本發明涉及式1所示水楊酸酰胺衍生物DHMEQ軟膏劑，以及其質量分析方法。該水楊酸酰胺衍生物可供治療癌癥、炎癥、自身免疫疾病、糖尿病和糖尿病并發癥、感染、心血管疾病和缺血再灌注損傷。
背景技術：
核因子κB(NF-κB，Nuclear factor-kappa B)活化參與各種疾病，包括癌癥、糖尿病、心血管疾病、自身免疫疾病、病毒復制、膿毒性休克、神經變性疾病、運動失調性毛細血管擴張癥(AT)、關節炎、哮喘、炎性腸病和其它炎性病癥。例如，革蘭氏陰性細菌脂多糖(LPS)活化NF-κB可產生膿毒性休克，因為NF-κB過度激活許多細胞因子和修飾酶的轉錄，它們的表達延長可不利地影響關鍵器官，例如心臟和肝臟的功能(Arcaroli等.，2006；Niu等.，2008)。
類似地，自身免疫疾病，例如全身性紅斑狼瘡也可能涉及NF-κB的活化。NF-κB轉錄因子對于適當的樹突細胞成熟至關重要，其喪失是全身性紅斑狼瘡的標志(Kalergis等.，2008；Kurylowicz和Nauman，2008)，此外，在慢性阿爾茨海默病中，淀粉樣蛋白β肽導致反應活性氧中間體的產生，通過NF-κB位點間接活化基因表達(Giri等.，2005)。
骨的破壞性侵蝕或骨質溶解是炎性病癥，例如類風濕性關節炎(RA)、牙周病和假體周圍骨質溶解的主要并發癥。RA是影響約1.0％美國成年人的自身免疫疾病，女性和男性之比是2.5到l(Lawrence等.，1998)。其標志是導致主要病態的漸進性關節破壞。牙周病非常普遍，影響全球高達90％的人口。眾所周知其是成年人牙齒喪失的主要原因(Pihlstrom等.，2005)。盡管很普遍，但牙周骨侵蝕的發生機制仍不清楚，雖然看來是宿主對口腔中存在的病原微生物的反應觸發該過程。外源性植入物器件周圍的慢性骨再吸收作用導致假體周圍骨質溶解，直至喪失固定作用(Harris，1995)，據信其是針對磨損碎片顆粒的先天免疫反應所致，獲得性免疫系統影響不大(Goldring等.，1986)。
雖然這些病癥由不同原因引發，通過各種途徑而進展，但這些病癥的病理性過程中的重要共同因素是發炎組織中NF-κB途徑的組成型活化驅動的促炎性細胞因子過度產生。與全身性、激素調控的骨病理狀況，例如骨質疏松癥不同，這些病癥中發現的骨侵蝕大多定位于發炎的組織。在許多這些疾病中發現，這些發炎組織還產生促炎細胞因子，即，TNF-α、IL-1和IL-6，這些促炎細胞因子進而參與破骨細胞分化信號傳導和骨再吸收活性。因此，炎性骨質溶解是發炎組織中NF-κB驅動促炎細胞因子推動的破骨細胞募集和活化增強所致。
炎性腸病(IBD)包括涉及胃腸道的許多慢性復發性炎性疾病。IBD的兩種最常見的形式是克羅恩病和潰瘍性結腸炎，二者的區別在于獨特的組織病理學特性和免疫應答(Atreya等.，2008；Bouma和Strober，2003)。目前的治療療效有限，還可能有副作用使得患者和醫生渴望能控制這些疾病的慢性復發性炎癥性質的新療法。
雖然導致克羅恩病和潰瘍性結腸炎的確切病因尚未知，但通常認為是粘膜免疫系統對正常腸菌群的不當和正進行的活化導致(Tilg等.，2008)。因此，駐留型巨噬細胞、樹突細胞和T細胞活化并開始主要分泌NF-κB-依賴性趨化因子和細胞因子。NF-κB介導關鍵促炎介質的過度產生導致人IBD和結腸炎動物模型的啟動和進展(Neurath等.，1998；Wirtz和Neurath，2007)。具體地說，IBD患者的巨噬細胞表現出高水平的NF-κB DNA結合活性并伴有白介素(IL)l、IL6和腫瘤壞死因子TNFα的產生增加(Neurath等.，1998)。此外，NF-κB在活化T輔助細胞l(Thl)和T輔助細胞2(Th2)細胞因子中起到關鍵作用，二者是促進和維持炙癥所需(Barnes，1997)。由于NF-κB在IBD中起到的核心作用，人們付出大量努力試圖開發靶向該途徑的療法。
NF-κB顯示在來自乳腺、卵巢、結腸、胰腺、甲狀腺、前列腺、肺、頭頸、膀胱和皮膚腫瘤的許多癌癥衍生細胞系中組成型表達(Calzado等.，2007)。B-細胞性淋巴瘤、霍奇金病、T-細胞性淋巴瘤、成人T細胞白血病，急性淋巴細胞性白血病、多發性骨髓瘤、慢性淋巴細胞性白血病和急性骨髓性白血病中也觀察到。NF-κB作為防御性應答的一部分是正常炎癥的關鍵介質；然而，慢性炎癥可導致癌癥、糖尿病和許多上述其它疾病。己鑒定了幾種促炎基因產物在致癌過程、血管發生、侵襲和腫瘤細胞轉移中介導關鍵作用。這些基因產物有TNF-α及其超家族的成員，IL-1α、IL-1D、IL-6、IL-8、IL-18、趨化因子、MMP-9、VEGF、COX-2和5-LOX。所有這些基因的表達主要由轉錄因子NF-κB調控，其在大多數腫瘤中有組成型活性并由致癌物(例如香煙的煙)、腫瘤促進劑、致癌性病毒蛋白(HIV-tat、KHSV、EBV-LMP1、HTLVl-tax、HPV、HCV和HBV)、化療劑和γ射線誘導(Aggarwal等.，2006)。這些觀察結果暗示抑制NF-κB的抗炎劑應該可能用于預防和治療癌癥。
流感病毒蛋白血凝素還活化NF-κB，該活化可導致細胞因子的病毒誘導和一些流感相關癥狀(Flory等.，2000；Pahl和BaeueR1e，1995)。
動脈粥樣硬化相關的低密度脂蛋白的氧化脂質活化NF-κB，然后活化其它基因，例如炎性細胞因子(Liao等.，1994)。此外，動脈粥樣硬化易感小鼠在喂食致動脈粥樣硬化飲食時顯示NF-κB活化，因為它們對脂質過氧化產物累積、炎性基因誘導和NF-κB轉錄因子活化相關的動脈粥樣硬化病損形成敏感(Liao等.，1994)。動脈粥樣硬化的另一重要原因是凝血酶，其通過NF-κB活化而刺激血管平滑肌細胞增殖(Maruyama等.，1997)。IκB阻遏蛋白的截短形式(IκBα)顯示是電離輻射超敏性的原因，在組成型水平NF-κB-活化的運動失調性毛細血管擴張癥(AT)細胞中其對DNA合成調控有缺陷(Jung等.，1995)。AT細胞的IκBα中的該突變顯示導致NF-κB途徑組成型活化的阻遏蛋白滅活。鑒于所有這些發覡，NF-κB的異常活化或表達明顯與各種病理學狀況相關。
人單核細胞中，HIV-1的感染和生命周期與NF-κB途徑緊密相連。病毒感染導致NF-κB活化，從而產生AIDS標志性的T細胞過度刺激和最終耗盡(綜述見(Argyropoulos和Mouzaki，2006)。例如，NF-κB調節作為HIV-1關鍵受體的CCR5的表達(Liu等.，1998)。CCR-5啟動子的缺失分析證明3’-遠端NF-κB/AP-l位點的喪失使得轉錄降低>95％(Liu等.，1998)。這些研究提示NF-κB的組成型表達導致CCR-5受體信息急劇降低。由于靶T-細胞表面上CCR5的表達水平影響HIV-1進入動力學特性(Ketas等.，2007；Platt等.，1998；Reeves等.，2002)，下調CCR5可約束大量產生病毒庫的感染細胞群擴散。還有報道說NF-κB影響CXCR4表達(Helbig等.，2003)，提示NF-κB抑制劑可能同樣有效抗感染后期期間出現的X4-向性分離物。整合的DNA-前-病毒的轉錄需要NF-κB(Baba，2006；Iordanskiy等.，2002；Mukerjee等.，2006；Palmieri等.，2004；Rizzi等.，2004；Sui等.，2006；Williams等.，2007)。事實上，缺乏NF-κB活化導致具有潛伏病毒的細胞群產生，這是消除受感染患者的病毒的主要障礙(Williams等.，2006)。
NF-κB促進超過150種靶基因對炎性刺激物起反應而表達。這些基因包括白介素-1、-2、-6和腫瘤壞死因子受體(TNF-R)(這些受體介導凋亡并起到炎癥調節劑的作用)以及編碼免疫受體、絀胞粘附分子和酶，例如環加氧酶-II和誘生型-氧化氮核酶(iNOS)的基因(Karin，2006；Tergaonkar，2006)。其還在病毒感染，例如HCV和HIV-1相關疾病的進展中起關鍵作用。
NF-κB家族的成員包括RelA/p65、RelB、c-Rel、p50/p105(NF-κBl)和p52/pl00(NF-κB2)(Hayden和Ghosh，2004；Hayden等.，2006a；Hayden等.，2006b)。Rel家族成員作為同源二聚體或異源二聚體起作用，對位于NF-κB-調節基因的啟動子結構域內的順式結合元件的特異性不同(Bosisio等.，2006；Natoli等.，2005；Saccani等.，2004)。經典NF-κB-由RelAlp65和p50異源二聚體構成，是NF-κB研究得最清楚的形式(Burstein和Duckett，2003；Hayden和Ghosh，2004)和其中的參考文獻)。細胞刺激前，經典NF-κB駐留在細胞質中作為與IκBα抑制蛋白結合的無活性復合物。NF-κB的誘導劑，例如細菌脂多糖、炎性細胞因子或HIV-1Vpr蛋白通過活仳磷酸化IκBα的IκB-激酶復合物(IKK)而從細胞質復合物釋放活性NF-κB(Greten和Karin，2004；Hacker和Karin，2006；Israel，2000；Karin，1999；Scheidereit，2006)。IκB的磷酸為隨后的泛素化和通過26S蛋白酶體降解提供了標記。游離NF-κB二聚體移位進入核，在核中刺激它們的靶基因轉錄。
外消旋脫羥基甲基環氧醌霉素(DHMEQ)的分子設計是依據從擬無枝菌酸菌(Amycolatopsis)分離的抗生素環氧醌霉素C(Chaicharoenpong等.2002)。DHMEQ是采用五步驟從2,5-二甲氧基苯胺合成的外消旋物。利用手性柱分離對映體產生(+)和(-)對映體。(-)-對映體顯示抑制NF-κB強于(+)-對映體(Umezawa等.2004)。DHMEQ經鑒定為特異性抑制NF-κB移位入核(Ariga等.2002)。具體地說，其以1：1的化學計量比共價修飾p65和其它Rel同源蛋白中的特定半胱氨酸殘基(Yammamoto等.2008)。作為NF-κB抑制劑，在各種疾病的動物模型中廣泛測試了DHMEQ，證明包括洽療實體瘤、血液惡性腫瘤、關節炎、腸缺血和動脈粥樣硬化在內的廣譜效力(Watanabe等.2006)。因此，DHMEQ可用作癌癥和炎癥的治療(Takeuchi等.2003)。CN1368954A(中國專利申請號00811487.0)公開了DHMEQ(即其中的DHM2EQ，DHM2EQ和DHMEQ二者在本文中具有相同的含義，可互換使用，在本發明中亦可稱為式1化合物或式I化合物)的合成方法，其中在步驟3中，在溶劑四氫呋喃中、在過氧化氫和氫氧化鈉的存在下，3-(O-乙酰基水楊酰氨基)-4,4-二甲氧基-2,5-環己二烯酮反應生成5,6-環氧-4,4-二甲氧基-3-水楊酰氨基-2-環己烯酮，反應物需要通過繁雜的處理工藝并且所得產物品質較差。為其后續工藝增加了障礙。
5,6-環氧-4-羥基-3-水楊酰氨基-2-環己烯酮即DHMEQ作為外用藥劑用于治療相關疾病是有益的。由于5,6-環氧-4-羥基-3-水楊酰氨基-2-環己烯酮在水中的溶解性差，因此做成油性基質的軟膏劑是有必要的。軟膏劑系指原料藥物與油脂性或水溶性基質混合制成的均勻的半固體外用制劑。因原料藥物在基質中分散狀態不同，分為溶液型軟膏劑和混懸型軟膏劑。溶液型軟膏劑為原料藥物溶解(或共熔)于基質或基質組分中制成的軟膏劑；混懸型軟膏劑為原料藥物細粉均勻分散于基質中制成的軟膏劑。常規軟骨含量測定中供試品的制備方法主要是用溶劑直接提取，或是加熱后使基質溶解再溶劑提取。DHMEQ軟膏是正在研究開發的國家1類新藥，該化合物是通過作用于NF-kB信號通路上受體核轉錄因子(NF-kB)p65蛋白靶點，臨床上擬用于治療特異性皮炎，擬定劑型為軟膏。然而這種油性基質的軟膏劑在對主成分進行質量控制時存在諸多技術困難。
因此，本領域技術人員還期待有新的方法來對5,6-環氧-4-羥基-3-水楊酰氨基-2-環己烯酮軟膏劑的質量進行控制，即提供一種適用的質量分析方法以對5,6-環氧-4-羥基-3-水楊酰氨基-2-環己烯酮軟膏劑進行質量控制。此外，本領域技術人員仍然期待有一種具有良好工藝特征的新方法來制備DHMEQ。
技術實現要素：
本發明目的在于提供一種新的方法來對5,6-環氧-4-羥基-3-水楊酰氨基-2-環己烯酮軟膏劑的質量進行控制，即提供一種適用的質量分析方法以對5,6-環氧-4-羥基-3-水楊酰氨基-2-環己烯酮軟膏劑進行質量控制。此外，本發明另一目的在于提供一種具有良好工藝特征的新方法來制備DHMEQ(即：5,6-環氧-4-羥基-3-水楊酰氨基-2-環己烯酮)。本發明人發現本發明方法具有某種或某些優異性質。本發明基于此發現而得以完成。
在本發明的第一方面，示例性的，可以照以下方法來制備以下式1化合物即5,6-環氧-4-羥基-3-水楊酰氨基-2-環己烯酮：
該方法包括以下步驟：
步驟a：使2,5-二甲氧基苯胺溶于有機溶劑(例如吡啶)中，在-78～50℃的溫度下(例如在冰冷卻下)，向其中添加以下式(7)的O-烷酰基水楊酰氯的乙酸乙酯溶液，攪拌下使反應進行；然后，加水使反應停止，再加入乙酸乙酯，反應液依次用鹽酸、水、碳酸氫鈉水溶液和水洗滌后，干燥，減壓濃縮，再真空干燥，獲得以下式(2)表示的N-(2-烷酰氧基苯甲酰基)-2,5-二甲氧基苯胺：
其中，R1表示氫原子或者C2～4烷酰基，例如乙酰基；
步驟b：使以上獲得的式(2)的化合物溶于溶劑例如R3OH表示的溶劑中，在-20～50℃的溫度下(例如在冰冷卻下)，向其中添加二乙酰氧基碘苯，室溫下攪拌使反應進行；然后減壓濃縮，在其中添加乙酸乙酯，反應液分別用碳酸氫鈉水溶液和食鹽水洗滌后，減壓濃縮溶劑，對殘渣進行精制，獲得以下式(3)表示的3-(O-烷酰基水楊酰氨基)-4,4-二烷氧基-2,5-環己二烯酮：
其中R3表示C1～4烷基，例如甲基；
步驟c：使式(3)化合物溶于有機溶劑(例如四氫呋喃、甲醇、二甲基甲酰胺，特別是例如二甲基甲酰胺)中；在-20～50℃的溫度下(例如在冰冷卻下)，在其中添加過氧化氫水溶液及無機堿(例如氫氧化鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉，特別是例如碳酸鈉)，攪拌使反應進行；然后在反應液中加入乙酸乙酯，反應液依次用鹽酸溶液、硫代硫酸鈉水溶液和食鹽水洗滌后干燥，再進行真空干燥；使干燥所得物料溶解于丙酮-石油醚(二者體積比為6～10∶1)的混合溶劑中，加入等體積的飽和食鹽水萃取(重復萃取2～3次)，棄水層，有機層干燥(例如用芒硝干燥)，減壓濃縮，真空干燥，獲得以下式(4)表示的5,6-環氧-4,4-二烷氧基-3-水楊酰氨基-2-環己烯酮：
步驟d：使式(4)化合物溶于溶劑例如二氯甲烷中；在冰冷卻下，向其中添加無機酸或有機酸(例如三氟化硼乙醚絡合物等)，攪拌下使反應進行；然后在反應液中加入有機溶劑(例如乙酸乙酯)，用水洗滌，將有機層濃縮后，所得殘渣用甲醇洗滌，獲得以下式(5)表示的5,6-環氧-2-水楊酰氨基-2-環己烯-1,4-二酮：
步驟e：使式(5)化合物懸浮于溶劑(例如甲醇、乙醇、THF)中；在-78～50℃的溫度下(例如在冰冷卻下)，在其中添加還原劑(例如硼氫化鈉)使反應進行；反應完畢后，向反應液中加入溶劑(例如乙酸乙酯、二氯甲烷等)，反應液依次用鹽酸和水洗滌，對溶劑層進行干燥和減壓濃縮，使濃縮物懸浮于甲醇后攪拌洗滌，干燥，獲得以下式(1)表示的5,6-環氧-4-羥基-3-水楊酰氨基-2-環己烯酮(DHM2EQ)
根據本發明的第一方面的方法，其包括以下步驟：
步驟a：N-(2-烷酰氧基苯甲酰基)-2,5-二甲氧基苯胺的制備
使2,5-二甲氧基苯胺溶于有機溶劑(例如吡啶)中，在-78～50℃的溫度下(例如在冰冷卻下)，向其中添加式(7)的O-烷酰基水楊酰氯的乙酸乙酯溶液，攪拌下使反應進行；然后，加水使反應停止，再加入乙酸乙酯，反應液依次用鹽酸、水、碳酸氫鈉水溶液和水洗滌后，干燥，減壓濃縮，再真空干燥，獲得式(2)表示的N-(2-烷酰氧基苯甲酰基)-2,5-二甲氧基苯胺；其中R1表示氫原子或者C2～4烷酰基，例如乙酰基；
步驟b：3-(O-烷酰基水楊酰氨基)-4,4-二烷氧基-2,5-環己二烯酮的制備
使以上獲得的式(2)的化合物溶于溶劑例如R3OH表示的溶劑中，在-20～50℃的溫度下(例如在冰冷卻下)，向其中添加二乙酰氧基碘苯，室溫下攪拌使反應進行；然后減壓濃縮，在其中添加乙酸乙酯，反應液分別用碳酸氫鈉水溶液和食鹽水洗滌后，減壓濃縮溶劑，對殘渣進行精制，獲得式(3)表示的3-(O-烷酰基水楊酰氨基)-4,4-二烷氧基-2,5-環己二烯酮；其中R3表示C1～4烷基，例如甲基；
步驟c：5,6-環氧-4,4-二烷氧基-3-水楊酰氨基-2-環己烯酮的制備
使式(3)表示的3-(O-烷酰基水楊酰氨基)-4,4-二烷氧基-2,5-環己二烯酮溶于有機溶劑(例如四氫呋喃、甲醇、二甲基甲酰胺，特別是例如二甲基甲酰胺)中；在-20～50℃的溫度下(例如在冰冷卻下)，在其中添加過氧化氫水溶液及無機堿(例如氫氧化鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉，特別是例如碳酸鈉)，攪拌使反應進行；然后在反應液中加入乙酸乙酯，反應液依次用鹽酸溶液、硫代硫酸鈉水溶液和食鹽水洗滌后干燥，再進行真空干燥；使干燥所得物料溶解于丙酮-石油醚(二者體積比為6～10：1)的混合溶劑中，加入等體積的飽和食鹽水萃取(重復萃取2～3次)，棄水層，有機層干燥(例如用芒硝干燥)，減壓濃縮，真空干燥，獲得式(4)表示的5,6-環氧-4,4-二烷氧基-3-水楊酰氨基-2-環己烯酮。
步驟d：5,6-環氧-2-水楊酰氨基-2-環己烯-1,4-二酮的制備
使式(4)的5,6-環氧-4,4-二烷氧基-3-水楊酰氨基-2-環己烯酮溶于溶劑例如二氯甲烷中；在冰冷卻下，向其中添加無機酸或有機酸(例如三氟化硼乙醚絡合物等)，攪拌下使反應進行；然后在反應液中加入有機溶劑(例如乙酸乙酯)，用水洗滌，將有機層濃縮后，所得殘渣用甲醇洗滌，獲得式(5)表示的5,6-環氧-2-水楊酰氨基-2-環己烯-1,4-二酮；
步驟e：5,6-環氧-4-羥基-3-水楊酰氨基-2-環己烯酮(DHM2EQ)的制備
使式(5)表示的5,6-環氧-2-水楊酰氨基-2-環己烯-1,4-二酮懸浮于溶劑(例如甲醇、乙醇、THF)中；在-78～50℃的溫度下(例如在冰冷卻下)，在其中添加還原劑(例如硼氫化鈉)使反應進行；反應完畢后，向反應液中加入溶劑(例如乙酸乙酯、二氯甲烷等)，反應液依次用鹽酸和水洗滌。然后對溶劑層進行干燥和減壓濃縮，使濃縮物懸浮于甲醇后攪拌洗滌，干燥，獲得式(1)表示的5,6-環氧-4-羥基-3-水楊酰氨基-2-環己烯酮(DHM2EQ)。
根據本發明的第一方面的方法，其包括以下步驟：
步驟a：N-(2-烷酰氧基苯甲酰基)-2,5-二甲氧基苯胺的制備
使2,5-二甲氧基苯胺溶于有機溶劑(例如吡啶)中，在-78～50℃的溫度下(例如在冰冷卻下)，在其中添加式(7)的O-烷酰基水楊酰氯的乙酸乙酯溶液，攪拌下使反應進行；然后，加水使反應停止，再加入乙酸乙酯，反應液依次用鹽酸、水、碳酸氫鈉水溶液和水洗滌后，干燥，減壓濃縮，再真空干燥，獲得式(2)表示的N-(2-烷酰氧基苯甲酰基)-2,5-二甲氧基苯胺。不對該化合物進行精制直接將其用于以下步驟；
其中R1表示氫原子或者C2～4烷酰基，例如乙酰基；
步驟b：3-(O-烷酰基水楊酰氨基)-4,4-二烷氧基-2,5-環己二烯酮的制備
使以上獲得的式(2)的化合物溶于溶劑例如R3OH表示的溶劑中，在-20～50℃的溫度下(例如在冰冷卻下)，在其中添加二乙酰氧基碘苯，室溫下攪拌使反應進行；然后減壓濃縮，在其中添加乙酸乙酯，反應液分別用碳酸氫鈉水溶液和食鹽水洗滌后，減壓濃縮溶劑，用柱色譜法對殘渣進行精制，獲得式(3)表示的3-(O-烷酰基水楊酰氨基)-4,4-二烷氧基-2,5-環己二烯酮；
其中R3表示C1～4烷基，例如甲基；
步驟c：5,6-環氧-4,4-二烷氧基-3-水楊酰氨基-2-環己烯酮的制備
使式(3)表示的3-(O-烷酰基水楊酰氨基)-4,4-二烷氧基-2,5-環己二烯酮溶于有機溶劑(例如四氫呋喃、甲醇、二甲基甲酰胺，特別是例如二甲基甲酰胺)中；在-20～50℃的溫度下(例如在冰冷卻下)，在其中添加過氧化氫水溶液及無機堿(例如氫氧化鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉，特別是例如碳酸鈉)，攪拌使反應進行；然后在反應液中加入乙酸乙酯，反應液依次用鹽酸溶液、硫代硫酸鈉水溶液和食鹽水洗滌后干燥，再進行真空干燥；使干燥所得物料溶解于丙酮-石油醚(二者體積比為6～10：1)的混合溶劑中，加入等體積的飽和食鹽水萃取(3次)，棄水層，有機層干燥(例如用芒硝)，減壓濃縮，真空干燥，獲得式(4)表示的5,6-環氧-4,4-二烷氧基-3-水楊酰氨基-2-環己烯酮；
步驟d：5,6-環氧-2-水楊酰氨基-2-環己烯-1,4-二酮的制備
使式(4)的5,6-環氧-4,4-二烷氧基-3-水楊酰氨基-2-環己烯酮溶于溶劑例如二氯甲烷中；在冰冷卻下，在其中添加無機酸或有機酸(例如三氟化硼乙醚絡合物等)，攪拌下使反應進行；然后在反應液中加入溶劑(例如乙酸乙酯)，用水洗滌，將乙酸乙酯層濃縮后，所得殘渣用甲醇洗滌，獲得式(5)表示的5,6-環氧-2-水楊酰氨基-2-環己烯-1,4-二酮；
步驟e：5,6-環氧-4-羥基-3-水楊酰氨基-2-環己烯酮(DHM2EQ)的制備
使式(5)表示的5,6-環氧-2-水楊酰氨基-2-環己烯-1,4-二酮懸浮于溶劑(例如甲醇、乙醇、THF)中。在-78～50℃的溫度下(例如在冰冷卻下)，在其中添加還原劑(例如硼氫化鈉)使反應進行；反應完畢后，向反應液中加入溶劑(例如乙酸乙酯、二氯甲烷等)，反應液依次用鹽酸和水洗滌。然后對溶劑層進行干燥和減壓濃縮，使濃縮物懸浮于甲醇后攪拌洗滌，干燥，獲得式(1)表示的5,6-環氧-4-羥基-3-水楊酰氨基-2-環己烯酮(DHM2EQ)。
在本發明的第二方面，示例性的，可以照以下方法來制備以下式1化合物即5,6-環氧-4-羥基-3-水楊酰氨基-2-環己烯酮：
該方法包括以下步驟：
步驟c：使式(3)化合物溶于有機溶劑(例如四氫呋喃、甲醇、二甲基甲酰胺，特別是例如二甲基甲酰胺)中；在-20～50℃的溫度下(例如在冰冷卻下)，在其中添加過氧化氫水溶液及無機堿(例如氫氧化鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉，特別是例如碳酸鈉)，攪拌使反應進行；然后在反應液中加入乙酸乙酯，反應液依次用鹽酸溶液、硫代硫酸鈉水溶液和食鹽水洗滌后干燥，再進行真空干燥；使干燥所得物料溶解于丙酮-石油醚(二者體積比為6～10：1)的混合溶劑中，加入等體積的飽和食鹽水萃取(重復萃取2～3次)，棄水層，有機層干燥(例如用芒硝干燥)，減壓濃縮，真空干燥，獲得以下式(4)表示的5,6-環氧-4,4-二烷氧基-3-水楊酰氨基-2-環己烯酮：
其中，R1表示氫原子或者C2～4烷酰基，例如乙酰基；R3表示C1～4烷基，例如甲基；
步驟d：使式(4)化合物溶于溶劑例如二氯甲烷中；在冰冷卻下，向其中添加無機酸或有機酸(例如三氟化硼乙醚絡合物等)，攪拌下使反應進行；然后在反應液中加入有機溶劑(例如乙酸乙酯)，用水洗滌，將有機層濃縮后，所得殘渣用甲醇洗滌，獲得以下式(5)表示的5,6-環氧-2-水楊酰氨基-2-環己烯-1,4-二酮：
步驟e：使式(5)化合物懸浮于溶劑(例如甲醇、乙醇、THF)中；在-78～50℃的溫度下(例如在冰冷卻下)，在其中添加還原劑(例如硼氫化鈉)使反應進行；反應完畢后，向反應液中加入溶劑(例如乙酸乙酯、二氯甲烷等)，反應液依次用鹽酸和水洗滌，對溶劑層進行干燥和減壓濃縮，使濃縮物懸浮于甲醇后攪拌洗滌，干燥，獲得以下式(1)表示的5,6-環氧-4-羥基-3-水楊酰氨基-2-環己烯酮(DHM2EQ)
根據本發明的第二方面的方法，其包括以下步驟：
步驟c：5,6-環氧-4,4-二烷氧基-3-水楊酰氨基-2-環己烯酮的制備
其中，R1表示氫原子或者C2～4烷酰基，例如乙酰基；R3表示C1～4烷基，例如甲基；
使式(3)表示的3-(O-烷酰基水楊酰氨基)-4,4-二烷氧基-2,5-環己二烯酮溶于有機溶劑(例如四氫呋喃、甲醇、二甲基甲酰胺，特別是例如二甲基甲酰胺)中；在-20～50℃的溫度下(例如在冰冷卻下)，在其中添加過氧化氫水溶液及無機堿(例如氫氧化鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉，特別是例如碳酸鈉)，攪拌使反應進行；然后在反應液中加入乙酸乙酯，反應液依次用鹽酸溶液、硫代硫酸鈉水溶液和食鹽水洗滌后干燥，再進行真空干燥；使干燥所得物料溶解于丙酮-石油醚(二者體積比為6～10：1)的混合溶劑中，加入等體積的飽和食鹽水萃取(重復萃取2～3次)，棄水層，有機層干燥(例如用芒硝干燥)，減壓濃縮，真空干燥，獲得式(4)表示的5,6-環氧-4,4-二烷氧基-3-水楊酰氨基-2-環己烯酮；
步驟d：5,6-環氧-2-水楊酰氨基-2-環己烯-1,4-二酮的制備
使式(4)的5,6-環氧-4,4-二烷氧基-3-水楊酰氨基-2-環己烯酮溶于溶劑例如二氯甲烷中；在冰冷卻下，向其中添加無機酸或有機酸(例如三氟化硼乙醚絡合物等)，攪拌下使反應進行；然后在反應液中加入有機溶劑(例如乙酸乙酯)，用水洗滌，將有機層濃縮后，所得殘渣用甲醇洗滌，獲得式(5)表示的5,6-環氧-2-水楊酰氨基-2-環己烯-1,4-二酮；
步驟e：5,6-環氧-4-羥基-3-水楊酰氨基-2-環己烯酮(DHM2EQ)的制備
使式(5)表示的5,6-環氧-2-水楊酰氨基-2-環己烯-1,4-二酮懸浮于溶劑(例如甲醇、乙醇、THF)中；在-78～50℃的溫度下(例如在冰冷卻下)，在其中添加還原劑(例如硼氫化鈉)使反應進行；反應完畢后，向反應液中加入溶劑(例如乙酸乙酯、二氯甲烷等)，反應液依次用鹽酸和水洗滌。然后對溶劑層進行干燥和減壓濃縮，使濃縮物懸浮于甲醇后攪拌洗滌，干燥，獲得式(1)表示的5,6-環氧-4-羥基-3-水楊酰氨基-2-環己烯酮(DHM2EQ)。
根據本發明的第二方面的方法，其包括以下步驟：
步驟c：5,6-環氧-4,4-二烷氧基-3-水楊酰氨基-2-環己烯酮的制備
其中，R1表示氫原子或者C2～4烷酰基，例如乙酰基；R3表示C1～4烷基，例如甲基；
使式(3)表示的3-(O-烷酰基水楊酰氨基)-4,4-二烷氧基-2,5-環己二烯酮溶于有機溶劑(例如四氫呋喃、甲醇、二甲基甲酰胺，特別是例如二甲基甲酰胺)中；在-20～50℃的溫度下(例如在冰冷卻下)，在其中添加過氧化氫水溶液及無機堿(例如氫氧化鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉，特別是例如碳酸鈉)，攪拌使反應進行；然后在反應液中加入乙酸乙酯，反應液依次用鹽酸溶液、硫代硫酸鈉水溶液和食鹽水洗滌后干燥，再進行真空干燥；使干燥所得物料溶解于丙酮-石油醚(二者體積比為6～10：1)的混合溶劑中，加入等體積的飽和食鹽水萃取(3次)，棄水層，有機層干燥(例如用芒硝)，減壓濃縮，真空干燥，獲得式(4)表示的5,6-環氧-4,4-二烷氧基-3-水楊酰氨基-2-環己烯酮；
步驟d：5,6-環氧-2-水楊酰氨基-2-環己烯-1,4-二酮的制備
使式(4)的5,6-環氧-4,4-二烷氧基-3-水楊酰氨基-2-環己烯酮溶于溶劑例如二氯甲烷中；在冰冷卻下，在其中添加無機酸或有機酸(例如三氟化硼乙醚絡合物等)，攪拌下使反應進行；然后在反應液中加入溶劑(例如乙酸乙酯)，用水洗滌，將乙酸乙酯層濃縮后，所得殘渣用甲醇洗滌，獲得式(5)表示的5,6-環氧-2-水楊酰氨基-2-環己烯-1,4-二酮；
步驟e：5,6-環氧-4-羥基-3-水楊酰氨基-2-環己烯酮(DHM2EQ)的制備
使式(5)表示的5,6-環氧-2-水楊酰氨基-2-環己烯-1,4-二酮懸浮于溶劑(例如甲醇、乙醇、THF)中。在-78～50℃的溫度下(例如在冰冷卻下)，在其中添加還原劑(例如硼氫化鈉)使反應進行；反應完畢后，向反應液中加入溶劑(例如乙酸乙酯、二氯甲烷等)，反應液依次用鹽酸和水洗滌。然后對溶劑層進行干燥和減壓濃縮，使濃縮物懸浮于甲醇后攪拌洗滌，干燥，獲得式(1)表示的5,6-環氧-4-羥基-3-水楊酰氨基-2-環己烯酮(DHM2EQ)。
在本發明的第三方面，示例性的，可以照以下方法來制備以下式4化合物：
該方法包括以下步驟：
使式(3)化合物
溶于有機溶劑(例如四氫呋喃、甲醇、二甲基甲酰胺，特別是例如二甲基甲酰胺)中；
在-20～50℃的溫度下(例如在冰冷卻下)，向其中添加過氧化氫水溶液及無機堿(例如氫氧化鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉，特別是例如碳酸鈉)，攪拌使反應進行；
然后在反應液中加入乙酸乙酯，反應液依次用鹽酸溶液、硫代硫酸鈉水溶液和食鹽水洗滌后干燥，再進行真空干燥；
使干燥所得物料溶解于丙酮-石油醚(二者體積比為6～10：1)的混合溶劑中，加入等體積的飽和食鹽水萃取(重復萃取2～3次)，棄水層，有機層干燥(例如用芒硝干燥)，減壓濃縮，真空干燥，獲得以下式(4)表示的5,6-環氧-4,4-二烷氧基-3-水楊酰氨基-2-環己烯酮：
其中，其中R1表示氫原子或者C2～4烷酰基，例如乙酰基；
R3表示C1～4烷基，例如甲基。
根據本發明的第三方面的方法，其包括以下步驟：
使式(3)表示的3-(O-烷酰基水楊酰氨基)-4,4-二烷氧基-2,5-環己二烯酮溶于有機溶劑(例如四氫呋喃、甲醇、二甲基甲酰胺，特別是例如二甲基甲酰胺)中；
在-20～50℃的溫度下(例如在冰冷卻下)，在其中添加過氧化氫水溶液及無機堿(例如氫氧化鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉，特別是例如碳酸鈉)，攪拌使反應進行；
然后在反應液中加入乙酸乙酯，反應液依次用鹽酸溶液、硫代硫酸鈉水溶液和食鹽水洗滌后干燥，再進行真空干燥；
使干燥所得物料溶解于丙酮-石油醚(二者體積比為6～10：1)的混合溶劑中，加入等體積的飽和食鹽水萃取(重復萃取2～3次)，棄水層，有機層干燥(例如用芒硝干燥)，減壓濃縮，真空干燥，獲得式(4)表示的5,6-環氧-4,4-二烷氧基-3-水楊酰氨基-2-環己烯酮。
根據本發明的第三方面的方法，其包括以下步驟：
使式(3)表示的3-(O-烷酰基水楊酰氨基)-4,4-二烷氧基-2,5-環己二烯酮溶于有機溶劑(例如四氫呋喃、甲醇、二甲基甲酰胺，特別是例如二甲基甲酰胺)中；
在-20～50℃的溫度下(例如在冰冷卻下)，在其中添加過氧化氫水溶液及無機堿(例如氫氧化鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉，特別是例如碳酸鈉)，攪拌使反應進行；
然后在反應液中加入乙酸乙酯，反應液依次用鹽酸溶液、硫代硫酸鈉水溶液和食鹽水洗滌后干燥，再進行真空干燥；
使干燥所得物料溶解于丙酮-石油醚(二者體積比為6～10：1)的混合溶劑中，加入等體積的飽和食鹽水萃取3次，棄水層，有機層干燥(例如用芒硝)，減壓濃縮，真空干燥，獲得式(4)表示的5,6-環氧-4,4-二烷氧基-3-水楊酰氨基-2-環己烯酮。
根據本發明的任一方面，其中在制備5,6-環氧-4,4-二烷氧基-3-水楊酰氨基-2-環己烯酮的過程中，過氧化氫的用量是式3化合物即3-(O-乙酰基水楊酰氨基)-4,4-二甲氧基-2,5-環己二烯酮用量的8～12倍(摩爾)。相比而言，CN1368954A之實施例3中過氧化氫的用量是式3化合物的16倍(摩爾)，但是其收率以及產物純度遠不及本發明方法，并且其后后處理比本發明方法復雜。
需要說明的是，本發明組合物中使用的原料藥DHMEQ可以照本發明方法制備，亦可照其它現有技術方法制備，使用本發明方法制備原料藥只是示例性的。
本發明第四方面涉及一種藥物組合物，其中包含式1化合物或其藥學上可接受的鹽、溶劑合物、酯、前藥、異構體，以及藥學上可接受的載體。
根據本發明第四方面的藥物組合物，其為軟膏劑。
根據本發明第四方面的藥物組合物，其為軟膏劑，其基質是凡士林。
根據本發明第四方面的藥物組合物，其中藥物在軟膏劑中的含量為0.5～5％，例如藥物在軟膏劑中的含量為0.5～2.5％，例如藥物在軟膏劑中的含量為0.5～2％。
進一步的，本發明第五方面提供了一種對本發明第四方面所述藥物組合物進行質量控制的方法，該方法包括對所述藥物組合物中的活性成分進行含量測定。
根據本發明第五方面的方法，其中對所述藥物組合物中的活性成分進行含量測定包括以下步驟：
(1)色譜條件與系統適用性試驗：用十八烷基鍵合硅膠為填充劑；以乙腈為流動相A，0.05％(ml/ml)磷酸為流動相B，按下表進行梯度洗脫；檢測波長為230nm；
(2)供試品溶液的制備：取軟膏劑組合物4g，精密稱定，置50ml比色管中，精密加入溶劑適量，加玻璃珠適量，充分振搖使DHMEQ溶解，濾過，作為供試品溶液；
(3)對照品溶液的制備：取DHMQ對照品適量，精密稱定，加溶劑定量溶解制成每1ml含有DHMEQ為0.2mg的對照品溶液；
(4)測定：分別精密量取上述對照品溶液和供試品溶液各10μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖；按外標法以峰面積計算，計算每1g的DHMEQ軟膏中的DHMEQ含量。
根據本發明第五方面的方法，其中在制備供試品溶液和對照品溶液時所使用的溶劑是二甲基亞砜溶液。
根據本發明第五方面的方法，其中在制備供試品溶液和對照品溶液時所使用的溶劑是二甲基亞砜溶液，該溶液中含有0.05％的酸。
根據本發明第五方面的方法，其中所述的酸選自：磷酸、硫酸、硝酸、鹽酸、氫氟酸、三氟乙酸、甲酸、乙酸等。已經出人意料地發現，使用三氟乙酸能夠獲得優異的方法學效果，特別是配制的測試樣品具有優異的穩定性。具體地說，在分析例1～3中，供試品溶液在室溫下放置5小時后重復測定6次含量，結果供試品中的活性成分顯著下降，含量平均值均下降5～7％，例如在分析例1中供試品溶液在室溫下放置5小時后重復測定6次含量的平均值為92.2％，RSD為1.1％；在分析例2中供試品溶液在室溫下放置5小時后重復測定6次含量的平均值為94.1％，RSD為1.4％；在分析例3中供試品溶液在室溫下放置5小時后重復測定6次含量的平均值為93.5％，RSD為1.6％；這表明分析方法中使用磷酸和二甲基亞砜為溶劑配制的供試品溶液不宜過長時間放置。另外，參照分析例1～3，不同的僅是在配制溶劑時向二甲基亞砜中添加的酸為等量的三氟乙酸，結果：分析方法的重復性試驗結果分別基本上與分析例1～3相同；分析方法的回收率試驗結果分別基本上與分析例1～3相同；使用此三氟乙酸并分別參照分析例1～3的試驗中，供試品溶液在室溫下放置5小時后重復測定6次含量，結果供試品中的活性成分與未放置5小時而測定的結果基本相同，含量平均值相差均不超過1個百分點，且RSD均小于0.7；可見，使用三氟乙酸和二甲基亞砜為溶劑配制的供試品溶液具有優異的穩定性。補充的試驗發現，使用其它酸，例如鹽酸、硫酸、乙酸作為溶劑中添加的酸進行試驗時，結果與使用磷酸基本類似，供試品溶液的穩定性均不理想。但是完全無法解釋的是，在分析例1～3中以及以上使用三氟乙酸的對照試驗中，將用添加了磷酸或三氟乙酸的溶劑配制的對照品溶液在室溫下放置5小時后進行HPLC測定，峰面積卻沒有明顯的變化，這表明使用同樣溶劑配制的對照品溶液卻未見這種不穩定性。
本發明任一方面或該任一方面的任一實施方案所具有的任一技術特征同樣適用其它任一實施方案或其它任一方面的任一實施方案，只要它們不會相互矛盾，當然在相互之間適用時，必要的話可對相應特征作適當修飾。下面對本發明的各個方面和特點作進一步的描述。
本發明所引述的所有文獻，它們的全部內容通過引用并入本文，并且如果這些文獻所表達的含義與本發明不一致時，以本發明的表述為準。此外，本發明使用的各種術語和短語具有本領域技術人員公知的一般含義，即便如此，本發明仍然希望在此對這些術語和短語作更詳盡的說明和解釋，提及的術語和短語如有與公知含義不一致的，以本發明所表述的含義為準。
用于描述本發明的術語具有以下意義。本發明的化合物和中間體可按照IUPAC(國際理論和應用化學聯合會)或CAS(化學文摘服務部)命名體系命名。
短語“治療有效量”指(i)治療或預防特定疾病、病情或病癥，(ii)減弱、緩解或消除特定疾病、病情或病癥的一種或多種癥狀，或(iii)防止或延緩特定疾病、病情的一種或多種癥狀發作的化合物量。
短語“藥學上可接受的”表示指定的載體、運載體、稀釋劑、賦形劑和/或鹽總體上與構成制劑的其它成分化學和/或物理學相容，并與其受者在生理學上相容。
術語“哺乳動物”指作為分類學哺乳綱成員的各動物，哺乳動物的例子包括但不限于：人、狗、貓、馬和牛等。在本發明中，優選的哺乳動物是人。
本發明的藥物組合物包含治療有效量的式1化合物或其藥學上可接受的鹽和藥學上可接受的載體、運載體、稀釋劑或賦形劑。優選的本發明藥物組合物包含治療有效量的式1化合物或其藥學上可接受的鹽和藥學上可接受的載體、運載體、稀釋劑或賦形劑。雖然不難給予各種劑型的通過混合本發明化合物和藥學上可接受的載體、運載體或稀釋劑形成的藥物組合物，例如片劑、粉末劑、錠劑、糖漿、可注射溶液等。如果需要，這些藥物組合物含有附加成分，例如調味劑、粘合劑、賦形劑等。
因此，為口服給藥，含有各種賦形劑，例如檸檬酸鈉、碳酸鈣和/或磷酸鈣的片劑可與各種崩解劑，例如淀粉、藻酸和/或某些復合硅酸鹽以及粘合劑，例如聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、明膠和/或阿拉伯膠一起使用。此外，潤滑劑，例如硬脂酸鎂、月桂基硫酸鈉和滑石粉常用于壓片目的。相似類型的固體組合物也可用作軟和硬填充明膠膠囊中的填充劑。為此的優選材料包括乳糖和高分子量聚乙二醇。如果需要口服給予酏劑的水性懸液，其中的活性藥物試劑可與各種甜味劑或調味劑、著色物質或染料，和軟化劑或懸浮劑(如果需要的話)以及稀釋劑，例如水、乙醇、丙二醇、甘油和/或它們的組合混合。
對于胃腸外給藥，可利用芝麻油或花生油、水性丙二醇或無菌水溶液配制的本發明化合物或組合物的溶液。如果需要，可適當緩沖此類水性溶液，含充足鹽水或葡萄糖的液體稀釋劑首先賦予等滲性。這些特定的水性溶液尤其適合靜脈內、肌肉內、皮下和腹膜內給藥。就此而言，通過本領域技術人員己知的標準技術不難獲得所用的無菌水性介質。
在一個示范性實施方式中，藥物制劑是單位劑型。在此類劑型中，該制劑再分成單位劑量，其中含有合適量的活性成分。單位劑型可以是包裝的制劑，例如小瓶或安瓿中的包裝片劑、膠囊和粉末。單位劑型還可以是膠囊、扁囊劑或片劑本身，或者其可以是適當數量的任何這些包裝形式。
本領域技術人員己知制備含有一定量活性成分的各種藥物組合物的方法。制備藥物組合物的方法的例子可參見通過《雷明頓：藥學科學和實踐》(Remington：The Science and Practice of Pharmacy).Lippincott，Williams和Wilkins，第21版.(2005)，其在此全文引用作為參考。
具體實施方式
下面通過具體的實施例/實驗例進一步說明本發明，但是，應當理解為，這些實施例和實驗例僅僅是用于更詳細具體地說明之用，而不應理解為用于以任何形式限制本發明。
本發明對試驗中所使用到的材料以及試驗方法進行一般性和/或具體的描述。雖然為實現本發明目的所使用的許多材料和操作方法是本領域公知的，但是本發明仍然在此作盡可能詳細描述。本領域技術人員清楚，在下文中，如果未特別說明，本發明所用材料和操作方法是本領域公知的。
一、原料藥合成例部分
實施例1：5,6-環氧-4-羥基-3-水楊酰氨基-2-環己烯酮(DHM2EQ)的制備
步驟1：N-(2-乙酰氧基苯甲酰基)-2,5-二甲氧基苯胺的合成
使2,5-二甲氧基苯胺(10.0g，65.3mmol)溶于吡啶(100ml)中。在冰冷卻下，在其中添加O-乙酰基水楊酰氯(13.0g，65.3mmol)的乙酸乙酯(50ml)溶液，歷時15分鐘，然后在相同溫度下攪拌15分鐘。在反應液中加入水(10ml)使反應停止后，添加乙酸乙酯(500ml)，再依次用3當量鹽酸(500ml)、水(500ml)、2％碳酸氫鈉水溶液(500ml)和水(500ml)洗滌。乙酸乙酯層用芒硝干燥后，減壓濃縮并真空干燥，獲得呈淡黃色糖漿狀的標題化合物(19.8g)。不對該化合物進行精制直接用于以下步驟。經過分離用薄層色譜法精制的標題化合物，其紅外吸收光譜、紫外吸收光譜、FAB質譜、和1H-NMR光譜數據CN1368954A之實施例1的數據相同。
步驟2：3-(O-乙酰基水楊酰氨基)-4,4-二甲氧基-2,5-環己二烯酮的合成
使步驟1獲得的N-(2-乙酰氧基苯甲酰基)-2,5-二甲氧基苯胺(19.8g)溶于甲醇(400ml)中。在冰冷卻下，在其中添加二乙酰氧基碘苯(27.3g，84.9mmol)，室溫攪拌1小時。在減壓濃縮反應液而獲得的茶色糖漿狀殘渣中添加乙酸乙酯(1L)，反應液依次用5％碳酸氫鈉水溶液(1L)、10％食鹽水(1L)洗滌。然后將乙酸乙酯層減壓濃縮，用硅膠柱色譜法(1kg，己烷/乙酸乙酯＝2/1)對所得茶色糖漿狀殘渣進行精制，獲得12.6g固狀物。將其懸浮于30ml甲醇中，攪拌洗滌，獲得10.3g為白色固體的標題化合物，其紅外吸收光譜、紫外吸收光譜、FAB質譜、和1H-NMR光譜數據CN1368954A之實施例2的數據相同。
步驟3：5,6-環氧-4,4-二甲氧基-3-水楊酰氨基-2-環己烯酮的合成
使3-(O-乙酰基水楊酰氨基)-4,4-二甲氧基-2,5-環己二烯酮(10.9g，33.0mmol)溶于二甲基甲酰胺(200ml)中；
在冰冷卻下，向其中添加264mmol過氧化氫(以30％過氧化氫水溶液形式加入)及1mol/L的碳酸鈉(165ml)，在相同溫度下攪拌反應2小時；
向反應液中添加乙酸乙酯(500ml)，依次用1當量的鹽酸(300ml)、10％硫代硫酸鈉水溶液(300ml×2)、10％食鹽水(300ml)洗滌后，乙酸乙酯層用芒硝干燥，然后真空干燥，獲得呈淡黃色固體粉末；
使干燥所得淡黃色固體粉末溶解于丙酮-石油醚(二者體積比為10：1)的混合溶劑中，加入等體積的飽和食鹽水萃取3次，棄水層，有機層用芒硝干燥，減壓濃縮，真空干燥，獲得式(4)表示的白色粉末狀的5,6-環氧-4,4-二烷氧基-3-水楊酰氨基-2-環己烯酮(本步驟的收率為76％，HPLC純度為97.3％)。所得式(4)化合物的熔點、紅外吸收光譜、紫外吸收光譜、FAB質譜、和1H-NMR光譜數據CN1368954A之實施例3的數據相同。
上述HPLC法的色譜條件為：十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-0.12％冰乙酸(90：410)用三乙胺調節pH值至3.0±0.2為流動相；檢測波長為225nm。本HPLC法還可用于其它步驟的產物的純度檢測。
在本發明的補充試驗中，重復CN1368954A之實施例3的方法，結果：該方法的收率為54％，HPLC純度為88.7％。
步驟4：5,6-環氧-2-水楊酰氨基-2-環己烯-1,4-二酮的合成
使5,6-環氧-4,4-二甲氧基-3-水楊酰氨基-2-環己烯酮(1.0g，3.27mmol)溶于25ml二氯甲烷中。在冰冷卻下，在其中添加三氟化硼乙醚絡合物(1ml)，于相同溫度下攪拌30分鐘。然后，在反應液中添加乙酸乙酯(300ml)，用水(200ml)洗滌。乙酸乙酯層用芒硝干燥后，真空干燥，用甲醇(5ml)對所得茶色固狀物進行洗滌，獲得呈淡茶色固體的標題化合物(404mg)，其紅外吸收光譜、紫外吸收光譜、FAB質譜、和1H-NMR光譜數據CN1368954A之實施例4的數據相同。
步驟5：5,6-環氧-4-羥基-3-水楊酰氨基-2-環己烯酮(DHM2EQ)的合成
使5,6-環氧-2-水楊酰氨基-2-環己烯-1,4-二酮(81.8mg，0.316mmol)懸浮于甲醇(10ml)中。在冰冷卻下，在其中添加硼氫化鈉(11.9mg，0.316mmol)，相同溫度下攪拌10分鐘。然后，在反應液中加入乙酸乙酯(50ml)，反應液依次用1當量的鹽酸(50ml)和水(50ml)洗滌。乙酸乙酯層用芒硝干燥后，減壓濃縮，使所得淡茶色固體懸浮于甲醇(1ml)中，攪拌洗滌。獲得呈白色固體的DHM2EQ(45.7mg)，其外觀及性質、熔點、TLC的Rf值、紅外吸收光譜、紫外吸收光譜、FAB質譜、和1H-NMR光譜數據CN1368954A之實施例5的數據相同。
實施例2：5,6-環氧-4,4-二甲氧基-3-水楊酰氨基-2-環己烯酮的合成
使3-(O-乙酰基水楊酰氨基)-4,4-二甲氧基-2,5-環己二烯酮(10.9g，33.0mmol)溶于二甲基甲酰胺(200ml)中；在冰冷卻下，向其中添加396mmol過氧化氫(以30％過氧化氫水溶液形式加入)及1mol/L的碳酸鈉(165ml)，在相同溫度下攪拌反應2小時；
向反應液中添加乙酸乙酯(500ml)，依次用1當量的鹽酸(300ml)、10％硫代硫酸鈉水溶液(300ml×2)、10％食鹽水(300ml)洗滌后，乙酸乙酯層用芒硝干燥，然后真空干燥，獲得呈淡黃色固體粉末；
使干燥所得淡黃色固體粉末溶解于丙酮-石油醚(二者體積比為6∶1)的混合溶劑中，加入等體積的飽和食鹽水萃取1次，棄水層，有機層用芒硝干燥，減壓濃縮，真空干燥，獲得式(4)表示的白色粉末狀的5,6-環氧-4,4-二烷氧基-3-水楊酰氨基-2-環己烯酮(本步驟的收率為79％，HPLC純度為96.1％)。所得式(4)化合物的熔點、紅外吸收光譜、紫外吸收光譜、FAB質譜、和1H-NMR光譜數據CN1368954A之實施例3的數據相同。進一步地，參照實施例1步驟4、步驟5的方法，制備DHM2EQ。
實施例3：5,6-環氧-4,4-二甲氧基-3-水楊酰氨基-2-環己烯酮的合成
使3-(O-乙酰基水楊酰氨基)-4,4-二甲氧基-2,5-環己二烯酮(10.9g，33.0mmol)溶于二甲基甲酰胺(200ml)中；在冰冷卻下，向其中添加330mmol過氧化氫(以30％過氧化氫水溶液形式加入)及1mol/L的碳酸鈉(165ml)，在相同溫度下攪拌反應2小時；
向反應液中添加乙酸乙酯(500ml)，依次用1當量的鹽酸(300ml)、10％硫代硫酸鈉水溶液(300ml×2)、10％食鹽水(300ml)洗滌后，乙酸乙酯層用芒硝干燥，然后真空干燥，獲得呈淡黃色固體粉末；
使干燥所得淡黃色固體粉末溶解于丙酮-石油醚(二者體積比為8∶1)的混合溶劑中，加入等體積的飽和食鹽水萃取2次，棄水層，有機層用芒硝干燥，減壓濃縮，真空干燥，獲得式(4)表示的白色粉末狀的5,6-環氧-4,4-二烷氧基-3-水楊酰氨基-2-環己烯酮(本步驟的收率為81％，HPLC純度為95.8％)。所得式(4)化合物的熔點、紅外吸收光譜、紫外吸收光譜、FAB質譜、和1H-NMR光譜數據CN1368954A之實施例3的數據相同。進一步地，參照實施例1步驟4、步驟5的方法，制備DHM2EQ。
二、組合物制備例部分
組合物例1：
使用實施例1所得DHMEQ為原料藥，使用凡士林與其充分混合制備得到藥物濃度為1％(w/w)的軟膏劑組合物。
組合物例2：
使用實施例2所得DHMEQ為原料藥，使用凡士林與其充分混合制備得到藥物濃度為0.5％(w/w)的軟膏劑組合物。
組合物例3：
使用實施例3所得DHMEQ為原料藥，使用凡士林與其充分混合制備得到藥物濃度為2.5％(w/w)的軟膏劑組合物。
三、質量分析方法(測定軟膏劑組合物中活性成分的含量)
分析例1：
使用組合物例1所得軟膏劑為測試樣品。
1、流動相的制備：乙腈為流動相A，0.05％(ml/ml)磷酸為流動相B，用微孔濾膜濾過。
2、溶劑的制備：取色譜純的二甲基亞砜1000ml、磷酸0.5g，混勻，用微孔濾膜濾過。
3、對照品溶液的制備：取DHMEQ對照品10mg，精密稱定，置于50ml量瓶中，加溶劑定量溶解制成每1ml含有DHMEQ為0.2mg的對照品溶液。
4、供試品溶液的制：取DHMEQ軟膏適量(含DHMEQ量相當于10mg)，精密稱定，置50ml比色管中，精密加入溶劑適量，加玻璃珠適量，充分振搖使DHMEQ溶解，濾過，作為供試品溶液。
5、供試品中DHMEQ含量的測定：分別精密量取上述對照品溶液和供試品溶液各20μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖；按外標法以峰面積計算每1g的DHMEQ軟膏中DHMEQ的量，并與制備軟膏劑時理論投料量(藥物在軟膏劑中的理論濃度)計算活性成分在組合物中的百分含量。
6、重復性試驗結果
同法制備6份供試品溶液，按上述方法進行含量測定，結果如下表：
重復性試驗結果表
結果表明，重復性試驗結果的相對標準偏差(RSD)不大于2.0％，方法的精密度良好。
7、回收率試驗結果
以80％、100％、120％濃度水平分別制備各3份供試品溶液，按上述方法進行含量測定，進行回收率的計算。結果如下表：
結果表明，各濃度項下的平均回收率均在98.0％～102.0％，且相對標準偏差(RSD)不大于2.0％，準確度良好。
分析例2：
參照分析例1，對組合物例2所得軟膏劑進行質量分析。
在步驟6的重復性試驗中，組合物例2軟膏劑6次測定含量均在99.4～100.2％范圍內，含量平均值為99.7％，RSD為0.3％。
在步驟7的回收率試驗中，組合物例2軟膏劑三種濃度水平的平均回收率(％)值在99.4～99.6％范圍內，RSD為0.4％。
分析例3：
參照分析例1，對組合物例3所得軟膏劑進行質量分析。
在步驟6的重復性試驗中，組合物例3軟膏劑6次測定含量均在99.7～100.5％范圍內，含量平均值為100.3％，RSD為0.4％。
在步驟7的回收率試驗中，組合物例3軟膏劑三種濃度水平的平均回收率(％)值在99.6～99.7％范圍內，RSD為0.2％。
無需進一步描述，本領域普通技術人員相信采用以上描述和以下示范性實施例可制備和利用本發明化合物并實施本發明方法。雖然參考各種具體的材料、方法和實施例描述和說明了本發明，但應該知道本發明不限于為該目的而選擇的材料和方法的特定組合。本領域技術人員應知道此類細節提示有多種變化。本申請通篇引用的所有專利、專利申請和其它參考文獻通過引用全文納入本文。