一種測定血清中維生素B1的同位素稀釋超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用方法與流程

本發(fā)明涉及一種測定血清中維生素B₁的同位素稀釋超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用方法。

背景技術(shù)：

維生素B₁又稱硫胺素，是B族維生素的主要成員，作為人體內(nèi)眾多輔酶中的一種，維生素B₁參與碳水化合物和蛋白質(zhì)的代謝，對維持神經(jīng)、胃腸、肌肉，特別是心肌正常功能發(fā)揮重要作用。維生素B₁缺乏后，會出現(xiàn)腳氣病，主要表現(xiàn)為神經(jīng)-血管系統(tǒng)的損傷，癥狀多為食欲不佳、便秘、惡心、抑郁、易疲勞、記憶減退、反應(yīng)遲鈍、周圍神經(jīng)障礙等。

可見，維生素B₁對維系人體健康十分重要，因此，需要建立一種簡單快速、準(zhǔn)確靈敏測定血清中維生素B₁的方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明實際解決的問題是一種簡單快速、靈敏準(zhǔn)確的測定血清中維生素B₁的同位素稀釋超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用方法。

本發(fā)明的一種測定血清中維生素B₁的同位素稀釋超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用方法，包括以下步驟：

(1)維生素B₁對照品溶液和維生素B₁同位素內(nèi)標(biāo)溶液配制：

用體積分?jǐn)?shù)為50％的甲醇水溶液分別溶解維生素B₁和維生素B₁同位素內(nèi)標(biāo)，制成已知濃度的維生素B₁對照品存儲液和已知濃度的維生素B₁同位素內(nèi)標(biāo)存儲液；

用體積分?jǐn)?shù)為50％的甲醇水溶液將已知濃度的維生素B₁對照品存儲液分別稀釋成一系列具有不同已知濃度的維生素B₁對照品溶液；

用甲醇溶液將已知濃度的維生素B₁同位素內(nèi)標(biāo)存儲液稀釋成已知濃度的維生素B₁同位素內(nèi)標(biāo)溶液；

(2)建立維生素B₁標(biāo)準(zhǔn)曲線：

分別吸取一系列具有不同已知濃度的維生素B₁對照品溶液體積V₁，加入1～5倍體積V₁的維生素B₁同位素內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋混勻，離心，取上清液體積V₂加入1～3倍體積V₂的蒸餾水，渦旋混勻，得到一系列具有不同已知濃度的維生素B₁標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液；

在相同的預(yù)設(shè)超高效液相色譜質(zhì)譜條件下，將體積V₃的一系列具有不同已知濃度的維生素B₁標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液分別注入超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀中，獲得一系列具有不同已知濃度的維生素B₁標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液的色譜圖；

以維生素B₁標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液的色譜圖中維生素B₁色譜峰峰面積與維生素B₁同位素內(nèi)標(biāo)色譜峰峰面積的比值為縱坐標(biāo)或橫坐標(biāo)，以相應(yīng)的維生素B₁標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液的維生素B₁濃度為橫坐標(biāo)或縱坐標(biāo)，建立維生素B₁標(biāo)準(zhǔn)曲線；

(3)采集血清樣品溶液的色譜圖：

吸取血清樣品體積V₁，加入1～5倍體積V₁的維生素B₁同位素內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋混勻，離心，取上清液體積V₂加入1～3倍體積V₂的蒸餾水，渦旋混勻，得血清樣品溶液；

在與(2)步驟中相同的預(yù)設(shè)超高效液相色譜質(zhì)譜條件下，取體積V₃的血清樣品溶液注入超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀中，獲得血清樣品溶液的色譜圖；

(4)血清樣品中維生素B₁濃度的確定：

將血清樣品溶液色譜圖中維生素B₁色譜峰峰面積與維生素B₁同位素內(nèi)標(biāo)色譜峰峰面積的比值帶入已建立的維生素B₁標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出血清樣品中維生素B₁的濃度；

(5)采集質(zhì)控樣品和加標(biāo)回收率樣品溶液的色譜圖：

吸取血清樣品體積0.8V₁，加入0.2V₁不同已知濃度的維生素B₁對照品溶液，加入1～5倍體積V₁的維生素B₁同位素內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋混勻，離心，取上清液體積V₂加入1～3倍體積V₂的蒸餾水，渦旋混勻，得到不同濃度的質(zhì)控樣品和加標(biāo)回收率樣品溶液；

在與(2)步驟中相同的預(yù)設(shè)超高效液相色譜質(zhì)譜條件下，取體積V₃的質(zhì)控樣品和加標(biāo)回收率樣品溶液注入超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀中，獲得質(zhì)控樣品和加標(biāo)回收率樣品溶液的色譜圖；

將質(zhì)控樣品和加標(biāo)回收率樣品溶液色譜圖中維生素B₁色譜峰峰面積與維生素B₁同位素內(nèi)標(biāo)色譜峰峰面積的比值帶入已建立的維生素B₁標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出質(zhì)控樣品和加標(biāo)回收率樣品中維生素B₁的濃度；

(6)加標(biāo)回收率計算：

回收率％＝(測得濃度-血清平均濃度×0.8)/加標(biāo)濃度×0.2×100％。

進(jìn)一步的，所述預(yù)設(shè)超高效液相色譜質(zhì)譜條件包括：

1)超高效液相色譜條件：

色譜柱：采用極性基團(tuán)包埋C18鍵合硅膠的固定相；流動相：鹽水溶液-乙腈；流動相的流速：0.3～0.5mL/min；柱溫：30～50℃；進(jìn)樣量：2～10μL；

2)質(zhì)譜條件包括：

離子源：電噴霧離子源；掃描模式：正離子模式；檢測模式：多反應(yīng)監(jiān)測；毛細(xì)管電壓：5500V；離子源溫度：550℃；離子源霧化氣：40psi；離子源加熱輔助氣：60psi；氣簾氣：30psi；碰撞氣：4psi。

進(jìn)一步的，所述流動相為甲酸銨/乙酸銨水溶液-乙腈。

進(jìn)一步的，所述流動相為0～20mM甲酸銨水溶液-乙腈。

進(jìn)一步的，所述流動相為10mM甲酸銨水溶液-乙腈。

進(jìn)一步的，所述離子源霧化氣、離子源加熱輔助氣、氣簾氣和碰撞氣中的氣體均為氮?dú)狻?/p>

進(jìn)一步的，所述一系列具有不同已知濃度的維生素B₁對照品溶液的濃度為0.5～100ng/mL。

進(jìn)一步的，所述渦旋混勻的時間為0.5～5min；

進(jìn)一步的，所述離心條件為：溫度4℃，轉(zhuǎn)速10000～15000r/min，時間10～20min。

本發(fā)明的一種測定血清中維生素B₁的同位素稀釋超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用方法用于血清中維生素B₁的測定中，簡單靈敏、快速準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)、精密度高、重復(fù)性好、準(zhǔn)確度高。

附圖說明

圖1本發(fā)明中濃度均為5ng/mL的維生素B₁及¹³C₄-維生素B₁的典型UPLC-MS/MS色譜圖；

圖2維生素B₁標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；

圖3質(zhì)控樣品和加標(biāo)回收率樣品溶液的典型UPLC-MS/MS色譜圖；

圖4血清樣品溶液中維生素B₁及¹³C₄-維生素B₁的的典型UPLC-MS/MS色譜圖。

具體實施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明實施例中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

儀器與試劑：

API 4000三重四級桿質(zhì)譜儀(美國，AppliedBiosystem公司)配有電噴霧離子源；Waters超高效液相色譜儀(美國，Waters公司)配有二元高壓泵、自動進(jìn)樣器、柱溫箱；H1650R臺式高速冷凍離心機(jī)(中國，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；BT125D電子天平(德國，賽多利斯股份公司)；G560E渦旋混合器(美國，Scientific Industries公司)。

鹽酸維生素B₁(純度＞99％)、鹽酸維生素B₁-(4-甲基-¹³C-thiazol-5-yl-¹³C₃)(鹽酸¹³C₄-維生素B₁，純度＞98％)購自Sigma Aldrich公司(美國)；色譜甲醇、乙腈購自默克公司(德國)；色譜純甲酸銨購自上海麥克林生化科技有限公司(中國)；屈臣氏蒸餾水購自廣州屈臣氏食品飲料有限公司(中國)；方法學(xué)研究實驗的血清樣本來自于杭州佰辰醫(yī)學(xué)檢驗所有限公司送檢的血清樣本。

本實施例的一種測定血清中維生素B₁的同位素稀釋超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用方法，包括以下步驟：

(1)維生素B₁對照品溶液和維生素B₁同位素內(nèi)標(biāo)溶液配制：

精密稱取鹽酸維生素B₁10.38mg(折算成維生素B₁為9.26mg)，置于100mL容量瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)為50％甲醇水溶液定容至刻度，制成每1mL溶液中含92.6μg維生素B₁對照品儲備液；

取同位素內(nèi)標(biāo)鹽酸維生素B₁-(4-甲基-¹³C-thiazol-5-yl-¹³C₃)2.0mg(鹽酸¹³C₄-維生素B₁，折算成¹³C₄-維生素B₁為1.79mg)，用體積分?jǐn)?shù)為50％甲醇水溶液溶解并轉(zhuǎn)移至25mL容量瓶，定容至刻度，制成每1mL溶液中含有71.6μg ¹³C₄-維生素B₁的同位素內(nèi)標(biāo)儲備液；

用體積分?jǐn)?shù)為50％的甲醇水溶液倍比稀釋維生素B₁對照品儲備液，得到濃度89.2ng/mL、44.6ng/mL、22.3ng/mL、8.92ng/mL、4.46ng/mL、2.23ng/mL、0.892ng/mL、0.446ng/mL的維生素B₁對照品溶液；

用甲醇將¹³C₄-維生素B₁的同位素內(nèi)標(biāo)儲備液稀釋成17.87μg/mL的維生素B₁同位素內(nèi)標(biāo)溶液；

(2)建立維生素B₁標(biāo)準(zhǔn)曲線：

分別精密吸取維生素B₁對照品溶液100μL，加入300μL內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋混勻2min，于4℃條件11000rpm離心15min，取200μL上清液，加入200μL蒸餾水，渦旋1min，得到維生素B₁標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液；

在相同的預(yù)設(shè)超高效液相色譜質(zhì)譜條件下，將體積10μL的一系列具有不同已知濃度的維生素B₁標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液分別注入超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀中，獲得一系列具有不同已知濃度的維生素B₁標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液的色譜圖；

以維生素B₁標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液的色譜圖中維生素B₁色譜峰峰面積與維生素B₁同位素內(nèi)標(biāo)色譜峰峰面積的比值為縱坐標(biāo)，以相應(yīng)的維生素B₁標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液的維生素B₁濃度為橫坐標(biāo)，建立維生素B₁標(biāo)準(zhǔn)曲線；

色譜條件：

色譜柱：Hypersil GOLD aQ(2.1mm×100mm,1.9μm)；流動相：10mM甲酸銨水溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脫，洗脫程序：0.0～0.5min：0％B；0.5～2min：0～35％B；2～2.5min：35～100％B；2.5～3.5min：100％B；3.5～3.8min：100～0％B；3.8～5.0min：0％B；流速：0.4mL/min；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：10μL；

質(zhì)譜條件：

離子源：電噴霧離子源；掃描模式：正離子模式；毛細(xì)管電壓：5500V；離子源溫度：550℃；離子源霧化氣：40psi；離子源加熱輔助氣：60psi；氣簾氣：30psi；碰撞氣：4psi；氣體均為氮?dú)猓粧呙枘Ｊ剑憾喾磻?yīng)監(jiān)測，多反應(yīng)監(jiān)測條件如下表1所示：

表1維生素B₁及¹³C₄-維生素B₁的多反應(yīng)監(jiān)測條件

(3)采集血清樣品溶液的色譜圖：

精密吸取血清樣品100μL，加入300μL內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋混勻2min，于4℃條件11000rpm離心15min，取200μL上清液，加入200μL蒸餾水，渦旋1min，得到血清樣品溶液；

在與(2)步驟中相同的預(yù)設(shè)超高效液相色譜質(zhì)譜條件下，取體積10μL的血清樣品溶液注入超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀中，獲得血清樣品溶液的色譜圖；

(4)血清樣品中維生素B₁濃度的確定：

將血清樣品溶液色譜圖中維生素B₁色譜峰峰面積與維生素B₁同位素內(nèi)標(biāo)色譜峰峰面積的比值帶入已建立的維生素B₁標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出血清樣品中維生素B₁的濃度；

(5)采集質(zhì)控樣品和加標(biāo)回收率樣品溶液的色譜圖：

精密吸取血清樣品體積80μL，加入20μL不同已知濃度的維生素B₁對照品溶液，加入300μL維生素B₁同位素內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋混勻2min，于4℃條件11000rpm離心15min，取200μL上清液，加入200μL蒸餾水，渦旋1min，得到不同濃度的質(zhì)控樣品和加標(biāo)回收率樣品溶液；

在與(2)步驟中相同的預(yù)設(shè)超高效液相色譜質(zhì)譜條件下，取體積10μL的質(zhì)控樣品和加標(biāo)回收率樣品溶液注入超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀中，獲得質(zhì)控樣品和加標(biāo)回收率樣品溶液的色譜圖；

將質(zhì)控樣品和加標(biāo)回收率樣品溶液色譜圖中維生素B₁色譜峰峰面積與維生素B₁同位素內(nèi)標(biāo)色譜峰峰面積的比值帶入已建立的維生素B₁標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出質(zhì)控樣品和加標(biāo)回收率樣品中維生素B1的濃度；

(6)加標(biāo)回收率計算：

回收率％＝(測得濃度-血清平均濃度×0.8)/加標(biāo)濃度×0.2×100％；

(7)線性關(guān)系、最低檢測限和最低定量限：

在與(2)步驟中相同的超高效液相色譜質(zhì)譜條件下，精密吸取10μL不同濃度的維生素B₁標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液分別注入超高效液相色譜儀，每個濃度平行分析3次；記錄各濃度工作液中維生素B₁及¹³C₄-維生素B₁峰面積(如圖1，圖1為濃度均為5ng/mL的維生素B₁及¹³C₄-維生素B₁的典型UPLC-MS/MS色譜圖)，以維生素B₁色譜峰峰面積與維生素B₁同位素內(nèi)標(biāo)色譜峰峰面積的比值為縱坐標(biāo)，以相應(yīng)的維生素B₁標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液的維生素B₁濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，回歸方程y＝0.0198x+0.00278，相關(guān)系數(shù)r＝0.9996，如圖2，表明本實施例所建方法在預(yù)設(shè)的線性范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系；

以線性最低點(diǎn)濃度(0.446ng/mL)作為最低定量限(LLOQ)，以低于LLOQ兩倍濃度(0.223ng/mL)作為最低檢測限(LLOD)，每個濃度樣品平行分析6次考察所建方法靈敏度，結(jié)果表明，本實施例所建方法的LLOD檢測結(jié)果準(zhǔn)確性為101.3％，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為5.60％，LLOQ檢測結(jié)果準(zhǔn)確性為96.8％，RSD為3.22％，表明本實施例所建方法的靈敏度高，低濃度檢測準(zhǔn)確度高；

(9)精密度試驗：

按照質(zhì)控樣品處理方法制備低濃度(0.892ng/mL)、中濃度(4.46ng/mL)、高濃度(71.37ng/mL)質(zhì)控樣品，分別標(biāo)記為QCL、QCM、QCH，每個濃度質(zhì)控樣品連續(xù)檢測6次作為日內(nèi)精密度，連續(xù)檢測三天作為日間精密度；結(jié)果：不同濃度質(zhì)控樣品中維生素B₁的日內(nèi)和日間精密度的RSD均小于5.34％，表明本實施例所建方法精密度良好，結(jié)果見表2；

(10)穩(wěn)定性試驗：

按照質(zhì)控樣品處理方法制備QCL、QCM、QCH：1)置于8℃自動進(jìn)樣器，于0、2、4、6、8、12h測定，考察血樣品中維生素B₁存放自動進(jìn)樣器12小時的穩(wěn)定性；2)于室溫放置2h后處理，考察血樣品中維生素B₁室溫放置2小時的穩(wěn)定性；3)在-80℃冰箱放置，反復(fù)凍融1次、凍融3次，考察血樣品中維生素B₁在反復(fù)凍融過程的穩(wěn)定性，在與(2)步驟中相同的超高效液相色譜質(zhì)譜條件下，測定上述不同濃度質(zhì)控樣品，每個濃度質(zhì)控樣品平行制備6份；結(jié)果：不同濃度質(zhì)控樣品中維生素B₁穩(wěn)定性的RSD均小于5.74％，表明血樣品中維生素B₁的穩(wěn)定性良好，結(jié)果見表2；

表2維生素B₁的精密度、穩(wěn)定性試驗結(jié)果(n＝6,RSD)

(11)加標(biāo)回收率試驗：

按照加標(biāo)回收率樣品處理方法制備低濃度、中濃度、高濃度加標(biāo)回收率樣品，分別標(biāo)記為RL、RM、RH，每個濃度樣品平行制備6份，考察本實施例所建方法測定血樣品中維生素B1的準(zhǔn)確度；結(jié)果：不同濃度加標(biāo)回收率樣品的平均回收率在96.9～102.6％，RSD均小于6.61％，表明本實施例所建方法準(zhǔn)確度良好，結(jié)果見表3；獲得的質(zhì)控樣品和加標(biāo)回收率樣品溶液的典型UPLC-MS/MS色譜圖，如圖3所示；

表3維生素B₁加標(biāo)回收率結(jié)果(n＝6)

(12)血清樣品中維生素B₁的測定：

按照血清樣品處理方法制備血樣品，在與(2)步驟中相同的超高效液相色譜質(zhì)譜條件下，精密吸取10μL分別注入超高效液相色譜儀，獲得血清樣品色譜圖，如圖4；結(jié)果見表4；

表4血清樣品測定結(jié)果(ng/mL)

上述結(jié)果可以看出，本實施例所構(gòu)建的一種測定血清中維生素B₁的同位素稀釋超液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用方法，用于血清中維生素B₁的測定中，簡單快速、準(zhǔn)確度高、專屬性強(qiáng)、精密度高、靈敏度好。

此外，應(yīng)當(dāng)理解，雖然本說明書按照實施方式加以描述，但并非每個實施方式僅包含一個獨(dú)立的技術(shù)方案，說明書的這種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)將說明書作為一個整體，各實施例中的技術(shù)方案也可以經(jīng)適當(dāng)組合，形成本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的其他實施方式。