人尿中馬尿酸、甲基馬尿酸及扁桃酸濃度的UPLC?MS/MS檢測方法與流程

本發(fā)明屬于生物分析領(lǐng)域，尤其是涉及一種人尿中馬尿酸、甲基馬尿酸及扁桃酸濃度的UPLC-MS/MS檢測方法。
背景技術(shù)：
：尿中馬尿酸(HA)、甲基馬尿酸(MHA)以及扁桃酸分別是接觸甲苯、二甲苯在人體內(nèi)的代謝產(chǎn)物，是接觸甲苯、二甲苯的生物監(jiān)測指標，在規(guī)定的采樣時間內(nèi)測定它們在尿液中含量的變化，可以反映工人的中毒程度。研究其分析方法，在臨床和職業(yè)病防治方面都有重要的意義。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種操作簡單、檢測效率高、成本低的馬尿酸、甲基馬尿酸及扁桃酸濃度檢測方法，尤其適合對尿液中馬尿酸、甲基馬尿酸及扁桃酸濃度的檢測。本發(fā)明的技術(shù)方案是：人尿中馬尿酸、甲基馬尿酸及扁桃酸濃度的UPLC-MS/MS檢測方法，包括以下步驟：1)樣品的制備取待測尿液樣品于試管或離心管中，加樣1/10倍體積的水，渦旋混勻，加與水等量的濃鹽酸和水3倍質(zhì)量的的氯化鈉，渦旋混勻后，加入樣品量5倍的乙酸乙酯萃取，渦旋混勻1min，15000rpm離心10min，取上清，氮氣吹干，再加100μL的水復(fù)溶，取上清5μL進樣分析。2)UPLC-MS/MS分析：將處理后的樣品用三重四級桿液質(zhì)聯(lián)用儀，在以下條件下進行分析液相條件：流動相：A:0.1％甲酸水溶液B:甲醇流速：0.3ml/min進樣量：5μL柱溫：45℃檢測波長：254nm色譜柱：WatersACQUITYBEHC18,1.7μm,2.1*50mmColumn表1梯度洗脫程序Time/minA％B％095548020610906.19558955質(zhì)譜條件：表2待測成分和內(nèi)標的質(zhì)譜檢測參數(shù)其他質(zhì)譜參數(shù)：毛細管電壓(kV):3.2kV；源溫度(℃):120；脫溶劑氣溫度(℃):350；脫溶劑氣流量(L/Hr):800；氣簾氣流量(L/Hr):50；駐留時間(s)：0.1s3)根據(jù)樣品的峰面積和標準曲線的回歸方程中，計算尿液中馬尿酸、甲基馬尿酸及扁桃酸的濃度。為了取得更好的技術(shù)效果，樣品的處理方法為：取100μL尿液，加10μL水，渦旋混勻后，加10μL濃鹽酸，30mg氯化鈉，渦旋混勻后，加500μL乙酸乙酯萃取，渦旋混勻1min后，15000rpm離心10min，取上清400μL，氮氣吹干，再加100μL的水復(fù)溶，取上清5μL進行樣分析。以上甲基馬尿酸包括2-甲基馬尿酸和3-甲基馬尿酸。以上方法中的步驟(3)標準曲線的制作過程如下：a.標準品處理：取100μL尿液，加10μL標準溶液，渦旋混勻后，加10μL濃鹽酸，30mg氯化鈉，渦旋混勻后，加500μL乙酸乙酯萃取，渦旋混勻1min后，15000rpm離心10min，取上清400μL，氮氣吹干，再加100μL的水復(fù)溶，取上清5μL進行分析，記錄色譜圖；馬尿酸的定量系列濃度為：2，5，20，50，200，500，1000μg/ml，甲基馬尿酸的定量系列濃度為：2，5，20，50，200，500，1000ng/ml，扁桃酸的定量系列濃度為：20，50，200，500，2000，5000，10000ng/ml。b.標準曲線的制備以待測物濃度為橫坐標，待測物的峰面積比值為縱坐標，用加權(quán)(W＝1/x2)最小二乘法進行回歸運算，求得的直線回歸方程，即為定量標準曲線。為了取得更好的技術(shù)效果，人尿中馬尿酸、甲基馬尿酸及扁桃酸濃度的UPLC-MS/MS檢測方法中還包括質(zhì)控品的檢測和基質(zhì)效應(yīng)的檢測。質(zhì)控樣品的制備取100μL尿液，加10μL標準溶液，渦旋混勻后，加10μL濃鹽酸，30μL氯化鈉，渦旋混勻后，加500μL乙酸乙酯萃取，渦旋混勻1min后，15000rpm離心10min，取上清400μL，氮氣吹干，再加100μL的水復(fù)溶，取上清5μL進行樣分析。馬尿酸的質(zhì)控樣品濃度為：5，50，800μg/ml，甲基馬尿酸的質(zhì)控樣品濃度為：5，50，800ng/ml，扁桃酸的質(zhì)控樣品濃度為：50，500，8000ng/ml。馬尿酸、甲基馬尿酸及扁桃酸的出峰時間及檢測方式：具體見表3。表3待測化合物出峰時間及檢測方式檢測樣品RT(min)檢測方式扁桃酸2.60質(zhì)譜MRM馬尿酸2.92UV(254nm)2-甲基馬尿酸3.86質(zhì)譜MRM3-甲基馬尿酸5.07質(zhì)譜MRM在UPLC-MS分析時，按照常規(guī)方法繪制馬尿酸、甲基馬尿酸及扁桃酸，根據(jù)其標準曲線可以確定4種馬尿酸、甲基馬尿酸及扁桃酸線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限，具體見表4。表4UPLC-MS/MS測定馬尿酸、甲基馬尿酸及扁桃酸的線性方程，相關(guān)系數(shù)，檢出限LOD和定量限LOQ本發(fā)明具有的優(yōu)點和積極效果是：UPLC-MS/MS檢測方法檢測人尿中馬尿酸、甲基馬尿酸及扁桃酸濃度，簡單快捷，靈敏度高，抗干擾能力強，適合檢測多種食物或意外甲苯、二甲苯中毒的情況。附圖說明圖1是本發(fā)明的四種對羥基苯甲酸酯類的標準曲線圖(A:扁桃酸；B:馬尿酸；C:2-甲基馬尿酸；D:3-甲基馬尿酸)。圖2是標線中的混合標準品色譜圖(A:扁桃酸；B:馬尿酸；C:2-甲基馬尿酸；D:3-甲基馬尿酸)具體實施方式實施例1分別取3份100μL的尿液，命名為樣品1、樣品2、樣品3。(1)a.標準品處理：取100μL尿液，加10μL標準溶液，渦旋混勻后，加10μL濃鹽酸，30mg氯化鈉，渦旋混勻后，加500μL乙酸乙酯萃取，渦旋混勻1min后，15000rpm離心10min，取上清400μL，氮氣吹干，再加100μL的水復(fù)溶，取上清5μL進行分析，記錄色譜圖；馬尿酸的定量系列濃度為：2，5，20，50，200，500，1000μg/ml，甲基馬尿酸的定量系列濃度為：2，5，20，50，200，500，1000ng/ml，扁桃酸的定量系列濃度為：20，50，200，500，2000，5000，10000ng/ml。b.標準曲線的制備以待測物濃度為橫坐標，待測物的峰面積比值為縱坐標，用加權(quán)(W＝1/x2)最小二乘法進行回歸運算，求得的直線回歸方程，即為定量標準曲線，見圖1。圖2是標線中的混合標準品的色譜圖。(2)按以下相同的處理方法3份樣品：加10μL水，渦旋混勻后，加10μL濃鹽酸，30mg氯化鈉，渦旋混勻后，加500μL乙酸乙酯萃取，渦旋混勻1min后，15000rpm離心10min，取上清400μL，氮氣吹干，再加100μL的水復(fù)溶，取上清5μL進行樣分析。按照
發(fā)明內(nèi)容中的條件對2中樣品的馬尿酸、2-甲基馬尿酸、3-甲基馬尿酸和扁桃酸的上樣檢測，根據(jù)圖1的標準曲線和表4中的線性范圍計算各成分的含量，結(jié)果見表5。表5尿液樣品中各成分含量測定實施例22.1回收率檢測取100μL空白尿液，加10μL水，渦旋混勻后，加10μL濃鹽酸，30mg氯化鈉，渦旋混勻后，加500μL乙酸乙酯萃取，渦旋混勻1min后，15000rpm離心10min，取上清400μL，氮氣吹干，再加入適量工作溶液，配制成低、中、高三個濃度的100μL的溶液(即同上述質(zhì)控樣品中各化合物對應(yīng)的濃度)，平行配置6份，取5μL進樣分析。用水配制低、中、高三個濃度的工作溶液(即同
發(fā)明內(nèi)容中質(zhì)控樣品中各化合物對應(yīng)的濃度)，平行配置6份，取5μL進樣分析。結(jié)果見表6。2.2基質(zhì)效應(yīng)檢測取100μL空白尿液，加10μL標準溶液，渦旋混勻后，加10μL濃鹽酸，30mg氯化鈉，渦旋混勻后，加500μL乙酸乙酯萃取，渦旋混勻1min后，15000rpm離心10min，取上清400μL，氮氣吹干，再加100μL的水復(fù)溶，取上清5μL進行樣分析。另外，用水配制低、中、高三個濃度的工作溶液(即同
發(fā)明內(nèi)容中質(zhì)控樣品中各化合物對應(yīng)的濃度)，取5μL進行樣分析?；|(zhì)效應(yīng)樣品的制備：取90μL水，加10μL標準溶液，渦旋混勻后，取上清5μL進行樣分析。馬尿酸的基質(zhì)效應(yīng)濃度點為：5，50，800μg/ml，甲基馬尿酸的基質(zhì)效應(yīng)濃度點為：5，50，800ng/ml，扁桃酸的基質(zhì)效應(yīng)濃度點為：50，500，8000ng/ml。結(jié)果見表7。表7液液萃取試驗方法的基質(zhì)效應(yīng)以上對本發(fā)明的一個實施例進行了詳細說明，但所述內(nèi)容僅為本發(fā)明的較佳實施例，不能被認為用于限定本發(fā)明的實施范圍。凡依本發(fā)明申請范圍所作的均等變化與改進等，均應(yīng)仍歸屬于本發(fā)明的專利涵蓋范圍之內(nèi)。當前第1頁1 2 3