本發(fā)明涉及煙草代謝組學(xué)研究中液相色譜保留指數(shù)的建立及其在化合物定性方面的應(yīng)用,具體是建立標(biāo)準(zhǔn)色譜分析條件和標(biāo)記物的保留指數(shù),輔助解決復(fù)雜樣品組分的定性分析。
背景技術(shù):
:煙草代謝組學(xué)研究中,最首要的任務(wù)就是對(duì)化合物進(jìn)行準(zhǔn)確定性。過(guò)去常利用保留時(shí)間與已知物質(zhì)比較,一般采用一種純品來(lái)鑒定一種化合物,且條件完全一致,這樣色譜峰的保留時(shí)間對(duì)上了就可能是同一種物質(zhì)。但這種方法有一個(gè)致命缺陷,需要對(duì)樣品的成分已知或合理猜測(cè),且能夠提供純品,如果是探索性研究或純品很難獲得,定性就很難進(jìn)行。且需要多次同條件實(shí)驗(yàn),過(guò)程繁瑣、成本較高。后來(lái)出現(xiàn)高分辨質(zhì)譜輔助定性,如LC-QTOF,根據(jù)獲得的高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)定性,但事實(shí)證明這種方法的可靠性有待提高,尤其是復(fù)雜未知組分的分析,因此有研究者將保留指數(shù)RI引入到氣相色譜的方法中,使定性的準(zhǔn)確性和唯一性大大提高。其作用是在定性中減少甚至消除實(shí)驗(yàn)條件的干擾,如色譜柱、溫度、壓力等。然而截止目前,保留指數(shù)在液相色譜中的應(yīng)用還未見(jiàn)報(bào)道。鑒于液相色譜相比氣相色譜,具有以下優(yōu)勢(shì):1)氣相色譜不適用于不揮發(fā)物質(zhì)和熱不穩(wěn)定物質(zhì),而液相色譜不受樣品的揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制。2)對(duì)于很難分離的樣品,液相色譜常比氣相色譜容易完成分離。因此,迫切需要建立液相色譜的保留指數(shù),并輔助復(fù)雜樣品組分的定性分析。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:本發(fā)明的目的正是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中缺乏液相色譜保留指數(shù)輔助定性的問(wèn)題,而提供一種標(biāo)準(zhǔn)色譜分析條件和標(biāo)記物的保留指數(shù),輔助解決復(fù)雜樣品組分的定性分析。本發(fā)明的目的是通過(guò)下述技術(shù)措施來(lái)實(shí)現(xiàn):本發(fā)明的液相色譜保留指數(shù)的建立及其在化合物定性方面的應(yīng)用是在液相色譜中引入保留指數(shù)的概念,并通過(guò)氘代標(biāo)記物實(shí)現(xiàn)待測(cè)化合物保留時(shí)間的校正,使定性的準(zhǔn)確性和唯一性大大提高;具體步驟如下:a、配制保留指數(shù)標(biāo)記物的混合溶液;b、在標(biāo)準(zhǔn)色譜條件下,LC-MS/MS進(jìn)行標(biāo)記物的檢測(cè)并確定其保留指數(shù)值;c、對(duì)新鮮煙葉液氮速凍,冷凍干燥并粉碎;d、稱取40~80mg粉碎好的煙葉,在粉碎好的樣品中加入10~20μL保留指數(shù)標(biāo)記物,之后加入提取溶劑0.75~1.5mL,低溫超聲提??;保留指數(shù)標(biāo)記物的最終濃度為10ngmL-1;e、冷凍離心,取上清液并過(guò)濾;f、LC-MS/MS檢測(cè)上述上清液,并對(duì)溶液中所含化合物進(jìn)行定性分析;g、液相色譜、質(zhì)譜條件如下:Waters公司BEH-C18超高壓柱,規(guī)格2.1mm×100mmi.d.,1.7μm;柱溫:40℃;正離子模式流動(dòng)相為:A:含0.1%甲酸的水,B:含0.1%甲酸的甲醇;流速:0.35mLmin-1;梯度洗脫:0min:5%B,10min~12min:98%B,12.1min~15min:5%B;進(jìn)樣量:5μL;正離子模式:電噴霧離子源;掃描方式:正離子掃描;監(jiān)測(cè)方式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè);干燥氣溫度:180℃;干燥氣流速:11Lmin-1;霧化器壓力:20psi;鞘氣溫度:400℃;鞘氣流速:12Lmin-1;毛細(xì)管電壓:3200V;噴嘴電壓:0V;駐留時(shí)間:50ms。本發(fā)明中所述提取溶劑是濃度為80%的甲醇;且所述提取溶劑中化合物組分的定性需滿足以下三個(gè)條件:1)保留指數(shù)相差75,即保留時(shí)間相差<5s;2)母離子相差<0.2m/z;3)二級(jí)質(zhì)譜MS/MS匹配得分>80。本發(fā)明中所述的保留指數(shù)標(biāo)記物為10個(gè)氘代化合物,且其保留時(shí)間分布均勻(化合物名稱如表1所示);所述的保留指數(shù)標(biāo)記物的保留指數(shù)的換算方法為1秒換算為RI15,根據(jù)實(shí)驗(yàn)所測(cè)保留時(shí)間進(jìn)行換算。更具體說(shuō):在標(biāo)準(zhǔn)色譜分析條件下,測(cè)定氘代標(biāo)記物的保留時(shí)間,并設(shè)定其保留指數(shù)(1秒換算為RI15),正離子模式下保留指數(shù)標(biāo)記物為10個(gè)(表1),其它組分的保留值用相鄰兩個(gè)組分的保留指數(shù)標(biāo)記物來(lái)標(biāo)定。其計(jì)算公式如下:RI(x)=RI(z)+[RI(z+1)-RI(z)]×[Rt(x)-Rt(z)]/[Rt(z+1)-Rt(z)],式中Z和Z+1分別為目標(biāo)化合物(X)流出前后的保留指數(shù)標(biāo)記物(表1)的流出時(shí)間(Rt)和保留指數(shù)(RI)。這里Rt(z)<Rt(x)<Rt(z+1)。表1保留指數(shù)標(biāo)記物的定性離子對(duì)及保留指數(shù)復(fù)雜樣品中組分進(jìn)行定性分析時(shí)需滿足以下三個(gè)條件:1)保留指數(shù)相差75(即保留時(shí)間相差5s)以下;2)母離子相差0.2m/z以下;3)二級(jí)質(zhì)譜MS/MS匹配得分高于80。例如山奈酚的保留時(shí)間為7.683min,在系列保留指數(shù)標(biāo)記物中,保留時(shí)間與山奈酚最接近但比其小的為Cl-苯丙氨酸(6.898min),保留時(shí)間與山奈酚最接近但比其大的為D5-吲哚乙酸(7.729min)??梢岳斫鉃樯侥畏拥某龇鍟r(shí)間介于Cl-苯丙氨酸和D5-吲哚乙酸之間,則山奈酚的保留指數(shù)為RI=6915,從保留指數(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)化合物保留時(shí)間的校正,避免了流動(dòng)相﹑壓力或使用批號(hào)不同的色譜柱所帶來(lái)的保留時(shí)間的變化。本發(fā)明的有益效果如下:本發(fā)明研究人員利用保留指數(shù)標(biāo)記物對(duì)新鮮煙葉樣品中的代謝物的保留時(shí)間進(jìn)行校正,可輔助未知代謝物的準(zhǔn)確定性,具有以下特點(diǎn):1)減少甚至消除實(shí)驗(yàn)條件(如色譜柱、溫度、升溫條件、壓力等)的干擾,相比之前的外標(biāo)法、峰高增量法等,實(shí)驗(yàn)量大大減少,鑒定可靠性也得到提高;2)重現(xiàn)性好,標(biāo)準(zhǔn)物統(tǒng)一,操作簡(jiǎn)單快速。附圖說(shuō)明圖1為本發(fā)明工藝流程圖。圖2為正離子模式下保留指數(shù)標(biāo)記物的TIC圖。圖3為紅花大金元新鮮煙葉的總離子流TIC圖。圖4為K326新鮮煙葉的總離子流TIC圖。具體實(shí)施方式本發(fā)明以下將結(jié)合實(shí)施例作進(jìn)一步描述(參見(jiàn)圖1、圖2):本發(fā)明的液相色譜、質(zhì)譜條件如下:Waters公司BEH-C18超高壓柱,規(guī)格2.1mm×100mmi.d.,1.7μm;柱溫:40℃;正離子模式流動(dòng)相為:A:含0.1%甲酸的水,B:含0.1%甲酸的甲醇;流速:0.35mLmin-1;梯度洗脫:0min:5%B,10min~12min:98%B,12.1min~15min:5%B;進(jìn)樣量:5μL;正離子模式:電噴霧離子源;掃描方式:正離子掃描;監(jiān)測(cè)方式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè);干燥氣溫度:180℃;干燥氣流速:11Lmin-1;霧化器壓力:20psi;鞘氣溫度:400℃;鞘氣流速:12Lmin-1;毛細(xì)管電壓:3200V;噴嘴電壓:0V;駐留時(shí)間:50ms。本發(fā)明中所述提取溶劑是濃度為80%的甲醇。且所述提取溶劑中化合物組分的定性需滿足以下三個(gè)條件:1)保留指數(shù)相差75,即保留時(shí)間相差<5s;2)母離子相差<0.2m/z;3)二級(jí)質(zhì)譜MS/MS匹配得分>80。本發(fā)明中所述的保留指數(shù)標(biāo)記物為10個(gè)氘代化合物,且其保留時(shí)間分布均勻(化合物名稱如表1所示);所述的保留指數(shù)標(biāo)記物的保留指數(shù)的換算方法為1秒換算為RI15,根據(jù)實(shí)驗(yàn)所測(cè)保留時(shí)間進(jìn)行換算。更具體說(shuō):在標(biāo)準(zhǔn)色譜分析條件下,測(cè)定氘代標(biāo)記物的保留時(shí)間,并設(shè)定其保留指數(shù)(1秒換算為RI15),正離子模式下保留指數(shù)標(biāo)記物為10個(gè)(表1),其它組分的保留值用相鄰兩個(gè)組分的保留指數(shù)標(biāo)記物來(lái)標(biāo)定。其計(jì)算公式如下:RI(x)=RI(z)+[RI(z+1)-RI(z)]×[Rt(x)-Rt(z)]/[Rt(z+1)-Rt(z)],式中Z和Z+1分別為目標(biāo)化合物(X)流出前后的保留指數(shù)標(biāo)記物(表1)的流出時(shí)間(Rt)和保留指數(shù)(RI)。這里Rt(z)<Rt(x)<Rt(z+1)。以下不再贅述。實(shí)施例1:首先配制保留指數(shù)標(biāo)記物的混合溶液,在標(biāo)準(zhǔn)色譜條件下LC-MS/MS進(jìn)行標(biāo)記物的檢測(cè)并確定其保留指數(shù)值;對(duì)新鮮煙葉液氮速凍,冷凍干燥并粉碎。稱取45~50mg凍干處理的新鮮煙葉(云南大理種植的紅花大金元)于玻璃試管中,加入1mL提取溶劑(提前加入保留指數(shù)標(biāo)記物)于玻璃管中,保留指數(shù)標(biāo)記物的濃度為10ngmL-1,加蓋密封后置于超聲波清洗機(jī)內(nèi),在冰浴下超聲抽提30min,超聲功率為100Hz,然后在8000rpm的轉(zhuǎn)速下離心5min,取上清液并過(guò)濾,進(jìn)行LC-MS/MS分析,所得的總離子流TIC如圖3所示,部分代謝物的名稱、母離子、子離子、碰撞能量及校正保留指數(shù)如表2所示。表2部分代謝物的名稱、母離子、子離子、碰撞能量及校正保留指數(shù)代謝物名稱母離子子離子碰撞能量保留時(shí)間校正保留指數(shù)Histidine156110400.786707.4Phenylalanine166120402.4472202.3Leucine13286201.7371563.3Glutamine14784401.3621225.8Oleamide2822652011.34110206.9Adenosine268136401.6581492.2Asparagine13374200.826743.4Lysine14784400.707636.3Tryptophan205188203.3092978.1Palmiticacid25757209.9028911.8Glutamicacid14884200.798718.2實(shí)施例2:首先配制保留指數(shù)標(biāo)記物的混合溶液,在標(biāo)準(zhǔn)色譜條件下LC-MS/MS進(jìn)行標(biāo)記物的檢測(cè)并確定其保留指數(shù)值;對(duì)新鮮煙葉液氮速凍,冷凍干燥并粉碎。稱取45~50mg凍干處理的新鮮煙葉(貴州遵義種植的K326)于玻璃試管中,加入1mL提取溶劑(提前加入保留指數(shù)標(biāo)記物)于玻璃管中,保留指數(shù)標(biāo)記物的濃度為10ngmL-1,加蓋密封后置于超聲波清洗機(jī)內(nèi),在冰浴下超聲抽提30min,超聲功率為100Hz,然后在8000rpm的轉(zhuǎn)速下離心5min,取上清液并過(guò)濾,進(jìn)行LC-MS/MS分析,所得的總離子流TIC如圖4所示,部分代謝物的名稱、母離子、子離子、碰撞能量及校正保留指數(shù)如表3所示。表3部分代謝物的名稱、母離子、子離子、碰撞能量及校正保留指數(shù)代謝物名稱母離子子離子碰撞能量保留時(shí)間校正保留指數(shù)Quinicacid193111100.854768.6Ferulicacid19517755.2584732.2Scopolin355193103.2882959.2Caffeicacid18116354.2283805.2Kaempferol287153307.6836914.7Neochlorogenicacid354163154.5324078.8Proline11670400.874786.6Quercetin303229257.0346330.6Cysteine12210550.873785.7Delphinidinchloride303257245.8295246.1Rutin611303135.8195237.1當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3