本發明涉及一種基于聚多巴胺納米微球的電致化學發光傳感器的制備方法，具體涉及到將三聯吡啶釕固定在氨基化多壁碳納米管/Nafion復合膜修飾的電極上，采用簡單的方法制得的聚多巴胺納米微球作為二抗標記物，對三聯吡啶釕有良好的猝滅效果，從而達到檢測前列腺特異性抗原的目的，屬于新型功能材料與生物傳感技術領域。
背景技術：
前列腺癌是男性常見惡性腫瘤之一，其發病率和死亡率分別位居全球男性全部惡性腫瘤的第2 位和第6 位。與歐美發達國家和地區相比，中國前列腺癌的發病率和死亡率處于相對較低水平，但近年來隨著中國人口老齡化步伐的加快、前列腺癌診療水平的提高和生活方式的轉變等多種原因，前列腺癌對中國男性的危害有不斷加劇的趨勢，因此，對前列腺癌的早期診斷和早期治療是很重要的。通過近年的研究發現，前列腺特異性抗原PSA可以作為前列腺癌標志物，它們在前列腺癌的早期預防和治療中發揮著重要的作用。對血清中前列腺特異性抗原的濃度進行快速、靈敏檢測具有非常重要的臨床價值和意義，能夠在最大程度上降低前列腺癌的死亡率，延長前列腺癌患者的生存期限，為患者爭取更多的治療機會。
目前用于檢測前列腺特異性抗原的方法主要是放射性免疫法、酶聯免疫分析法和熒光免疫分析法等，但這些方法存在不能即時快速檢測、具有放射性污染以及操作復雜等弊端，而電致化學發光方法能夠很好地克服這些弊端，它是一種基于抗原與抗體特異性識別而構建的免疫傳感器，其制備過程簡單、靈敏度高、檢測限低、響應速度快，能夠對抗原進行快速靈敏的檢測。
技術實現要素：
本發明目的之一是將氨基化多壁碳納米管摻雜到Nafion膜中，使三聯吡啶釕快速擴散，穩定的固定在電極表面。
發明目的之二是利用簡單的合成方法合成聚多巴胺納米微球，微球大小均一，含有豐富的活性官能團，可以連接大量的二抗，從而形成夾心型結構，猝滅三聯吡啶釕的發光，實現對前列腺特異性抗原的快速、靈敏、特異、高效檢測。
本發明的技術方案如下：
1. 一種基于聚多巴胺納米微球的電致化學發光傳感器的制備方法
（1）將直徑4 mm的玻碳電極依次用1.0 μm、0.3 μm、0.05 μm氧化鋁拋光粉依次做拋光處理，用超純水沖洗干凈；
（2）滴涂6 μL、0.3~0.7 mg/mL的氨基化多壁碳納米管/Nafion溶液至電極表面，將電極浸入1 mM的三聯吡啶釕溶液30 min，用超純水沖洗電極表面；
（3）滴加6 μL、5~10 μg/mL的抗體溶液，4℃冰箱中晾干后用超純水沖洗電極表面；
（4）滴加3 μL質量分數為1%的牛血清白蛋白溶液，4℃冰箱中晾干后用超純水沖洗電極表面；
（5）滴加6 μL、0.0001~20 ng/mL的一系列不同濃度的前列腺特異性抗原溶液，4℃冰箱中晾干后用超純水沖洗電極表面；
（6）將電極浸入聚多巴胺納米微球二抗標記物溶液2~6 h，置于4℃冰箱中晾干后用超純水沖洗電極表面，制得聚多巴胺納米微球構建的免疫傳感器。
2. 聚多巴胺納米微球二抗標記物溶液的制備
80~120 mg鹽酸多巴胺加入到80~120 mL pH = 8.8的Tris緩沖溶液與30~70 mL異丙醇的混合液中，在室溫下避光反應24 h，將產品離心分離并用超純水洗滌三次，之后將產物分散到5 mL超純水中；在990 μL、100 μg/mL的抗體溶液中加入新鮮配制的5 μL、8 mg/mL EDC溶液和5 μL 22 mg/mL NHS溶液，室溫下震蕩15 min，之后加入1 mL聚多巴胺納米微球，在4℃下震蕩12 h，用超純水離心洗滌三次，得到聚多巴胺納米微球二抗標記物溶液。
3. 前列腺特異性抗原的檢測
（1）使用電化學工作站的三電極體系進行測試，Ag/AgCl電極作為參比電極，鉑絲電極為對電極，所制備的電化學發光傳感器為工作電極，將電化學工作站和化學發光檢測儀連接在一起，將光電倍增管的高壓設置為600 V，循環伏安掃描電位范圍為0 ~ 1.2 V，掃描速率為0.1 V/s；
（2）在10 mL、pH 7.4的含濃度為15 mmol/L三丙胺的磷酸鹽緩沖溶液中，通過電化學發光系統，檢測對不同濃度的前列腺特異性抗原產生的電化學發光信號強度，繪制工作曲線。
本發明的有益成果
（1）將氨基化多壁碳納米管摻雜到Nafion膜中來固定三聯吡啶釕，此復合膜具有更開放的結構和更大的表面積，可以使三聯吡啶釕在膜中更快擴散。
（2）采用簡單的合成方法制備的仿生聚多巴胺微球具有良好的生物相容性和生物可降解性，對三聯吡啶釕有明顯的猝滅效果，同時聚多巴胺納米微球有豐富的氨基官能團，能夠連接抗體作為二抗標記物。
（3）本發明制備的電致化學發光傳感器用于前列腺特異性抗原標志物的檢測，操作簡單，反應快速，信號響應范圍寬，可以實現簡單、快速、靈敏、特異性檢測。
實施例1一種基于聚多巴胺納米微球的電致化學發光傳感器的制備方法
（1）將直徑4 mm的玻碳電極依次用1.0 μm、0.3 μm、0.05 μm氧化鋁拋光粉依次做拋光處理，用超純水沖洗干凈；
（2）滴涂6 μL、0.3 mg/mL的氨基化多壁碳納米管/Nafion溶液至電極表面，將電極浸入1 mM的三聯吡啶釕溶液30 min，用超純水沖洗電極表面；
（3）滴加6 μL、5 μg/mL的抗體溶液，4℃冰箱中晾干后用超純水沖洗電極表面；
（4）滴加3 μL質量分數為1%的牛血清白蛋白溶液，4℃冰箱中晾干后用超純水沖洗電極表面；
（5）滴加6 μL、0.0001~20 ng/mL的一系列不同濃度的前列腺特異性抗原溶液，4℃冰箱中晾干后用超純水沖洗電極表面；
（6）將電極浸入聚多巴胺納米微球二抗標記物溶液2 h，置于4℃冰箱中晾干后用超純水沖洗電極表面，制得聚多巴胺納米微球構建的免疫傳感器。
實施例2 一種基于聚多巴胺納米微球的電致化學發光傳感器的制備方法
（1）將直徑4 mm的玻碳電極依次用1.0 μm、0.3 μm、0.05 μm氧化鋁拋光粉依次做拋光處理，用超純水沖洗干凈；
（2）滴涂6 μL、0.5 mg/mL的氨基化多壁碳納米管/Nafion溶液至電極表面，將電極浸入1 mM的三聯吡啶釕溶液30 min，用超純水沖洗電極表面；
（3）滴加6 μL、7 μg/mL的抗體溶液，4℃冰箱中晾干后用超純水沖洗電極表面；
（4）滴加3 μL質量分數為1%的牛血清白蛋白溶液，4℃冰箱中晾干后用超純水沖洗電極表面；
（5）滴加6 μL、0.0001~20 ng/mL的一系列不同濃度的前列腺特異性抗原溶液，4℃冰箱中晾干后用超純水沖洗電極表面；
（6）將電極浸入聚多巴胺納米微球二抗標記物溶液4 h，置于4℃冰箱中晾干后用超純水沖洗電極表面，制得聚多巴胺納米微球構建的免疫傳感器。
實施例3一種基于聚多巴胺納米微球的電致化學發光傳感器的制備方法
（1）將直徑4 mm的玻碳電極依次用1.0 μm、0.3 μm、0.05 μm氧化鋁拋光粉依次做拋光處理，用超純水沖洗干凈；
（2）滴涂6 μL、0.7 mg/mL的氨基化多壁碳納米管/Nafion溶液至電極表面，將電極浸入1 mM的三聯吡啶釕溶液30 min，用超純水沖洗電極表面；
（3）滴加6 μL、10 μg/mL的抗體溶液，4℃冰箱中晾干后用超純水沖洗電極表面；
（4）滴加3 μL質量分數為1%的牛血清白蛋白溶液，4℃冰箱中晾干后用超純水沖洗電極表面；
（5）滴加6 μL、0.0001~20 ng/mL的一系列不同濃度的前列腺特異性抗原溶液，4℃冰箱中晾干后用超純水沖洗電極表面；
（6）將電極浸入聚多巴胺納米微球二抗標記物溶液6 h，置于4℃冰箱中晾干后用超純水沖洗電極表面，制得聚多巴胺納米微球構建的免疫傳感器。
實施例4 聚多巴胺納米微球的制備
80 mg鹽酸多巴胺加入到80 mL pH = 8.8的Tris緩沖溶液與30 mL異丙醇的混合液中，在室溫下避光反應24 h，將產品離心分離并用超純水洗滌三次，之后將產物分散到5 mL超純水中；在990 μL、100 μg/mL的抗體溶液中加入新鮮配制的5 μL、8 mg/mL EDC溶液和5 μL 22 mg/mL NHS溶液，室溫下震蕩15 min，之后加入1 mL聚多巴胺納米微球，在4℃下震蕩12 h，用超純水離心洗滌三次，得到聚多巴胺納米微球二抗標記物溶液。
實施例5 聚多巴胺納米微球的制備
100 mg鹽酸多巴胺加入到100 mL pH = 8.8的Tris緩沖溶液與50 mL異丙醇的混合液中，在室溫下避光反應24 h，將產品離心分離并用超純水洗滌三次，之后將產物分散到5 mL超純水中；在990 μL、100 μg/mL的抗體溶液中加入新鮮配制的5 μL、8 mg/mL EDC溶液和5 μL 22 mg/mL NHS溶液，室溫下震蕩15 min，之后加入1 mL聚多巴胺納米微球，在4℃下震蕩12 h，用超純水離心洗滌三次，得到聚多巴胺納米微球二抗標記物溶液。
實施例6 聚多巴胺納米微球的制備
120 mg鹽酸多巴胺加入到120 mL pH = 8.8的Tris緩沖溶液與70 mL異丙醇的混合液中，在室溫下避光反應24 h，將產品離心分離并用超純水洗滌三次，之后將產物分散到5 mL超純水中；在990 μL、100 μg/mL的抗體溶液中加入新鮮配制的5 μL、8 mg/mL EDC溶液和5 μL 22 mg/mL NHS溶液，室溫下震蕩15 min，之后加入1 mL聚多巴胺納米微球，在4℃下震蕩12 h，用超純水離心洗滌三次，得到聚多巴胺納米微球二抗標記物溶液。