一種同時測定動物源食品中殺線威和殺線威肟的方法與流程

本發明涉及食品殘留物的
技術領域：
，尤其涉及一種同時測定動物源食品中殺線威和殺線威肟的方法。
背景技術：
：殺線威(CAS﹟:23135-22-0)，又名草肟威，英文名Oxamyl，化學名N,N-二甲基-α-甲基氨基甲酰基氧代亞氨-α-甲硫基乙酰胺，屬于氨基甲酸酯類農藥，主要用作廣譜性殺蟲劑，兼有殺螨和殺線蟲等活性。殺線威已登記作物有柑橘、甜瓜、番茄、甜椒、黃瓜、胡蘿卜、馬鈴薯、花生和棉花等。殺線威為劇毒農藥，對人體有神經毒性。殺線威及其代謝物可殘留于農產品、食物或環境中，對人體具有潛在的健康風險。GB2763-2014規定殺線威在花生仁等食品中最大殘留限量(MRL)為0.05-2mg/kg。中國(GB2763-2014)及聯合國食品法典委員會(CAC)均定義殺線威殘留物為殺線威及其代謝物殺線威肟之和，以殺線威表示。我國已制定了果蔬、乳品等幾種食品中殺線威殘留量測定的標準，現行標準多采用LC-MS/MS法以多反應監測(MRM)方式對殺線威進行測定。SN/T0697-2014《出口肉及肉制品中殺線威殘留量的測定》采用乙腈進行提取，N-丙基乙二胺(PSA)小柱凈化。SN/T0134-2010《進出口食品中殺線威等12種氨基甲酸酯類農藥殘留量的檢測方法液相色譜-質譜/質譜法》采用乙腈進行提取，活性炭和弗羅里硅土串聯小柱凈化。SN/T3156-2012《乳及乳制品中多種氨基甲酸酯類農藥殘留量的檢測方法液相色譜-串聯質譜法》采用乙腈進行提取，C18小柱凈化。GB/T20772-2008《動物肌肉中461種農藥及相關化學品殘留量的測定液相色譜-串聯質譜法》采用乙酸乙酯-環己烷進行提取，凝膠滲透色譜凈化。然而所有現行標準中僅制定了殺線威的測定方法，并未涉及殺線威肟。專利CN105548431A《同時檢測蔬菜/水果中殺線威和殺線威肟殘留量的方法》采用乙腈進行提取及基質分散固相萃取法進行凈化，然后采用液相色譜質譜法(LC-MS/MS)以多反應監測(MRM)方式測定殺線威，以選擇性離子監測(SIM)方式測定殺線威肟。該專利方法適用于果蔬類，但基質分散固相萃取法不適用于基質復雜的動物源食品，此外SIM方式獲得的定性結果假陽性率高于MRM方式。鑒于殺線威在農業生產中的廣泛應用及其殘留毒性風險，以及我國標準(GB2763-2014)和聯合國食品法典委員會(CAC)均定義殺線威殘留物為殺線威及其代謝物殺線威肟之和，因而，建立適用于動物源食品、靈敏度高(定量限低于MRL)的殺線威與殺線威肟殘留量的測定方法十分必要。技術實現要素：有鑒于此，本發明提供了一種同時測定動物源食品中殺線威和殺線威肟的方法，有效測定動物源食品中殺線威和殺線威肟殘留量。本發明采用的技術手段如下：一種同時測定動物源食品中殺線威和殺線威肟的方法，取待測樣品制備供試品溶液，并配制基質匹配標準溶液，利用液相色譜-質譜/質譜儀測定殺線威和殺線威肟；其中色譜條件為:色譜柱:C18柱，長50mm，內徑2.1mm，填充料粒徑1.7um，柱溫:25～35℃，進樣量:2～4μL，流速：0.25～0.35mL/min，流動相梯度洗脫方式見表3：表3流動相梯度洗脫方式表3中的甲酸水溶液體積濃度為0.1％。進一步的，所述質譜條件為:電離方式：電噴霧電離，正離子掃描(ESI+)，檢測方式：多反應監測(MRM)，電噴霧電壓(IS):4950～5050V，離子源溫度(TEM):500～600℃，碰撞氣(CAD)：medium，氣簾氣壓力(CUR)：25psi，霧化器(GS1)：55psi，輔助加熱器(GS2)：55psi。進一步的，所述多反應監測(MRM)的條件見表4:表4多反應監測的條件表4中帶*的離子為定量離子。進一步的，配制所述供試品溶液的步驟為：(1)制樣：取待檢測的樣品，切成小塊，搗碎混勻，制成勻漿；(2)提取：稱取步驟(1)的樣品至離心管中，加入乙腈、無水硫酸鈉進行勻漿，再用乙腈洗滌刀頭，獲得勻漿后混合物和洗滌液；將勻漿后混合物進行第一次離心，收集第一次上清液至蒸餾瓶，并于剩下的殘留物中加入洗滌刀頭的洗滌液，渦旋提取，并進行第二次離心，收集第二次上清液，合并兩次上清液至蒸餾瓶，旋轉蒸發至近干；加甲醇-二氯甲烷溶液至蒸餾瓶中，渦旋溶解殘留物，待凈化；(3)凈化：用甲醇-二氯甲烷溶液淋洗活化乙二胺-N-丙基小柱，棄去淋洗液；將步驟(2)中待凈化的樣品溶液加到小柱中過柱，用甲醇-二氯甲烷溶液潤洗殘留有樣品溶液的蒸餾瓶并將潤洗液過柱，用干凈的用蒸餾瓶收集所有流出的樣品溶液和洗脫液，旋轉蒸發至蒸干；加入甲醇-水溶液，渦旋溶解殘渣；將混合溶液轉移至離心管中，離心后過濾至樣品瓶中，供測定。進一步的，配制所述基質匹配標準溶液的步驟為：稱取殺線威、殺線威肟標準品，分別用甲醇溶解定容至不同的容量瓶，得到單標儲備溶液；取各單標儲備溶液至同一容量瓶中，用甲醇進行稀釋，得到中間標準混合溶液；用甲醇對中間標準混合溶液進行稀釋，以甲醇-水溶液為溶劑配制成系列濃度的標準工作液；稱取不含有殺線威與殺線威肟的樣品，進行制樣、提取與凈化，旋轉蒸發至蒸干，分別加入各濃度的標準工作液，渦旋充分溶解殘渣；將各混合溶液轉移至不同的離心管中，離心后過濾至樣品瓶中，得到系列濃度的基質匹配標準溶液。進一步的，所述柱溫為30℃，所述進樣量為3μL，所述流速為0.30mL/min。進一步的，所述電噴霧電壓為5000V，所述離子源溫度為550℃。進一步的，所述提取步驟(2)中具體操作為：稱取制得的樣品5g至50mL離心管中，加入20mL乙腈和5g無水硫酸鈉，以15000rpm進行勻漿2min，再用10mL乙腈洗滌刀頭1min，獲得勻漿后混合物和洗滌液；將勻漿后混合物于4000rpm進行第一次離心10min，收集第一次上清液至蒸餾瓶，并于剩下的殘留物中加入洗滌刀頭的洗滌液，渦旋提取2min，并以4000rpm進行第二次離心10min，收集第二次上清液，合并兩次上清液至100mL蒸餾瓶，于40℃旋轉蒸發至近干；加3mL體積比為5：95的甲醇-二氯甲烷至蒸餾瓶中，渦旋溶解殘留物，待凈化。進一步的，所述凈化步驟(3)中具體操作為：用5mL體積比為5：95的甲醇-二氯甲烷淋洗活化乙二胺-N-丙基小柱，棄去淋洗液；將步驟(2)中待凈化的樣品溶液加到小柱中過柱，分別用4mL體積比為5：95的甲醇-二氯甲烷潤洗殘留有樣品溶液的蒸餾瓶兩次，并將兩次潤洗液過柱，控制流速不超過1mL/min；用干凈的蒸餾瓶收集所有流出的樣品溶液和洗脫液，于35℃旋轉蒸發至蒸干；加入1mL體積比為20：80的甲醇-水溶液，渦旋，溶解殘渣；將混合溶液轉移至1mL離心管中，于4℃以13000rpm離心10min，取上清液過0.22μm濾膜至樣品瓶中，供測定。進一步的，配制所述基質匹配標準溶液的具體步驟為：稱取殺線威、殺線威肟標準品各0.01g，分別用甲醇溶解定容至不同的10mL容量瓶，得到殺線威、殺線威肟的濃度均為1.0mg/mL的單標儲備溶液；取各單標儲備溶液至同一容量瓶中，用甲醇進行稀釋，配制為殺線威、殺線威肟的濃度均為10μg/mL的中間標準混合溶液；用甲醇對中間標準混合溶液進行稀釋，再以體積比為20：80的甲醇-水溶液為溶劑配制成5ng/mL、10ng/mL、25ng/mL、50ng/mL和100ng/mL的標準工作液；稱取不含有殺線威與殺線威肟的樣品5份，進行制樣、提取與凈化，于35℃旋轉蒸發至蒸干，分別加入不同濃度的標準工作液各1mL，渦旋充分溶解殘渣；將各混合溶液轉移至不同的離心管中，于4℃以13000rpm離心10min，取上清液過0.22μm濾膜至樣品瓶中，得到5ng/mL、10ng/mL、25ng/mL、50ng/mL和100ng/mL的基質匹配標準溶液。本發明的有益效果：本發明提供了一種同時測定動物源食品中殺線威和殺線威肟的方法，而且本發明首次報道用液相色譜-串聯質譜法MRM方式測定殺線威肟。針對基質復雜的動物源樣品，采用乙腈對動物源樣品進行提取及固相萃取小柱凈化提取物，并利用低溫高速離心去除小顆粒雜質，對基質復雜的動物源食品進行高效的凈化，從而減少雜質的干擾，制得供試品溶液，并配制基質匹配標準溶液，利用液相色譜-串聯質譜法MRM方式同時測定樣品中的殺線威和殺線威肟。FAOCAC規定殺線威與殺線威肟(以殺線威計)在豬肉、雞肉、動物內臟、雞蛋等動物源食品中最大殘留限量(MRL)為0.02mg/kg，本發明方法殺線威與殺線威肟的定量限均為0.001mg/kg，遠低于CAC規定的MRL，具有靈敏度高等優點，且其回收率和重復性也符合要求，即本發明的測定方法是適用于動物源食品中殺線威和殺線威肟殘留量同時測定的有效方法，且簡單易行，在實際生產中具有廣泛的應用性。附圖說明圖1：豬肉殺線威定量標準曲線；圖2：豬肉殺線威肟定量標準曲線；圖3：雞肉殺線威定量標準曲線；圖4：雞肉殺線威肟定量標準曲線；圖5豬肝殺線威定量標準曲線；圖6：豬肝殺威肟定量標準曲線；圖7中a-b為10ng/mL標準溶液中殺線威MRM色譜圖；圖8中a-b為10ng/mL標準溶液中殺線威肟MRM色譜圖；圖9中a-b為豬肉基質空白殺線威MRM色譜圖；圖10中a-b為豬肉基質空白殺線威肟MRM色譜圖；圖11中a-b為豬肉添加0.005mg/kg殺線威MRM色譜圖；圖12中a-b為豬肉添加0.005mg/kg殺線威肟MRM色譜圖；圖13中a-b為雞肉基質空白殺線威MRM色譜圖；圖14中a-b為雞肉基質空白殺線威肟MRM色譜圖；圖15中a-b為雞肉添加0.005mg/kg殺線威MRM色譜圖；圖16中a-b為雞肉添加0.005mg/kg殺線威肟MRM色譜圖；圖17中a-b為豬肝基質空白殺線威MRM色譜圖；圖18中a-b為豬肝基質空白殺線威肟MRM色譜圖；圖19中a-b為豬肝添加0.005mg/kg殺線威MRM色譜圖；圖20中a-b為豬肝添加0.005mg/kg殺線威肟MRM色譜圖。具體實施方式以下對本發明的原理和特征進行描述，所舉實施例只用于解釋本發明，并非用于限定本發明的范圍。實施例1豬肉中殺線威和殺線威肟殘留量的測定(1)樣品前處理①制樣：取待檢測的豬肉樣品約1kg，切成小塊，用搗碎機將樣品充分搗碎混勻，制成勻漿，裝入潔凈容器，密封，標明標記。將試樣保存在－18℃。②提取：樣品充分解凍，稱取豬肉樣品5g(精確至0.01g)至50mL離心管中，加入20mL乙腈，5g無水硫酸鈉，15000rpm高速勻漿2min，再用10mL乙腈洗滌刀頭1min，獲得勻漿后混合物和洗滌液；將勻漿后混合物于4000rpm離心10min，收集上清液至100mL蒸餾瓶，殘留物中加入洗滌刀頭的洗滌液，渦旋混合提取2min，4000rpm離心10min，收集上清液，合并兩次上清液至100mL蒸餾瓶，于40℃旋轉蒸發至近干；加3mL甲醇-二氯甲烷溶液(體積比為5/95)至蒸餾瓶中，渦旋溶解殘留物，待凈化。③凈化：用5mL甲醇-二氯甲烷溶液(體積比為5/95)淋洗活化PSA(乙二胺-N-丙基)SPE小柱，棄去淋洗液；將待凈化的樣品溶液加到小柱中過柱，用4mL甲醇-二氯甲烷溶液(體積比為5/95)潤洗蒸餾瓶并將潤洗液過柱，再用4mL甲醇-二氯甲烷溶液(體積比為5/95)重復潤洗一次并將第二次的潤洗液過柱，控制流速不超過1mL/min；用50mL蒸餾瓶收集所有流出的樣品溶液和洗脫液，于35℃旋轉蒸發至蒸干；加入1mL甲醇-水(體積比為20/80)溶液，渦旋，充分溶解殘渣；將混合溶液轉移至1mL離心管中，于4℃以13000rpm離心10min，取上清液過0.22μm聚四氟乙烯(PTFE)濾膜至樣品瓶中，供液相色譜-質譜/質譜儀測定。(2)標準溶液及空白溶液的配制①標準儲備液配制：稱取殺線威、殺線威肟標準品各0.01g(精確至0.0001g)，分別用甲醇溶解定容至不同的10mL容量瓶中，得到濃度為1.0mg/mL的單標儲備溶液，保存于－18℃。②中間標準混合溶液配制：取單標儲備溶液適量，用甲醇配制成10μg/mL的中間標準混合溶液。③標準工作溶液配置：用甲醇將10μg/mL的中間標準混合溶液稀釋至適當濃度，再以甲醇-水(體積比為20/80)溶液為溶劑配制成5ng/mL、10ng/mL、25ng/mL、50ng/mL和100ng/mL的標準工作液。10ng/mL殺線威與殺線威肟標準溶液MRM色譜圖見圖7～8。④基質匹配標準溶液的配制：稱取5份樣品(樣品已預先確認不含有殺線威與殺線威肟)，按照步驟(1)進行前處理與凈化，于35℃旋轉蒸發至蒸干，加入配制好的系列標準工作液各1mL，渦旋充分溶解殘渣；將混合溶液轉移至1mL離心管中，于4℃以13000rpm離心10min，取上清液過0.22μm濾膜至樣品瓶中，得到5ng/mL、10ng/mL、25ng/mL、50ng/mL和100ng/mL的基質匹配標準溶液。⑤豬肉基質空白溶液：取不含殺線威和殺線威肟的豬肉樣品，按照步驟(1)進行前處理與凈化得到豬肉基質空白溶液。豬肉基質空白溶液MRM色譜圖見圖9～10。(3)液相色譜-質譜/質譜法(HPLC-MS/MS)測定將系列豬肉基質匹配標準溶液、豬肉基質空白溶液和樣品溶液分別注入HPLC-MS/MS進行測定，建立基質匹配校正曲線，外標法定量。色譜條件為：色譜柱:ACQUITY_UPLCTMBEH，C18柱，2.1*50mm,1.7um；柱溫:30℃；進樣量:3μL；流動相采用梯度洗脫方式，見表5：表5流動相梯度洗脫方式表5中的甲酸水溶液體積濃度為0.1％；質譜條件為：電離方式：電噴霧電離，正離子掃描(ESI+)；檢測方式：多反應檢測(MRM)，MRM監測離子見表6；電噴霧電壓(IS):5000V，離子源溫度(TEM):550℃，碰撞氣(CAD)：medium，簾氣壓力(CUR)：25psi，霧化器(GS1)：55psi，輔助加熱器(GS2)：55psi；表6MRM監測離子注：帶*離子表示定量離子得到的校正曲線如表7、圖1、圖2所示：表7殺線威和殺線威肟在豬肉中的基質匹配校正曲線(4)加標回收率和重復性在不含殺線威和殺線威肟的豬肉中加入0.001mg/kg、0.005mg/kg和0.02mg/kg三個水平的殺線威與殺線威標準溶液，室溫靜置30min后按照步驟(1)進行前處理。其中，豬肉中添加0.005mg/kg殺線威的MRM色譜圖見圖11，豬肉中添加0.005mg/kg殺線威肟的MRM色譜圖見圖12；每個添加水平重復5次，結果見表8：表8殺線威和殺線威肟在豬肉中添加回收結果(n＝5)表8表明，0.001mg/kg、0.005mg/kg和0.02mg/kg三個加標水平，殺線威的平均回收率范圍為76.8％～90.4％，平均相對標準偏差(RSD)范圍為4.61％～6.48％；殺線威肟的平均回收率范圍為80.6％～89.7％，平均相對標準偏差(RSD)范圍為3.30％～3.70％；表明本實施例方法回收率與重復性均符合要求。(5)靈敏度以實際添加樣品的最低檢測限為檢出限，本實施例中，殺線威和殺線威肟在豬肉中的檢出限均為0.3μg/kg。實施例2雞肉中殺線威和殺線威肟殘留量測定(1)取待檢測雞肉樣品，雞肉樣品前處理方法、標準溶液及空白溶液的配制方法以及測定方法與實施例1一致。雞肉基質空白溶液MRM色譜圖見圖13～14。得到的標準工作曲線如表9、圖3、圖4所示：表9殺線威和殺線威肟在雞肉中的基質匹配校正曲線農藥保留時間/min基質匹配校正曲線相關系數殺線威1.53y＝68255x+2534280.9954殺線威肟1.35y＝71492x+711540.9995(4)加標回收率和重復性在不含殺線威和殺線威肟的雞肉中加入0.001mg/kg、0.005mg/kg和0.02mg/kg三個水平的殺線威與殺線威標準溶液，室溫靜置30min后按照步驟(1)進行前處理。其中，雞肉添加0.005mg/kg殺線威MRM色譜圖見圖15，雞肉添加0.005mg/kg殺線威肟MRM色譜圖見圖16；每個添加水平重復5次，結果見表10：表10殺線威和殺線威肟在雞肉中添加回收結果(n＝5)表10表明，0.001mg/kg、0.005mg/kg和0.02mg/kg三個加標水平，殺線威的平均回收率范圍為84.0％～104％，平均相對標準偏差(RSD)范圍為2.04％～3.35％；殺線威肟的平均回收率范圍為91.1％～94.1％，平均相對標準偏差(RSD)范圍為0.83％～1.80％；表明本實施例方法的回收率與重復性均符合要求。(5)靈敏度以實際添加樣品的最低檢測限為檢出限，本實施例中，殺線威和殺線威肟在雞肉中的檢出限均為0.3μg/kg。實施例3豬肝中殺線威和殺線威肟殘留量的測定(1)豬肝樣品前處理與測定方法與實施例1一致。豬肝基質空白溶液MRM色譜圖見圖17～18，得到的殺線威和殺線威肟在豬肝中的基質匹配標準工作曲線如表11、圖5、圖6所示：表11殺線威和殺線威肟在豬肝中的基質匹配校正曲線(2)加標回收率和重復性在5g不含殺線威和殺線威肟的豬肝樣品中中加入0.001mg/kg、0.005mg/kg和0.02mg/kg三個水平的殺線威與殺線威標準溶液，室溫靜置30min后按照步驟(1)進行前處理。其中，豬肝添加0.005mg/kg殺線威MRM色譜圖見圖19，豬肝添加0.005mg/kg殺線威肟MRM色譜圖見圖20；每個添加水平重復5次，結果見表12：表12殺線威和殺線威肟在豬肝中添加回收結果(n＝5)表12表明，0.001mg/kg、0.005mg/kg和0.02mg/kg三個加標水平，豬肝中殺線威的平均回收率范圍為82.1％～90.5％，平均相對標準偏差(RSD)范圍為3.67％～7.21％；殺線威肟的平均回收率范圍為88.7％～93.0％，平均相對標準偏差(RSD)范圍為0.49％～7.22％。上述結果表明本實施例方法的回收率與重復性均符合要求。(3)靈敏度以實際添加樣品的最低檢測限為檢出限，本實施例中，殺線威和殺線威肟在豬肝中的檢出限均為0.3μg/kg。對比實例SN/T3156-2012方法對豬肉中殺線威和殺線威肟殘留量的測定采用SN/T3156-2012《乳及乳制品中多種氨基甲酸酯類農藥殘留量測定方法液相色譜-串聯質譜法》的方法對豬肉樣品進行前處理和測定。其結果與實施例1對比見表13：表13殺線威和殺線威肟在豬肉中添加回收結果(n＝5)和定量限表13結果表明，實施例1中殺線威和殺線威肟在豬肉中的定量限均為0.001mg/kg，而對比實例中殺線威在豬肉中的定量限為0.01mg/kg，且對比實例中未建立殺線威肟的測定方法。實施例1殺線威在豬肉中添加濃度為0.02mg/kg時，平均回收率為80.7％，相對標準偏差(RSD)為4.61％；對比實例中殺線威在豬肉中添加濃度為0.02mg/kg時，平均回收率為100％，相對標準偏差(RSD)為2.80％。實施例1殺線威在豬肉中添加濃度為0.001mg/kg時，平均回收率為76.8％，相對標準偏差(RSD)為4.62％；對比實例中殺線威在豬肉中添加濃度為0.001mg/kg時，殺線威為未檢出。實施例1殺線威肟在豬肉中添加濃度為0.01mg/kg和0.02mg/kg時，平均回收率分別為80.6％和86.9％，相對標準偏差(RSD)分別為3.70％和3.30％；對比實例則未建立殺線威肟的測定方法。相對于對比實例，實施例1能進行殺線威和殺線威肟的同時測定，能對基質復雜的動物源食品進行高效的凈化從而減少雜質的干擾，而且具有更低的定量限，回收率和重復性也符合要求，表明本發明所建立的方法是適用于動物性食品中殺線威和殺線威肟殘留量同時測定的有效方法。綜上所述，本發明是采用乙腈對動物源樣品進行提取及固相萃取小柱凈化提取物，液相色譜-串聯質譜法MRM方式同時測定殺線威和殺線威肟，從而達到凈化效果良好、方法靈敏度高的目的。以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，并不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內，所做的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明保護的范圍之內。當前第1頁1 2 3