PBS稀釋至50μg/L，滴加到試紙條的樣品孔，檢測結果顯示，制備的呋喃唑酮代謝物膠體金試紙條與其他幾種硝基呋喃類代謝物衍生化試劑不存在交叉反應。

3、準確性

隨機選取8份水產樣品，作為供試試樣。每份樣品分別用HPLC法和本研究制備的CPAOZ膠體金檢測試紙條進行檢測，比較檢測結果。

8份水產樣品經高效液相色譜檢測，其中6份樣品未檢出呋喃唑酮代謝物殘留，3號樣品檢測出AOZ含量1.73μg/kg，7號樣品檢測出AOZ含量2.35μg/kg。這些樣品同時用呋喃唑酮代謝物膠體金試紙條檢測，結果與HPLC法完全符合，見表1。

表1呋喃唑酮代謝物膠體金試紙條與高效液相色譜法檢測結果比較

注：“+”表示陽性，“—”表示陰性。