雙參數扇形免疫磁層析試條的制作方法

本發明涉及生物醫學檢測技術領域，特別涉及一種基于磁納米-抗體復合粒子的多參數扇形層析試條制備技術。

背景技術：

POCT(Point Of Care Testing)即時檢驗是檢驗醫學發展的新領域，它的快速發展得益于當今高新技術的發展和綜合應用，也順應了目前高效快節奏的工作方式，可使病人及時得到診斷和治療。POCT特點中最根本的是省去了標本的復雜預處理過程，在采樣現場即刻進行分析，快速得到檢驗結果，所以它不僅快速而且是現場分析，這是其他檢驗方法無法實現的。POCT的真正含義即：不僅是專業的醫護人員，經過簡單培訓的病人及其家屬也能獨立完成并能獲得有助于臨床診斷的信息的移動檢驗系統。

免疫層析檢測技術是POCT檢測技術中一個成功的應用典范，其中膠體金免疫層析可以快速通過目測方式實現ng/ml量級的快速檢測。但是會受到肉眼觀察的主觀判斷限制，且靈敏度受到一定限制，對于ng～pg/ml等更高量級的檢測需求就會無法達到。上轉換發光粒子(鑭系元素)、量子點、熒光免疫層析技術是近期發展的一類光學免疫層析檢測方法，檢測靈敏度更高，需要激發光和檢測光，但也受限于僅能檢測到檢測條表面的光。

磁粒子免疫層析(Magnetic particles ImmunoChromatographic Test)是結合磁粒子和免疫層析的新型層析技術，它采用超順磁納米粒子(粒子核直徑≤20nm)代替膠體金納米顆粒，通過測量磁場強度來判斷待測樣品的含量。磁免疫層析相比光學免疫層析技術具有幾點優勢：三維透射檢測靈敏度高、順磁粒子性能穩定、檢測范圍寬、檢測儀器比較便宜、標記純化方便、可定量和可定性。

該方法繼承了膠體金免析法操作便捷、可現場檢測的優勢，同時利用持續穩定的特性，較好地克服了膠體金免疫層析法測量時間長與結果不穩定兩大缺點，具有靈敏度高、特異性強、快速、操作簡便以及可現場快速篩查特點。

技術實現要素：

(一)要解決的技術問題

本發明提供了一種雙參數扇形免疫磁層析試條，以解決目前檢測手段不夠便捷、檢測步驟多的局限性問題：目前檢測針對尿液樣品中微量白蛋白及其更低濃度的蛋白類物質和細胞等時，需要多步操作，不適于快速的現場檢測、床邊檢測等。多步檢測反應，需要專業檢驗人員。因此，本發明結合磁納米粒子免疫和層析技術，制備多參數扇形試條，實現簡單快速的POCT多參數檢測。

(二)技術方案

本發明的一個方面提供了一種雙參數扇形免疫磁層析試條，包括兩個單參數免疫磁層析試條，所述單參數免疫磁層析試條包括樣品墊，其特征在于：還包括支撐夾具，

所述支撐夾具采用Y型結構將所述兩個單參數免疫磁層析試條固定；

所述兩個單參數免疫磁層析試條共用一個樣品墊。

上述方案中，所述兩個單參數免疫磁層析試條分別固定mAlb捕獲單抗和Tr捕獲單抗。

上述方案中，所述支撐夾具上設有樣品加樣區。

上述方案中，所述共用的樣品墊固定在所述支撐夾具的樣品加樣區處。

上述方案中，所述支撐夾具選用塑料基材。

上述方案中，所述樣品墊采用高多孔材料。

上述方案中，所述單參數免疫磁層析試條還包括結合墊、檢測帶、質控帶、吸水墊以及基板襯底。

本發明的另一個方面提供了一種雙參數扇形免疫磁層析試條的制備方法，包括：

將兩個單參數免疫磁層析試條固定在一個支撐夾具上，所述支撐夾具采用Y型結構，然后將兩個單參數免疫磁層析試條共同固定在一個樣品墊上。

上述方案中，所述支撐夾具選用塑料基材。

上述方案中，所述樣品墊采用高多孔材料。

(三)有益效果

本發明具有以下有益效果：

1、本發明采用基于磁粒子的雙參數磁免疫層析試條，有效提高了檢測靈敏度，簡化了實驗步驟，可實現定性和定量的雙重檢測，可以進行異地樣品的雙參數的快速測定。

2、本發明雙參數磁免疫層析試條，結合磁粒子技術、免疫技術、層析技術，實現對樣品中低濃度蛋白質大分子等物質的快速定量現場檢測。

附圖說明

圖1是本發明設計的單參數磁免疫試條的結構示意圖；

圖2雙參數扇形磁免疫試條示意圖。

具體實施方式

為使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚明白，以下結合具體實施例，并參照附圖，對本發明作進一步的詳細說明。

本發明采用基于磁納米粒子和層析技術的免疫磁層析多參數扇形試條。本發明提及的磁納米粒子不衰減、不降解、不變性、不能被中和，檢測方便迅速，僅要求10s，不需要前處理和激活。另外試紙條可以長期保存并能夠重新檢測而其信號不丟失。可利用磁納米粒子在強磁場中產生的磁性用磁鐵吸附，無須離心和過濾。

使用本發明的免疫磁層析多參數扇形可檢測但不僅限于檢測樣品中的蛋白質大分子以及激素、農藥殘留等小分子物質。檢測樣品可以是全血、血漿、血清、尿液、唾液、體液等。采用免疫檢測原理，適用于樣品中含量低的待檢物。在芯片上固定多種抗體，檢測儀可以實現一個芯片上一次檢測2個指標。

高血壓病通過引起良性小動脈腎硬化而導致高血壓慢性腎損害，在良性小動脈腎硬化出現臨床癥狀以前，常規血液及尿液檢查都正常的情況下，通過應用比較靈敏的檢查手段仍能發現一些異常，這些可視為高血壓病的早期腎損害。聯合多個指標進行檢測，可以排除個別炎癥等導致的不準確，可以更為精確的進行損傷的判斷。

圖1示出了本發明設計的單參數磁免疫試條的結構示意圖。如圖所示，本發明公開了一種磁免疫試條，其包括：樣品墊、結合墊、檢測帶、質控帶、廢液吸水區、分析模和襯底。該磁免疫試條用于生物樣品中蛋白大分子等極低濃度物質的快速檢測。所述分析模置于襯底之上，結合墊與吸水墊置于分析模兩側，檢測帶與質控帶置于分析模之上，樣品墊置于結合墊之上。

樣品墊為樣品滴加區，其為高親水性材料，待測樣品滴加在該區域。根據本發明實施例，樣品墊采用高多孔材料，待測樣品滴加在該區域可迅速被滲入樣品墊，并且能快速移動，不在樣品墊儲留；樣品墊材料，可采用玻璃纖維紙、濾紙等；需要進行材料預處理。預處理液包括：大分子親水材料、蛋白質保護性材料、表面活性劑。

結合墊為磁粒子-標記單克隆抗體儲存區域，待測樣品中的抗原與單抗1結合，形成“磁粒子-標記單抗-抗原”復合物。根據本發明實施例，所述磁粒子直徑在10nm-5μm范圍，磁粒子進行羥基、羧基等功能基團修飾。所述標記單抗包括：尿微量白蛋白標記單抗、尿轉鐵蛋白標記單抗。結合區域可用玻璃纖維素紙、濾紙等材料制備，結合區材料先進行預處理并干燥后，噴涂磁粒子-標記單抗復合粒子，低溫干燥。

所述尿微量白蛋白(urinary microalbumin，英文縮寫：mAlb)、尿轉鐵蛋白(transferring，Tr)的增高多見于糖尿病腎病、高血壓、妊娠子癇前期，是腎損傷的早期敏感指標。如果在體檢后發現尿中的微量白蛋白在20mg/L-200mg/L范圍內，就屬于微量白蛋白尿，如果患者能夠經過規范的修復腎單位，逆轉纖維化治療，尚可徹底修復腎小球，消除蛋白尿。而當尿中微量白蛋白超過200mg/L時，此時證明腎病患者已有大量白蛋白漏出，腎病發展離不可逆期只有一步之遙，如果不及時進行醫治，就會進入尿毒癥期。

轉鐵蛋白(transferring，Tr)的等電點較高，帶有較多的負電荷，而腎小球濾過膜也帶有大量的負電荷，當轉鐵蛋白通過濾過膜時，受到的電荷排斥力較小，容易漏出，因而能更敏感的反映腎小球電荷屏障的受損。在腎小球損傷早期，程度較輕時，尿中僅有白蛋白、轉鐵蛋白濾出，稱為選擇性蛋白尿。轉鐵蛋白的獨特性使其在除了常規腎功能檢測外還能更廣泛的應用于更早期、更輕微損傷的檢測。

檢測帶(固定單抗2反應區)為配對的捕獲單克隆抗體的固定區域，復合物流動到該區，抗原與捕獲單克隆抗體結合，形成“磁粒子-標記單抗-抗原-捕獲單抗”復合物，復合物被捕獲固定在該區域；由于磁微粒子是棕褐色，可以根據顏色深淺進行濃度的目測，也可以采用磁檢測儀進行定量檢測。根據本發明實施例，檢測帶區域采用硝酸纖維素薄膜材料制備，其為捕獲單克隆抗體的固定區域，單抗采用噴涂或者劃線方式固定在硝酸纖維素膜材料上，復合物流動到該區，抗原與固定的捕獲單抗結合，形成“磁粒子-標記單抗-抗原-捕獲單抗”復合物，復合物被捕獲固定在該區域。采用目測定性檢測或者磁檢測儀進行定量檢測。

質控帶為單抗2的固定區域，過量的磁粒子-標記單抗流動到質控帶區域，與抗抗體結合，起到質控的作用。

吸水墊為廢液吸水區，其由強親水材料制備，多余的樣品液體被吸收儲存在此處。

基板襯底為試條的支撐結構，可選用透明塑料基材，利于光學定量檢測。根據本發明實施例，所述基板可選用不透明支撐材料或者透明塑料基材，結合不同的光學測量儀器，利于光學定量檢測。

圖2示出了在單參數免疫試條基礎上制備的雙參數扇形磁免疫試條示意圖。雙參數磁免疫試條制備方法與單參數相似，只是引流樣品墊是采用一個樣品墊覆蓋在兩個相鄰的免疫試條1和免疫試條2上，最后用塑料夾具將兩個磁免疫試條固定，便于磁檢測和試條保護。

塑料支撐夾具上有樣品加樣區，用于加入樣品。樣品后加入后向兩個試條流動，從而實現雙參數檢測。根據本發明實施例，所述塑料支撐夾具為試條的支撐夾持結構，可選用普通塑料基材，采用Y型結構，加樣區位于Y型結構的底端便于雙參數試條進樣和取放，利于磁定量檢測。由于配合磁檢測儀的近距離檢測，不能采用常規的塑料外殼封條。

本發明實施例還提供一種雙參數扇形免疫磁層析試條的制備方法：

步驟1、在塑料襯底上，預粘一層親水性薄紙，粘上纖維素膜，纖維素膜上固定捕獲單克隆抗體做為檢測帶、固定抗抗體做為質控帶，干燥；粘好吸水紙材料。試條1固定mAlb捕獲單抗，試條2固定Tr捕獲單抗，噴量為2～5μl/cm，室溫干燥。

步驟2、再固定磁粒子-標記單抗結合區的玻璃纖維素紙做為結合墊，噴涂磁粒子-標記單克隆抗體，干燥；試條1固定mAlb標記單抗，試條2固定Tr標記單抗，噴量為1～2μl/cm，干燥。粘貼上單抗結合墊。

步驟3、切條，由于磁檢測限制，條帶寬度為4mm。

步驟4、將兩種試條分別固定在塑料夾具上。然后固定玻璃纖維素紙作為雙參數試條的共同引流樣品墊。將夾具扣合。

步驟5、密封干燥保存。

上述實施例采用基于磁粒子的雙參數磁免疫層析試條，有效提高了檢測靈敏度，簡化了實驗步驟，可實現定性和定量的雙重檢測，可以進行異地樣品的雙參數的快速測定。并且，由于該實施例結合了磁粒子技術、免疫技術、層析技術，因此能實現對樣品中低濃度蛋白質大分子等物質的快速定量現場檢測。

以上所述的具體實施例，對本發明的目的、技術方案和有益效果進行了進一步詳細說明，應理解的是，以上所述僅為本發明的具體實施例而已，并不用于限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內，所做的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。