一種甘蔗葉片中檸檬酸含量的HPLC檢測(cè)方法與流程

本發(fā)明涉及甘蔗內(nèi)源激素檢測(cè)
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別是一種甘蔗葉片中檸檬酸含量的HPLC檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
：甘蔗（Saccharumofficinarum)是我國(guó)最重要糖料作物，蔗糖占我國(guó)食糖總產(chǎn)92%。甘蔗中含有的植物激素幾乎參與了其生長(zhǎng)發(fā)育所有過(guò)程的生理調(diào)節(jié)，從細(xì)胞的生長(zhǎng)分裂和分化，到種子的休眠、果實(shí)發(fā)育、性別分化和衰老過(guò)程等。對(duì)于甘蔗而言，它有2個(gè)非常重要的指標(biāo)直接影響著甘蔗的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，分別糖分和產(chǎn)量，但如果甘蔗受到病蟲(chóng)害影響而不能及時(shí)發(fā)現(xiàn)，則會(huì)大大影響甘蔗的糖分和產(chǎn)量。如果能夠通過(guò)研究甘蔗生長(zhǎng)過(guò)程中內(nèi)源激素的變化趨勢(shì)，判斷甘蔗品種感染病原后的感抗差異，并建立對(duì)應(yīng)病原菌脅迫應(yīng)答的生化機(jī)制，那么將對(duì)甘蔗經(jīng)濟(jì)價(jià)值的增長(zhǎng)具有重大的現(xiàn)實(shí)意義。甘蔗梢腐病最早是在印尼首先發(fā)現(xiàn)的，并隨甘蔗品種POJ2878及其衍生品種的推廣蔓延至全世界，其發(fā)病最高級(jí)和嚴(yán)重階段，會(huì)導(dǎo)致蔗株心葉整個(gè)基部腐爛和快速失水，最終在甘蔗梢部幼嫩組織上形成頂腐狀，從而造成產(chǎn)量和糖分損失。尤其近年，云南、廣西蔗區(qū)種植的桂糖11號(hào)、GT21號(hào)和主推的桂糖37號(hào)多為感病品種，ROC22以及ROC16等主栽品種感染梢腐病程度也日益嚴(yán)重，這給糖業(yè)安全生產(chǎn)帶來(lái)了嚴(yán)重影響。甘蔗在受到梢腐病病原侵染時(shí)，會(huì)產(chǎn)生一系列的防御反應(yīng)來(lái)保護(hù)自己。在與病原菌的互作過(guò)程中，蔗株內(nèi)源激素的含量和活性發(fā)生變化，由此影響甘蔗正常生理生化進(jìn)程，從而感染甘蔗并導(dǎo)致發(fā)病。因此，對(duì)感染梢腐病病原后的內(nèi)源激素變化趨勢(shì)研究是十分緊迫的問(wèn)題。檸檬酸作為逆境信號(hào)物質(zhì)，以?xún)?nèi)源激素為正負(fù)信號(hào)對(duì)體內(nèi)各種代謝進(jìn)行有效調(diào)控，不僅與可溶性蛋白合成及提高羧基歧化酶、蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)酶活性等有關(guān)，且與提高植物光合能力，增強(qiáng)植物生長(zhǎng)勢(shì)、植物激素物質(zhì)的合成密切相關(guān)。但至今尚無(wú)建立高效、精確的甘蔗葉片檸檬酸含量檢測(cè)方法，鑒于此建立一套快速有效的甘蔗葉片檸檬酸含量檢測(cè)方法，對(duì)及時(shí)判斷甘蔗品種感染病原后的感抗差異和研究檸檬酸內(nèi)源激素介導(dǎo)甘蔗梢腐病病原菌脅迫應(yīng)答的生化機(jī)制具有非常重要的意義。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：針對(duì)我國(guó)甘蔗葉片檸檬酸含量檢測(cè)方法的空白，本發(fā)明的目的在于提供一種簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的甘蔗葉片中檸檬酸含量的HPLC檢測(cè)方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方法如下：一種甘蔗葉片中檸檬酸含量的HPLC檢測(cè)方法，其特征在于包括以下步驟：S1.將待測(cè)的甘蔗葉片加入預(yù)冷至2~5℃的體積分?jǐn)?shù)為70~90%甲醇水溶液，再加入液氮研磨成漿，定容，2~5℃浸提50~90min，超聲提取1.5~3h，離心，取上清液，殘?jiān)偌尤腩A(yù)冷至2~5℃體積分?jǐn)?shù)為70~90%甲醇水溶液超聲提取20~40min，離心后取出上清液，重復(fù)殘?jiān)岷碗x心操作0~3次，合并上清液，用70~90%甲醇定容，過(guò)濾，作為樣品溶液備用；S2.采用HPLC檢測(cè)樣品溶液中檸檬酸的含量。進(jìn)一步的，所述步驟S2中，HPLC色譜條件為：采用C18反相色譜柱；流動(dòng)相由12.5mmol/L的磷酸二氫鈉水溶液與甲醇按體積比50:1混合，再加入0.5mol/L的磷酸水溶液調(diào)節(jié)pH至2.8；柱溫為32~38℃，流速0.8~1.2mL/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)214nm。更進(jìn)一步的，所述步驟S6中，HPLC色譜條件為：柱溫為35℃，流速0.8mL/min，進(jìn)樣量10μL。進(jìn)一步的，所述步驟S1中，所述待測(cè)的甘蔗葉片預(yù)先從甘蔗上置于冰盒上剪下。進(jìn)一步的，所述步驟S1中，待測(cè)的甘蔗葉片和殘?jiān)岵捎玫氖求w積分?jǐn)?shù)為80%的甲醇水溶液。進(jìn)一步的，所述步驟S1中，待測(cè)的甘蔗葉片和殘?jiān)岬臏囟葹?℃。進(jìn)一步的，所述步驟S1中，甘蔗葉片研磨成漿后，加入超凈水進(jìn)行定容。進(jìn)一步的，所述步驟S5中，過(guò)濾采用針頭式過(guò)濾器進(jìn)行。本發(fā)明還提供了以上所述的檢測(cè)方法在判斷甘蔗品種對(duì)梢腐病感性和抗性差異方面的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果是：1）樣品前處理方法采用浸泡和超聲提取相結(jié)合的方法提取檸檬酸，與其他方法相比，提取快速，提取有效成分完全，除雜效果好，待測(cè)樣品純凈度高。2）通過(guò)本發(fā)明HPLC色譜條件測(cè)量樣品溶液中檸檬酸的含量，檸檬酸能與其他有效成分較好地進(jìn)行分離，且檢測(cè)速度快，重復(fù)性和準(zhǔn)確性好，在具備高效液相色譜儀的實(shí)驗(yàn)室均能通過(guò)此法開(kāi)展檸檬酸含量檢測(cè)工作。3）本發(fā)明尤其適用于感染梢腐病的甘蔗葉片中檸檬酸含量的測(cè)定，通過(guò)上述樣品的前處理方法和色譜條件，能排除梢腐病病原菌對(duì)檢測(cè)結(jié)果的干擾，從而為判斷甘蔗品種對(duì)梢腐病感抗差異研究和檸檬酸介導(dǎo)甘蔗梢腐病病原菌脅迫應(yīng)答生化機(jī)制提供科學(xué)有力的檢測(cè)技術(shù)；同時(shí)，本發(fā)明方法的推廣使用，對(duì)于篩選抗病品種和指導(dǎo)甘蔗抗病育種也具有重要意義和現(xiàn)實(shí)作用。附圖說(shuō)明圖1為檸檬酸的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。圖2a為標(biāo)準(zhǔn)溶液檢測(cè)得到的色譜圖。圖2b為樣品溶液檢測(cè)得到的色譜圖。圖3為不同生長(zhǎng)階段甘蔗樣品中檸檬酸的含量的趨勢(shì)分析圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的闡述，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不局限于實(shí)施例表示的范圍。這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而非用于限制本發(fā)明的范圍。此外，在閱讀本發(fā)明的內(nèi)容后，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種修改，這些等價(jià)變化同樣落于本發(fā)明所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。實(shí)施例1甘蔗葉片中檸檬酸含量的HPLC檢測(cè)方法S1.選取感染甘蔗梢腐病病原的甘蔗葉片作為待測(cè)樣品，取待測(cè)樣品2g，加入4mL預(yù)冷至4℃的體積分?jǐn)?shù)為80%的甲醇水溶液，加入液氮研磨成漿，用超凈水定容至10ml，4℃浸提1h，超聲提取2h，10000r/min離心10min，取上清液，殘?jiān)偌尤?mL預(yù)冷至4℃的體積分?jǐn)?shù)為80%甲醇水溶液超聲提取30min，10000r/min離心10min，離心后取出上清液，合并上清液，用體積分?jǐn)?shù)為80%甲醇水溶液定容至8mL，取適量定容后的溶液用針頭式過(guò)濾器過(guò)濾于帶有內(nèi)襯管的樣品瓶?jī)?nèi)，作為樣品溶液備用；S2.采用HPLC檢測(cè)樣品溶液中檸檬酸的含量。S2-1.色譜條件：ARigolL3000高效液相色譜儀；色譜柱：CSTC18反相色譜柱（250mm*4.6mm,5μm）；流動(dòng)相：12.5mmol/L的磷酸二氫鈉水溶液800mL，加入16mL甲醇，用0.5mol/L的磷酸水溶液調(diào)節(jié)溶液pH至2.8，混勻；柱溫：35℃；流速：0.8mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：214nm；進(jìn)樣體積：10μL。S2-2.稱(chēng)取檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)品2.5mg，加入10mL水溶解，配置成250μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液母液；然后用標(biāo)準(zhǔn)溶液母液再一次稀釋成濃度分別為50μg/mL、25μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、1μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用S2-1的色譜條件檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)溶液母液和標(biāo)準(zhǔn)溶液，其對(duì)應(yīng)峰面積分別為236.008、5.439、23.503、8.295、4.745、0.755；然后以峰面積為縱坐標(biāo)、以檸檬酸濃度為橫坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所述，由圖1可見(jiàn)，在所檢測(cè)范圍內(nèi)(1μg/mL～250μg/mL)，回歸方程式為y=0.9448x-0.4263，液相色譜峰面積與檸檬酸濃度具有良好的線性關(guān)系(R2=0.9996)。S2-3.專(zhuān)屬性考察：分別取10μL的250μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液母液和樣品溶液注入液相色譜儀中，采用S2-1的色譜條件檢測(cè)，標(biāo)準(zhǔn)溶液母液中檸檬酸的保留時(shí)間為8.747min，樣品溶液中檸檬酸的保留時(shí)間為8.713min，結(jié)果分別見(jiàn)圖2a和圖2b。S2-4.加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)：分別向同一樣品溶液中添加1mL濃度為10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、50μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用S2-1的色譜條件檢測(cè)，計(jì)算回收率。表1檸檬酸回收率測(cè)定結(jié)果S2-5.方法精密度試驗(yàn)取濃度為5μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用S2-1的色譜條件檢測(cè)，連續(xù)進(jìn)樣5針觀察保留時(shí)間與峰面積，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。表2方法精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果編號(hào)保留時(shí)間（min）峰面積（μvsec）18.7477.74228.7137.86038.7287.32048.7557.57858.7157.688標(biāo)準(zhǔn)偏差0.0180.204相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差0.9592.677S2-6.S1獲得的樣品溶液分析采用S2-1的色譜條件檢測(cè)，重復(fù)測(cè)定三次，得樣品的中檸檬酸的含量為33.898μg/g。由本實(shí)施例可以看出，本方法的靈敏度、檢出限和精密度能夠滿(mǎn)足甘蔗葉片中檸檬酸含量的測(cè)定；尤其適用于感染梢腐病的甘蔗葉片中檸檬酸含量的測(cè)定，通過(guò)上述樣品的前處理方法和色譜條件，能排除梢腐病病原菌對(duì)檢測(cè)結(jié)果的干擾。實(shí)施例2判斷甘蔗品種感染梢腐病后的感性和抗性差異研究（1）接種體的制備：將甘蔗梢腐病病原菌接種于PDA培養(yǎng)基上活化3天，挑取PDA培養(yǎng)基邊緣菌絲接種在滅菌的馬鈴薯葡萄糖水培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)3天，離心、用滅菌的脫脂棉過(guò)濾、收集所獲得的菌體，用無(wú)菌水與菌體配制成濃度為1×106CFU/ml甘蔗梢腐病病原菌孢子懸浮液。（2）接種材料的處理：選取甘蔗品種YT94-128、甘蔗品種GT37為接種材料，溫室條件下每個(gè)品種種植30桶，每桶4個(gè)芽，下種前用0.3%多菌靈浸種20min，出苗后正常管理，長(zhǎng)出5～6片完全葉時(shí)進(jìn)行接種。（3）注射接種：取長(zhǎng)勢(shì)相同的甘蔗品種YT94-128、甘蔗品種GT37的幼苗各30株，使用1ml醫(yī)用注射器分別將100μl甘蔗梢腐病病原菌孢子懸浮液到甘蔗+1葉位，作為甘蔗接種樣品；再另外取長(zhǎng)勢(shì)相同的甘蔗品種YT94-128、甘蔗品種GT37的幼苗各30株，以注射無(wú)菌水為對(duì)照，作為甘蔗對(duì)照樣品；甘蔗接種結(jié)束后保持室內(nèi)溫度28-30℃，濕度80%。（4）樣品選取:選擇相同株齡+1葉位上相同位置有近似病癥的甘蔗葉片，在冰盒上將其剪成1cm×1cm的葉片進(jìn)行備樣。（5）檢測(cè)方法與結(jié)果S1.取各生長(zhǎng)階段（0、4、8、16d）的甘蔗接種樣品和甘蔗對(duì)照樣品葉片2g，分別加入4mL預(yù)冷至4℃的體積分?jǐn)?shù)為80%甲醇水溶液，加入液氮研磨成漿，用超凈水定容至10ml，4℃浸提1h，超聲提取2h，10000r/min離心10min，取上清液，殘?jiān)偌尤?mL預(yù)冷至4℃的體積分?jǐn)?shù)為80%甲醇水溶液超聲提取30min，10000r/min離心10min，離心后取出上清液，合并上清液，用體積分?jǐn)?shù)為80%甲醇水溶液定容至8mL，取適量定容后的溶液用針頭式過(guò)濾器過(guò)濾于帶有內(nèi)襯管的樣品瓶?jī)?nèi)，作為樣品溶液備用；S2.采用HPLC檢測(cè)樣品溶液中檸檬酸的含量。S2-1色譜條件：ARigolL3000高效液相色譜儀；色譜柱：CSTC18反相色譜柱（250mm*4.6mm,5μm）；流動(dòng)相：12.5mmol/L的磷酸二氫鈉水溶液800mL，加入16mL甲醇，用0.5mol/L的磷酸水溶液調(diào)節(jié)溶液pH至2.8，混勻；柱溫：35℃；流速：0.8mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：214nm；進(jìn)樣體積：10μL。S2-2取不同生長(zhǎng)階段（0、4、8、16d）的甘蔗接種樣品YT94-128、GT37和甘蔗對(duì)照樣品制成的研究樣品溶液，進(jìn)行檸檬酸含量的測(cè)定，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次，使用實(shí)施例1S2-2制得的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算結(jié)果，結(jié)果見(jiàn)表3。表3不同生長(zhǎng)階段甘蔗接種樣品中檸檬酸的含量S2-3實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析。檸檬酸（CA）作為三羧酸循環(huán)中間物質(zhì)之一，其含量高低直接與植物生長(zhǎng)、發(fā)育及其抗性有關(guān)。經(jīng)鑒定，YT94-128對(duì)梢腐病表現(xiàn)出抗性，GT37對(duì)梢腐病表現(xiàn)出感性。由上述表3獲得的數(shù)據(jù)制得檸檬酸含量的趨勢(shì)分析圖，如圖3所示，其中，A為接種樣品YT94-128的檸檬酸含量變化趨勢(shì)，B為對(duì)照樣品GT37的檸檬酸含量變化趨勢(shì)，C為對(duì)照樣品YT94-128的檸檬酸含量變化趨勢(shì)，D為接種樣品GT37的檸檬酸含量變化趨勢(shì)，結(jié)合圖3所示，對(duì)照樣品中的檸檬酸含量隨甘蔗生長(zhǎng)而緩慢上升，抗病品種YT94-128的檸檬酸含量變化趨勢(shì)高于感病品種GT37；病原菌接種處理的甘蔗葉片中檸檬酸含量表現(xiàn)出隨甘蔗生長(zhǎng)而不斷增加并不斷趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)；其中，對(duì)照之間檸檬酸含量差異并不顯著，而接種4天后處理間含量差異達(dá)到極顯著。本試驗(yàn)說(shuō)明，空白處理下，感病品種GT37葉片合成檸檬酸的速率要高于抗病品種YT94-128；在接種病原菌后，感病品種GT37梢腐病病情指數(shù)不斷加重，其葉片合成檸檬酸的能力受到顯著影響，同時(shí)蔗株在受到生物（病原菌）和非生物（針刺）脅迫后發(fā)生檸檬酸次生合成反應(yīng)，但前者大于后者，從而導(dǎo)致GT37葉片中檸檬酸含量出現(xiàn)波峰后呈顯著降低趨勢(shì)?？共∑贩NYT94-128在接種病原菌后，因其病情指數(shù)并不嚴(yán)重，其在接種后葉片檸檬酸含量不斷增加，在接種10天左右達(dá)到一個(gè)穩(wěn)定狀態(tài)，這也反映檸檬酸含量與甘蔗梢腐病病情指數(shù)呈負(fù)相關(guān)，與抗病性呈正相關(guān)。結(jié)論：由試驗(yàn)可看出，對(duì)梢腐病呈抗性的甘蔗品種檸檬酸含量都呈不斷增加趨勢(shì)，而對(duì)梢腐病呈感性的甘蔗品種合成檸檬酸能力嚴(yán)重下降，這一試驗(yàn)結(jié)果為研究檸檬酸抗逆性生理生化機(jī)制、篩選抗病品種和指導(dǎo)甘蔗抗病育種提供了重要的技術(shù)參考。本文中所描述的具體實(shí)施例僅僅是對(duì)本發(fā)明精神作舉例說(shuō)明。本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員可以對(duì)所描述的具體實(shí)施例做各種各樣的修改或補(bǔ)充或采用類(lèi)似的方式替代，但并不會(huì)偏離本發(fā)明的精神或者超越所附權(quán)利要求書(shū)所定義的范圍。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3