本發明屬于醫療檢測領域，具體涉及一種用于檢測腫瘤型M2丙酮酸激酶的化學發光免疫試劑盒及其制備方法。
背景技術：
：據報道，惡性腫瘤發病率和死亡率呈逐年上升趨勢。降低惡性腫瘤死亡率的主要途徑是早期診斷和早期治療。目前，腫瘤診斷主要依賴影像學檢查，細胞學、生化學和免疫學檢驗。后者為主要檢查血清腫瘤標志物(tumormarker，TM)，由于TM的敏感性和特異性相對較高，較為經濟，檢查時痛苦少，且適合大批量標本檢測，TM的臨床應用受到了廣泛的關注。丙酮酸激酶(PK)是糖酵解途徑的一個關鍵酶，它有四種同工酶，分別為L型、R型、Ml型和M2型，它們的分布具有相對的組織特異性，通常均以酶的活性四聚體形式存在。目前研究表明，幾乎所有不同組織來源的腫瘤均伴有丙酮酸激酶的異構重整體M2-PK的過度表達,故稱為腫瘤型M2-PK(TumorM2-PK，TUM2-PK)。在正常細胞中，M2-PK主要以三聚體的形式存在，而在腫瘤細胞中，M2-PK大量表達并轉變為主要以二聚體的形式存在。三聚體的M2-PK與磷酸烯醇丙酮酸pep親和力很高，而二聚體的M2-PK與pep的親和力則低的多，后者因此導致磷酸烯醇類物質的堆積，這有利于腫瘤細胞進行無氧糖酵解。TUM2-PK的升高可見于大多數癌癥患者。盡管不同組織來源的腫瘤或同種腫瘤的不同階段，其血中M2-PK的平均水平存在著一定的差別，但作為腫瘤標志物，M2-PK是很有應用價值的。尤其是腎癌，長期以來一直未發現較特異的腫瘤標志物,M2-PK很可能成為目前唯一可用于臨床診斷腎癌的生化指標。早在1993年，在hamburg召開的(德國)第七界腫瘤標志物研討會上，TUM2-PK就作為一種新的腫瘤標志物被提了出來。因此，監測血液中腫瘤M2型丙酮酸激酶(TUM2-PK)可廣泛應用于腫瘤的早期診斷、腫瘤預后判斷以及評價腫瘤治療療效等方面。技術實現要素：本發明的一個目的是提供一種腫瘤型M2丙酮酸激酶(TUM2-PK)的定量測定試劑盒，其包含的試劑有TUM2-PK磁分離試劑，酶標記的TUM2-PK抗體溶液，標準品，洗滌液以及化學發光底物溶液。.所述TUM2-PK磁分離試劑為含有1mg/ml的偶聯有抗TUM2-PK單克隆抗體的磁性微球，0.3mg/ml的十八烷基三甲基氯化銨，0.1mg/ml的吐溫20，0.1mg/ml的PEG200的70mmol/L的PBS緩沖液，pH值為8.0。所述酶標記的TUM2-PK抗體溶液是含有1mg/ml辣根過氧化酶標記的抗TUM2-PK單克隆抗體和1mg/mlBSA的50mmol/L的PBS緩沖液，pH值為8.0。所述的標準品為不同濃度的TUM2-PK標準品溶液，其分別含有0、0.5、1、2、4、8、16、32和64U/ml的TUM2-PK標準品的50mmol/lPBS緩沖液，pH7.4。洗滌液由在濃度為20mol/L、pH為7.4的磷酸鹽緩沖液中加入1％的Tween-20配制而成。所述化學發光底物溶液分為發光底物A溶液和發光底物B溶液；發光底物A為0.1M、pH值為8.5的Tris-HCl緩沖液，且該緩沖液中含有終濃度為5.0mg/mL的魯米諾，所述發光底物B為是pH值為4.5的0.1M檸檬酸緩沖液，且該緩沖液中含有終濃度為100mg/mL的過氧化氫和15mg/mL辣根過氧化氫酶。本發明的另一個目的是提供所述試劑盒的制備方法，具體步驟如下：1)TUM2-PK磁分離試劑的制備：采用化學交聯法將TUM2-PK單克隆抗體和磁性微球偶聯，磁性微球直徑在1.0μm左右，制備后用PBS緩沖液沖洗三次，然后用70mmol/L的PBS緩沖液重新懸浮，加入終濃度0.3mg/ml的十八烷基三甲基氯化銨、0.1mg/ml的吐溫20和0.1mg/ml的PEG200，調pH值至8.0即得；2)酶標記的TUM2-PK抗體溶液的制備：采用NaIO4法標記TUM2-PK單克隆抗體，反應后透析純化，然后用20mmol/L的PBS緩沖液溶解，加入終濃度0.5mg/ml酪蛋白，調pH值至8.0即得；3)常規方法配置標準品、洗滌液和化學底物溶液。在目前的TUM2-PK磁性微球相關免疫檢測試劑盒中，穩定性是一個普遍存在的技術問題，導致相關試劑盒即使在4℃下保存期限也僅有九個月左右，而導致試劑盒失效的主要原因是磁分離試劑的穩定性較差，本發明通過大量試驗摸索得到了一種效果極佳的磁分離試劑的穩定劑組方，從而使試劑盒的穩定性大幅提高。具體實施方式下面將進一步的來舉例說明本發明。需要指出的是，以下說明僅僅是對本發明要求保護的技術方案的舉例說明，并非對這些技術方案的任何限制。本發明的保護范圍以所附權利要求書記載的內容為準。實施例1試劑盒制備1)TUM2-PK磁分離試劑的制備：采用0.05mol/L的PBS緩沖液將聚苯乙烯磁性微球懸浮，磁性微球直徑在1.0μm左右，磁性微球的質量分數為2.5％；然后向微球溶液中添加終濃度為1mg/ml的TUM2-PK單克隆抗體(所述單克隆抗體與下述酶標記用TUM2-PK單克隆抗體為配對抗體，購自上海研晶生物科技有限公司)，搖勻10分鐘，然后向體系中加入2mg/ml碳亞二胺，搖床反應16小時，PBS緩沖液清洗兩次，磁性分離，獲得偶聯有抗TUM2-PK單克隆抗體的磁性微球，然后將偶聯有抗TUM2-PK單克隆抗體的磁性微球分散在0.3mg/ml的十八烷基三甲基氯化銨，0.1mg/ml的吐溫20，0.1mg/ml的PEG200的70mmol/L的PBS緩沖液中，調pH值為8.0，從而獲得TUM2-PK磁分離試劑。2)酶標記的TUM2-PK抗體溶液的制備：采用常規NaIO4法標記TUM2-PK單克隆抗體，反應后透析純化，然后用20mmol/L的PBS緩沖液溶解，加入終濃度1mg/mlBSA，調pH值至8.0即得；3)常規方法配置標準品、洗滌液和化學底物溶液。制備后試劑盒組成如下：TUM2-PK磁分離試劑為含有1mg/ml的偶聯有抗TUM2-PK單克隆抗體的磁性微球，0.3mg/ml的十八烷基三甲基氯化銨，0.1mg/ml的吐溫20，0.1mg/ml的PEG200的70mmol/L的PBS緩沖液，pH值為8.0。酶標記的TUM2-PK抗體溶液是含有1mg/ml辣根過氧化酶標記的抗TUM2-PK單克隆抗體和1mg/mlBSA的50mmol/L的PBS緩沖液，pH值為8.0。標準品為不同濃度的TUM2-PK標準品溶液，其分別含有0、0.5、1、2、4、8、16、32和64U/ml的TUM2-PK標準品的50mmol/lPBS緩沖液，pH7.4。洗滌液由在濃度為20mol/L、pH為7.4的磷酸鹽緩沖液中加入1％的Tween-20配制而成。所述化學發光底物溶液分為發光底物A溶液和發光底物B溶液；發光底物A為0.1M、pH值為8.5的Tris-HCl緩沖液，且該緩沖液中含有終濃度為5.0mg/mL的魯米諾，所述發光底物B為是pH值為4.5的0.1M檸檬酸緩沖液，且該緩沖液中含有終濃度為100mg/mL的過氧化氫和15mg/mL辣根過氧化氫酶。實施例2試劑盒檢測方法a.向微孔板分別加入血清樣本和TUM2-PK標準品，每孔20μl；b.依次向每孔加入酶標記的TUM2-PK抗體溶液和TUM2-PK磁分離試劑各50μl，振蕩30s后，置37℃水浴30分鐘。c.采用磁分離器，沉淀2分鐘。緩慢的倒轉分離器倒出上清液，把倒轉的微孔板連同分離器一起放在濾紙上，用力拍擊分離器底部以除去粘在管壁上的所有液滴。d.加200μl洗滌液至每孔中，振蕩混勻30s，磁分離去洗滌液，重復三次。e.加發光底物A、B每孔各50μl，充分混勻，立刻加入化學發光儀中檢測信號值。實施例3TUM2-PK磁分離試劑的穩定性考察采用不同的溶液組成的磁分離試劑，在37℃下以60轉/分鐘搖動放置一個月，采用實施例2的方法測定TUM2-PK標準品(濃度5U/ml)，其他檢測試劑同實施例1，計算不同放置時間測定的化學信號值與0天時測定的化學信號值的百分比。各組磁分離試劑組成如下：組1：同實施例1組2：TUM2-PK磁分離試劑為含有1mg/ml的偶聯有抗TUM2-PK單克隆抗體的磁性微球，0.2mg/ml的吐溫20，0.3mg/ml的PEG200的70mmol/L的PBS緩沖液，pH值為8.0。組3：TUM2-PK磁分離試劑為含有1mg/ml的偶聯有抗TUM2-PK單克隆抗體的磁性微球，0.3mg/ml的十八烷基三甲基氯化銨，0.2mg/ml的PEG200的70mmol/L的PBS緩沖液，pH值為8.0。組4：TUM2-PK磁分離試劑為含有1mg/ml的偶聯有抗TUM2-PK單克隆抗體的磁性微球，0.3mg/ml的十八烷基三甲基氯化銨，0.2mg/ml的吐溫20的70mmol/L的PBS緩沖液，pH值為8.0。具體結果如下：N＝5組1組2組3組45天99.4％80.9％90.2％85.1％15天98.6％69.2％81.7％75.5％30天97.1％52.5％67.6％60.3％實施例4TUM2-PK試劑盒性能考察采用實施例1制備的TUM2-PK檢測試劑盒進行下列測定：1)分別取TUM2-PK標準品溶液，其分別含有0、0.5、1、2、4、8、16、32和64U/ml的TUM2-PK標準品；按照實施例2的方法進行測定，以化學發光值(RLU)為Y軸，以標準品濃度為x軸，繪制標準曲線；結果表明：本發明實施例1試劑盒線性良好，線性方程為y＝36537X+1762；線性系數R>0.999。2)對20次零標準品的測定，取其2倍的平均偏差，其在標準曲線上所對應的濃度即為分析靈敏度，結果表明實施例1試劑盒靈敏度為0.031U/ml實施例5實施例1試劑盒其他性能指標精密性：批內變異CV％≤3.6％；批間變異CV％≤5.2％線性系數：r≥0.9990線性范圍：0.50-64U/ml本
發明內容僅僅舉例說明了要求保護的一些具體實施方案，其中一個或更多個技術方案中所記載的技術特征可以與任意的一個或多個技術方案相組合，這些經組合而得到的技術方案也在本申請保護范圍內，就像這些經組合而得到的技術方案已經在本發明公開內容中具體記載一樣。當前第1頁1 2 3